前言
血液系统是维持机体生命活动重要的系统之一，为机体提供氧气和营养物质，通过物质交换维持内环境的稳态，同时提供免疫防御与保护。血液系统包含红系细胞、髓系细胞以及淋系细胞等多种成熟血细胞，而这些血细胞均由造血过程产生。造血过程是造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)及各类血细胞产生、分化及发育成熟的过程，开始于胚胎发育早期并贯穿整个生命过程。
血液病是原发于血液系统，或影响造血系统伴发血液异常的一类疾病。血液病种类繁多，且多数为难治性或恶性疾患，近年来发病率有逐渐增高的趋势，其中白血病的发病率和死亡率更是居于我国恶性肿瘤前10位。因此，针对疾病临床需求深入开展基础研究，解析疾病发病机制具有重要意义。
应用模式动物，针对关键致病因子构建疾病模型，对于人类疾病机制研究、治疗及药物评价至关重要。斑马鱼造血过程及调控机制与哺乳动物高度保守，结合体外受精、早期胚胎透明、丰富的转基因鱼系等独特优势，斑马鱼已成为造血发育以及人类疾病研究的常用模式动物之一。在斑马鱼体内模拟致病因子异常变化构建相关血液疾病模型，可用于肿瘤发生发展可视化研究及高通量化学筛选。以下为大家系统的总结了斑马鱼模型在血液疾病研究中的应用。
1.斑马鱼血液疾病模型
骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPNs）
可分为3个亚型：真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF），这些亚型均伴有血栓形成和出血等疾病相关并发症。JAK2、MPL、CALR或CSF3R等基因的突变常见于MPNs患者。尽管存在治疗策略，但对JAK2抑制剂等药物的耐药性仍然是一个巨大的挑战。
在人类MPNs患者中JAK2基因的功能突变（V617F）是最为常见的。为了在斑马鱼身上建立这种疾病的模型，通过位点定向诱变成功构建了人类JAK2v617f的同源物。突变体与人类真性红细胞增多症具有高度相似性，主要表现为红细胞增多。另一种常见的突变基因为CALR，它编码内质网伴侣蛋白。通过mRNA注射在斑马鱼胚胎表达突变的人类CALR基因，可以导致血小板生成增加，类似于ET患者中观察到的表型。这两个品系都为筛选靶向Janus激酶/信号转导与转录激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK/STAT）信号通路的治疗药物提供了可靠的模型。
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）
该病是成人最常见的急性白血病，是一个具有高度异质性的疾病群，其特征是白血病母细胞在骨髓、外周血等器官不受控制的增殖和积聚。常发生在老年人，并且在临床过程中出现进行性现象。AML治疗的主要障碍是初期诱导治疗的难度大，同时在缓解后复发的现象也非常常见。
最早的 AML模型是在斑马鱼胚胎中短暂表达人融合癌基因，然而这些模型均存在早期致死现象，无法在成体期进行研究。第一个成功的非胚胎致死AML模型是用spi1启动子驱动MYST3-NCOA2融合基因表达，该模型中髓系前体细胞广泛侵袭斑马鱼肾脏，然而AML发病率低、潜伏期长。在时间上控制致癌基因的表达可以有效解决胚胎死亡问题。
在斑马鱼胚胎中热激处理诱导 AML1-ETO融合基因表达可模拟人AML部分症状，机制研究表明AML1-ETO通过scl影响红-髓系祖细胞分化，促进粒细胞产生。应用转基因鱼系Tg(spi1-loxP-EGFP-loxP-NUP98-HOXA9)与 Tg (hsp70：Cre)杂交，可以特异性地在髓系细胞中诱导致癌基因表达。胚胎期过表达NHA9可干扰早期造血发育，导致髓系前体占优势；而在成体期过表达NHA9可导致23%的转基因鱼在19~23个月时出现骨髓增殖性肿瘤(myeloprolifera tive neoplasms, MPN)。
利用此模型，加拿大戴尔豪斯大学Jason Berma 团队发现DNA甲基转移酶抑制剂与组蛋白去乙酰化酶抑制剂结合可恢复NHA9过表达胚胎的正常血液发育，该发现揭示了NHA9与表观遗传调控之间的联系，展示了协同药物组合在NHA9诱导的髓系疾病中的治疗潜力。
急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）
这是一种影响儿童和成人的淋巴祖细胞的恶性肿瘤性疾病，可分为急性T淋巴细胞白血病和急性B淋巴细胞白血病。近40年来，对儿童ALL的基础和临床研究取得了巨大成就。目前存在着联合药物化疗方案，儿童的治愈率可>90%，成人为40%。
急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）的特征是未成熟的T细胞祖细胞异常增殖，在儿童ALL病例中占15%，在成人ALL病例中占25%。许多急性T淋巴细胞白血病病例中，Myc表达上调。Langenau等使用特异性的淋巴细胞启动子rag2来驱动癌基因c-Myc表达，首先构建了斑马鱼急性T淋巴细胞白血病模型。c-Myc是常用的致癌基因，将其与淋巴细胞启动子rag2融合表达已经成功构建了多个急性T淋巴细胞白血病疾病模型。这些斑马鱼疾病模型和哺乳动物之间具有很高的相似性，使得进一步研究白血病转化机制成为可能。
急性B淋巴细胞白血病是一种由未成熟B细胞前体异常增殖引起的血液恶性肿瘤，在人类ALL病例中约占75%。目前已报道一种前B细胞急性淋巴细胞白血病疾病模型，它是通过融合癌基因TEL-AML1整体表达来诱导疾病产生。然而，该模型还有白血病发病率低、潜伏期长等缺陷，表明诱发白血病可能还需要其他基因的突变。
Diamond-Blackfan综合征（DiamondBlackfan syndrome, DBA）
为遗传性疾病，仅不足10%患者有家族史，其余多数患者呈散发性。患者的主要特征是通常在1岁前出现红细胞发育不良，同时还伴有各种体型异常，如骨骼变形和身材矮小。超过50%的DBA患者携带编码核糖体蛋白基因的突变。Danilova等通过MO敲低rps19，构建出了DBA的第1个斑马鱼模型。此外，其他的核糖体蛋白功能缺失也能引起DBA，如rps14、rpl11、rps29。这些基因最初是通过MO敲低构建了模型，后来通过转录激活因子样效物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）建立了稳定的转基因斑马鱼系。
此外，斑马鱼还可应用于骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）、重症先天性中性粒细胞减少症（severe congenital neutropenia, SCN）、Shwachman综合征（Shwachman syndrome, SDS）、遗传性贫血等血液相关疾病的研究，随着基因敲除技术的出现和发展，疾病模型的数量正在增加，性能也更加稳定。以上研究皆表明，可以利用斑马鱼作为研究人类病因复杂血液疾病的理想模型。
2.移植评价
应用斑马鱼进行血液肿瘤细胞移植可以用来定义和量化白血病增殖细胞以及探究其启动白血病的潜能。斑马鱼的移植评价实验具有诸多优势：使用受精后4周内的斑马鱼胚胎进行移植不需要免疫抑制，因为该时期斑马鱼缺乏成熟的适应性免疫系统；透明的胚胎或成体鱼Casper与多种荧光转基因品系相结合，促进了活体成像技术在肿瘤发生发展研究中的应用。
斑马鱼移植受体的免疫系统可被地塞米松或γ射线短暂抑制，却无法进行长期移植；且仅可用于同源移植，限制了移植模型的广泛应用。为了解决这些问题，美国哈佛大学 David Langenau 团队构建了免疫缺陷斑马鱼模型—rag2E450fs突变体。该突变体中功能性T细胞和B细胞数量减少，但仍能存活和繁殖，并且可进行多种组织与癌细胞长期稳定移植。但是该模型纯合子斑马鱼不能繁殖，以及个体间B细胞缺陷差异极大，可能影响植入潜能。
免疫缺陷斑马鱼模型 jak3P369fs突变体和prkdcD3612fs突变体，分别导致T细胞与NK细胞、成熟T细胞和B细胞的缺失，两种突变体均具有植入能力，但只有prkdc纯合突变体可以繁殖，并且在细胞移植后存活。斑马鱼prkdc–/–，il2rg–/–双突变体中T细胞、B细胞和NK 细胞缺陷，David Langenau 团队应用该免疫缺陷突变体建立并评估了肿瘤移植模型，能够重现多种病人来源的肿瘤生长迁移等情况，并可在单细胞水平进行活体实时研究。
3.药物筛选
斑马鱼模型是进行高通量药物筛选的理想选择，主要基于两个优点：(1)整体动物模型，可以针对特定生物学事件发现活性化合物和药物靶标；(2)全面评估化合物的活性和副作用，排除具有明显毒副作用的化合物，缩短药物研发周期。
美国犹他大学 Nikolaus Trede 团队应用淋系转基因斑马鱼进行药物筛选，确定小分子化合物 Lenaldekar(LDK)可以有效消除不成熟的T细胞而不影响正常细胞的细胞周期，且可延长大部分T-ALL成鱼的生存期。同时对于直接取自临床原发性白血病（包括难治性B-ALL和慢性粒细胞白血病）患者的样本，LDK可以杀死其中大部分的白血病细胞。这项工作证明了使用斑马鱼筛选抗肿瘤药物的实用性，同时LDK的发现也为白血病靶向治疗提供了新方向。
接受异种移植的斑马鱼也是药物筛选的一个重要模型。将人类白血病细胞移植到斑马鱼胚胎中用于筛选非致畸的白血病治疗药物，结果显示伊马替尼和奥沙福林可消除白血病细胞，且对受体胚胎无毒性；而全反式维甲酸和4EGI-1表现出致畸作用，不能作为抗白血病药物。
结语
斑马鱼和哺乳动物的血液系统是高度保守的，在斑马鱼中的研究成果有可能适用于人类。斑马鱼的高繁殖力，体外胚胎产生、发育以及胚胎和幼体的透明性，为斑马鱼的非侵入性体内分析提供便利，使多种遗传和药物筛选方法的应用成为可能，并可以帮助我们理解疾病病理生理学、基因型和表型相关性，并最终发现新的治疗靶点和模式。总之，斑马鱼具有其独特的优势，可以与哺乳动物模型互补，帮助我们进一步理解正常造血和血液疾病，并有望极大地促进新药物的发现。
以上内容参考自《遗传》杂志发表的郭佳妮、刘帆、王璐题为”斑马鱼血液疾病模型及应用”的论文；《发育医学电子杂志》发表的明邦发、王欢、陈柳蓉、贾海波、王雅琴题为”斑马鱼血液疾病模型”的论文。
