杂志：Disease Models & Mechanisms

影响因子：5.1（近5年）

年份：2018

通讯作者：saulius.sumanas@cchmc.org

通讯作者单位：辛辛那提儿童医院医学中心发育生物学部，辛辛那提，45229，美国。

摘要

背景：胶原XXII (COL22A1)是一种数量较少的胶原，属于具有中断三螺旋的原纤维相关胶原家族。对其生物学功能的了解甚少。

方法：在这里，我们使用基因组编辑方法在斑马鱼col22a1中产生了一个功能缺失的突变体。纯合子突变的成年斑马鱼颅内出血的发生率增加，随着年龄的增长和心血管压力的增加，颅内出血的发生率会变得更加突出。纯合子col22a1突变胚胎对心血管应激表现出更高的敏感性，血管通透性增加，导致胚胎颅内出血的比例更高。突变胚胎还表现出颅内血管扩张和不规则结构。为了测试COL22A1是否与人类血管疾病相关，我们分析了先前一项研究的数据，该研究对来自7个颅内动脉瘤家族的45名个体进行了全外显子组测序。

结果：鉴定出rs142175725单核苷酸多态性，该多态性与表型分离在其中一个家族的所有4个受影响个体中，并影响CoL22A1蛋白中高度保守的E736残基，导致E736D替代。人类野生型COL22A1的过表达，而不是E736D的过表达，部分地挽救了斑马鱼胚胎中COL22A1功能缺失突变的表型。我们的数据进一步表明，E736D突变干扰COL22A1蛋白分泌，可能导致内质网应激。

结论：总之，这些结果表明COL22A1是维持血管完整性所必需的。这些数据进一步表明，COL22A1突变可能是人类颅内动脉瘤的危险因素之一。

关键词：颅内动脉瘤；胶原蛋白；斑马鱼；血管完整性

前言

胶原蛋白包括一个大家族的细胞外基质蛋白，它在所有器官的组织完整性中起着关键作用。人类至少有28种不同的胶原蛋白类型。纤维状胶原是纤维胶原是由三种多肽链组成的三聚体分子包含序列重复Gly-X-Y并形成三螺旋。主要的纤维性胶原，如胶原I，分布广泛，存在于多种间充质结缔组织中，包括骨、软骨、肌腱等。原纤维相关的三螺旋中断胶原(FACIT)家族胶原包括数量较少的胶原，它们通常与主要胶原共聚成上层结构，并介导原纤维与其环境之间的配体相互作用。FACIT蛋白参与调节细胞外基质(ECM)及其纤维性胶原网络的完整性和稳定性。胶原蛋白XXII (COL22AI)是最近发现的属于FACIT家族的胶原蛋白之一。它包含一个n端假性血友病因子样结构域，随后是一个凝血蛋白n端结构域和一个长胶原结构域，其中有几个Gly-X-Y重复序列的中断。已知COL22Al集中在肌肉、肌腱、心脏、关节软骨和皮肤的组织连接处。它沉积在肌腱连接处的基底膜上，并被证明与软骨中的纤维外基质有关。有报道称，斑马鱼胚胎中col22al morpholino敲低会破坏肌腱连接处并诱发肌肉萎缩。然而，morpholinos容易产生脱靶效应。迄今为止，还没有在任何脊椎动物有机体中分析Col22al基因突变的报道。因此，人们对该蛋白的生物学作用仍然知之甚少。

除了在结缔组织的结构完整性中发挥主要作用外，胶原蛋白还是血管壁内ECM的主要成分。血管壁包含内皮下基底膜、内膜、中膜、外膜和间质基质层。这些层中的每一层都含有多种类型的胶原蛋白，这些胶原蛋白对血管的稳定性和结构完整性至关重要。IV型胶原是基底膜的主要成分，人类CoL4Al的突变与多种综合征有关，包括颅内动脉瘤和脑出血。纤维性胶原I、III和V的突变与埃勒斯-当洛斯综合征有关，并可导致动脉破裂和动脉瘤。然而，FACIT胶原在维持血管稳定性方面的作用目前尚不清楚，Col22al此前也未被证实与血管完整性有关。

颅内浆果动脉瘤;IAs是颅内主要动脉壁上的小浆果状或球囊状缺陷。蛛网膜下腔出血(SAH)占脑卒中病例的7%，但死亡率很高。最重要的是，30%的SAH患者在一个月内死亡。SAH是由内腔破裂引起的，然后会损伤脑实质。除了破裂的IAs外，据估计，0.5-2.0%的普通人群中会发生未破裂的IAs，这会增加个体发生SAH的风险。目前，遗传和环境因素都与卒中易感性有关。

先前的全基因组关联研究(GWAS)鉴定了EDNRA、SOXI7、CDKN2BAS/ANRIL、CNNM2、KL/STARD13和RBBP8与IAs风险增加相关。为了确定导致IA易感性的其他风险因素，对七个有多个IAs患者的家庭进行了全外显子组测序(WES) 。数据显示了易感的候选基因座，尽管CoL22A1在原始研究中没有报道。

斑马鱼已成为研究血管发育和功能的有利模型系统。透明胚胎经历外部发育，易于进行实验观察和操作。调控血管发育和稳定性的分子机制在包括斑马鱼和人类在内的多种脊椎动物之间高度保守。因此，斑马鱼被广泛用于模拟和研究人类多种心血管疾病，包括出血性中风。

本研究采用斑马鱼模型系统研究Col22al的功能作用。通过利用col22al中的斑马鱼基因突变体。我们发现Col22al在促进血管稳定方面起着重要作用。此外，我们重新分析了家族性IAs WES研究的原始数据，并在其中一个家族的所有受影响个体中发现了rs142175725 SNP，预计该SNP会导致COL22A1蛋白序列中的E736D替换。我们证明，E736D在斑马鱼胚胎中过度表达时，会干扰COL22Al功能并导致出血。我们的研究结果确定了Col22al在维持血管稳定性方面的新作用，并表明COL22Al的突变可能是颅内动脉瘤的原因之一。

材料和方法

实验中使用的斑马鱼系如下:Tg(flila:EGFPP)、Tg(kdrl:GFPys4s、Tg(acta2:EGFP、Tg(sox10(7.2):mRFP)、TgBAC(pdgfrb:EGFP)和AB WT(斑马鱼国际资源中心)。胚胎按照文中所述在28.5°C或33.5°C下孵育，并使用先前描述的标准进行分期。超过24 hrt的胚胎用0.003%的1-苯基-2-硫脲(PTU)处理，以抑制色素的形成。成年斑马鱼被安置在一个循环系统(Pentair)中。这些鱼是按照机构动物护理和使用委员会批准的方案饲养的。

构建TALEN突变col22a1

我们使用TALENs产生col22a1ci16突变，该突变携带外显子2的5个核苷酸缺失(ENSDARG00000078899,Zv9)。使用Golden Gate TALEN试剂盒组装TALEN构建体，对应于以下序列:TAL-L,NH NI NG HD NG NH NH NH NG NI NG NG HD NI NG NG NG NG NG NH;TAL-R,hd ni ni ni ng ng hd Ng hd hd Ng Ng nh hd hd这些二聚体识别间隔片段(大写)内的目标col22a1序列(斜体)。TGATCTGGTATTCATTTTGgacacctcttcaagtgTGGGCAAGGAGAATTTTGA。利用PCR引物(补充信息)和EarI限制性内切酶进行基因分型以区分突变型条带和野生型条带。

细胞系使用和转染

人原代肺成纤维细胞CCD-19 Lu[美国型培养集合CCL-210;来自辛辛那提儿童医院医疗中心(CCHMC)，辛辛那提，OH, usa的Timothy LeCras博士的礼物保存在37°C和5% CO2的加湿培养箱中。细胞孵育过夜，直到它们达到80-90%的融合度。然后用0.25%胰蛋白酶/EDTA处理细胞，用1%明胶将细胞接种于带微卡的12孔板中。当它们达到S0-70%的合流性时。根据描述的方案(Themo Fisher Scientific, 116688027)，用脂质体进行短暂变性。

WISH和HCR

从Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific)获得了pExpress-l中斑马鱼col22部分序列对应的互补DNA (cDNA)克隆。使用SP6 RNA聚合酶(Promega, P407Al)从ecorv线性化的col22al- pexpress -1中生成地高辛标记的col22al核糖核酸探针。pdgfrb探针的生成如前所述(该构建物由Appel实验室慷慨捐赠)。如前所述(Jowett, 1999)，将胚胎用4%多聚甲醛(PFA: Electron Microscopy Sciences, 15714)洗涤，然后用PBS+0.1% Tween 20 (PBST)洗涤。胚胎在RIMS清除试剂中孵育1小时(30 g Histodenz在40 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液中加入50 ul Tween 20和10 mg叠氮化钠)，然后用PBsT广泛洗涤。处理后的胚胎在100%甲醇中脱水，在-20°C下保存，以提高对比度，然后在1倍PBS中再水化，并在盖盖下装在3%甲基纤维素中进行成像。使用蔡司M2BioV12立体显微镜拍摄图像。

按照描述对col22al和colal共表达进行HCR(版本3)。HCR探针是由加州理工学院贝克曼研究所的分子技术合成的。美国加州帕萨迪纳市。为了进行kdrl:GFP的共表达和col22分析，将GFP阳性胚胎固定在3 dpf处。随后，使用col22 HCR探针对其进行处理。HCR后仍可见GFP荧光。使用尼康Al共聚焦显微镜和CCHMC共聚焦成像芯对胚胎进行成像。

免疫化学

使用以下一抗:斑马鱼抗col22al (1:20 00;F. Ruggiero捐赠)，山羊抗人COL22A1(胚胎组织1:50，成纤维细胞N17 1:20 00;Santa Cruz Biotechnology, sc87647)，兔抗层粘连蛋白(1:100;Sigma-Aldrich, L9393)，小鼠抗—微管蛋白牛(1:400:Life Technologies, A11126)，小鼠抗vimentin (1:50;Thermo Fisher Scientific, MA5-11883)，能够识别RFP的兔子anti-DsRed (1:100;Takara, Living Colors, 632496)，Alexa Fluor 488 Phalloidin (Thermo Fisher Scientific, A12379)，小鼠抗krti8 (1:27;Abgent, AT2655a)，家兔抗gfp (1:20 00;Life Technologies A21311)， Alexa Fluor抗兔594 (1:20 00;Life Technologies，R37117)， Alexa Fluor抗山羊488 (1:20 00;Life Technologies, Al1055)和Alexa Fluor抗小鼠488 (1:20 00;Life Technologies, A11001)，使用延长金刚石Antifade mount培养基分析Tubulin染色;采用VectaShield 4′，6-diamidino-2phenvlindole (DAPI)挂载培养基分析层粘连蛋白染色。使用斐济 (ImageJ)软件(美国国立卫生研究院)对WT胚胎和Col22al突变体的Col22al免疫荧光染色图像进行量化。在肌隔区域随机选择的五个点的荧光强度的平均值用斐济计算，然后进行背景减法。WT胚与col22突变体的相对荧光强度比为20.3:1。

切片的WISH/免疫荧光

将wish处理的胚胎固定在4% PFA中30分钟，并用PBST洗涤，然后按照前面描述的方法进行包埋。使用Microm HM 550 crvostat冷冻胚胎。将载玻片风干2小时或过夜。然后将载玻片在100%乙醇中脱水5分钟，然后风干5分钟。切片用PBS再水化2次，每次5分钟。然后用PBST洗涤5分钟，然后用阻断液(1%牛血清白蛋白在PBST中)洗涤1小时。载玻片在含一抗的阻断液中在4°C下孵育过夜。然后将含二抗的阻断溶液在室温下作用于载玻片2小时。在CCHMC共聚焦成像核心设施使用尼康共聚焦AlRsi倒置显微镜(40倍物镜)捕获图像。如前所述，对NBT/ BCIP底物荧光进行共聚焦成像。

TEM

为了进行TEM分析，将斑马鱼幼鱼在100 mM乙酸盐缓冲液中固定在2.5%新鲜戊二醛中，在4°C下过夜。然后将幼鱼用代谢酸缓冲液洗涤，后用1%的单宁酸固定。然后将它们转移到1%的四氧化锇中，然后在丙酮系列脱水后，用Embed-812树脂(Electron Miernscony Sciences)包埋。超薄切片(100 nm)被切割，放置在单槽或200目铜网格上，并在JEOL JEM 1010上成像。

斑马鱼成年和胚胎的心血管压力

斑马鱼成年和胚胎的心血管压力对成年混合性WT和col22al TALEN纯合突变体在51号游泳隧道中进行过度强迫游泳运动前没有任何外部出血进行检查(Loligo Systems, SW10050)。游泳速度手动调整为750 V, 5条鱼每天运动2次，每次60分钟，每周5天，持续3周。

ptu处理的胚胎保存在28.5°C。当胚胎达到24hpf时，将其转移到33.5℃培养箱中，连续保存2天。在72 hpf时，按照前面的描述，使用o-Dianisidine对胚胎进行血红素染色处理。

组织学

石蜡块在徕卡RM 2125切片机上切成10 um切片。切片然后在水浴中漂浮，然后放置在棚子上。带切片的玻璃板在6℃下烘烤干燥，然后将切片装上Ventana Svmnhony自动染色机(Ventans Medical Systems, Tucson, AZ, USA)进行苏木精和伊红染色(使用默认设置的标准方案进行H&E染色)。该系统结合了烘烤、脱蜡、染色和盖滑动的过程，产生永久安装和h&e染色的切片，用于组织学显微镜评估。

Microangiography

用10 kDa tritc -葡聚糖(分子探针，Life Technologies, D1817)或荧光微球(荧光分子探针，Invitrogen)将72 hpf或96 hpf的热应激活胚胎注射到卵泡周围空间。F8786)，并被嵌入在低熔点琼脂糖和立即成像使用尼康AIR lunv倒置显微镜与20倍/0.75多浸泡物镜在CCHMC Confoca。成像核心设备，使用斐济软件计算最大强度投影。在两个独立实验中获得的12个突变型和12个野生型胚胎中，使用Fiii软件在每个代表性血管的三个选定点测量血管直径。

人COL22A1 mRNA过表达

包含全长人类COL22AI序列的Gateway入口构建物pENTR223.1从Open Biosystems (Thermo fish: Scientific)获得。利用Gateway克隆方法(Thermo Fisher Scientific)将该构建体亚克隆到pCS2 Dest载体中。使用位点定向突变试剂盒(Agilent Technologies)对pCS2-Dest载体中存在的人类COL22/I编码序列中的E736D突变进行G-to-T替换。COL22AI pCS2-Dest载体与Kpnl线性化，并使用SP6 mMessage mMachine试剂盒(Ambion, AM1340)进行体外转录。在单细胞期，将380 pg WT或突变体E736D mRNA注射到斑马鱼胚胎中。胚胎在胚环上进行记分，在明场成像下进行屏蔽期，或在4% PFA中固定过夜进行免疫荧光。

诱导过表达人COL22A1 WT和E736D突变体构建物的产生

为了制备tol2-hsp70:COL22A1-2A-mCherry, a-crystallin:DsRED-tol2，使用位点特异性Gateway重组技术进行LR反应，构建如下结构:tol2-hsp70:CoL22Al-2A。mCherry，一个带有hsp70启动子(p5E-hsp70)的入口载体;pDONR223 (Invitrogen)中具有attLI和atti位点的全长人类COL22AI基因:带有2A-mCherrypA的3'入口载体;目的载体:pDestTol2p2A, a-crystallin:DsRED。为了制备col22al-His-mye，使用人COL22Ai在pDONR223和pEZHis-mye中进行LR反应(由辛辛那提儿童医院Aaron Zorn博士慷慨提供)。突变体E736D COL22AI构建体以tol2-hsp70:COL22A1-2A-mCherry和COL2241-His-mye构建体为模板，通过Quick Change II XL位点定向突变技术生成。

COL22A1条件过表达式

WT  Tg（hsp70：COL22Al-mCherry8将25 pg tol2-hsp70:COL22A1-mCherry, a-crystallin:DsRED-tol2和25 pg tol2 mRNA注入单细胞期斑马鱼胚胎中，获得Tg(hsp70:E736D col22ai - mchery31)和Tg(hsp70:E736D col22ai - mchery31。通过热休克诱导mCherry或crystin:DsRED表达鉴定转基因胚胎，并将转基因胎和对照胚胎组在28.5°C下培养，24 hpf和48 hpf在37°C下热休克两次1 h，然后返回28.5°C培养并分析是否有出血。筛选创始人是否成功传播mCherry和DsRED。

化学处理MMP抑制剂

GM6001 (Millipore, CC1010)作为2.5 mM的二甲氧基亚砜(DMSO)库存购买。如前所述，瞬时过表达Tg(hsp70:col22almCherry)和稳定的转基因胚胎在24 hpf的胚胎水中用25 μ m GM6001处理。胚胎保存在药物溶液中，直到72 hpf，并分析出血情况。

qPCR

cDNA制备和qPCR按照之前的描述进行(Craig et al.， 2015)。简单地说，将胚胎冷冻在干冰上，并通过22号针进行匀浆。RNA提取使用RNA-水溶液4RT-PCR试剂盒(Life Technologies)。cDNA通过上标Vilo (Invitrogen, 11754-050)获得。在标准条件下使用Power up SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)在StepOne PCR机(Thermo Fisher Scientific)上进行qPCR。使用三个独立的RNA样本进行实验比较，每个基因重复进行qPCR。将bip、hsp5和mmp9的表达水平归一化为efla。采用2-AscT Livak法和Student's -test对数据进行分析。qPCR使用的引物如下:

FIA研究中的测序

WES在遗传疾病研究中心(Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA)对参与FIA研究的7个多重IA家族的45名个体(35名受影响，10名未受影响)进行。根据机构审查委员会批准的方案，在知情同意的情况下收集了用于WEs和靶向测序的患者样本。随后在456个不相关的家族性FIA研究样本中使用多重PCR对COL22A1基因座的外显子特异引物进行了COL22A1基因座的靶向测序。使用Agilent SureSelect XT Custom ELID试剂盒捕获目标区域。采用与WES项目相同的方案进行配对端测序。

图像处理

在Adohe photoshoncss中组装的图像纳米层使用I - level功能对许多纳米层进行非线性热调整，以增加图像的对比度和清晰度。在所有情况下，在对照和实验(突变)胚胎之间进行了类似的调整。

结果

此前已有报道称，斑马鱼胚胎中骨骼肌肌隔和肌腱交界处有col22表达。然而，其在躯干区域外的表达尚未被表征。为了确定颅组织中col22al的表达模式，我们在受精后29 h (hpf)、72 hpf和96 hpf对斑马鱼胚胎进行了全载原位杂交(WISH)(图1)。在29 hpf时，col22al的表达在眼睛周围很明显，从48-96 hpf开始，col22al在大脑内侧区域和眼睛腹侧之间的表达显著增加。这种表达也集中在咽弓和胸鳍中。此外，col22al在29 hpf的骨骼肌和48-96 hpf的肌腱交界处强烈表达，如先前报道。

图1 WISH分析col22a1表达谱。(A- f) 在29 hpf时在腹侧和外侧观察平装胚胎中col22a1的表达(A。B)， 48 hpf (C,D)和96 hpf (E,F)。 在体突肌(箭头，B)和肌腱交界处(箭头，D,F)检测到表达，col22a1在眼睛周围(星号)、耳朵、胸鳍(pf)和咽弓(箭头)也检测到表达。

为了更详细地表征颅组织中col22al表达细胞的特征，我们使用杂交链反应(HCR)方法对col22al和collal (als:称为collala)进行了双色荧光原位杂交(FISH)， col22al和collala在结缔组织和成纤维细胞中表达。在共聚焦切片中，在受精后3天(dpf)的胚胎中，在眼睛周围的结缔组织、颅面肌、副骨、心脏、角状支气管内的软骨细胞以及发育中的耳朵内的角状弓和结缔组织中观察到col22al的表达(图2A-F)。颅面肌和心脏内Col22al的表达与结缔组织的表达不重叠，角鳃弓内Col22al阳性细胞被结缔组织阳性细胞包围。然而，这两种标记物的表达在副蝶骨、耳部组织、眼周结缔组织以及胸舌肌和舌舌肌的肌腱/韧带附着部位重叠。在躯干区域的肌腱连接处，所有表达col22al的细胞也呈collal表达阳性(图2G-I)。为了分析col22al相对于血管的表达，用HCR染色Tg(kdrl:GFP)胚胎，在72 hpf下进行col22al的表达，并用共聚焦显微镜成像。col22al在多根颅血管内皮细胞中的表达是明显的(图2J-L)。为了成像更深的颅骨组织，常规的WISH随后进行血管内皮特异性flila的免疫荧光:GFP表达。头部区域的纵向冷冻切片揭示了col22al在颅血管亚群附近结缔组织的成纤维细胞样细胞内的表达，特别是在眼周区域(图2M-O)。一些扁平的梭状表达col22al的细胞被染色为Krt18阳性(也称为Krt18a.1)，已知在4 dpf时在视神经星形胶质细胞和Muller胶质细胞中表达(图SIA-C)，我们还检测到col22al和Krt18阳性细胞的另一个亚群，其形状呈立方体。此外，许多col22al阳性细胞位于3 dpf处的中间丝蛋白Vimentin附近(图SID-F)。由于颅结缔组织的很大一部分来自神经嵴(Bronner和LeDouarin,d 2012)，我们测试了col22与sox10:RFP的共定位，已知sox10:RFP在神经嵴来源的组织中表达(SimoesCosta和Bronner, 2015)。事实上，col22的表达与sox10:RFP的表达在靠近眼睛的颅组织的一部分细胞中重叠(图s1g-i)，在咽弓的大多数细胞中重叠(图S1J-L)，表明这些细胞来源于神经嵴。综上所述，在血管内皮细胞、咽肌和血管周围成纤维细胞样细胞亚群中观察到col22al在3 dpf和4 dpf处的表达。

图2 采用FISH和FISH/免疫荧光法分析头干区col22a1的表达。(A-1) co/22af(红色)和colfa1(绿色)在3 dpf的表达，通常标记结缔组织。HCR分析表达。在颅组织的横向共聚焦切片(腹侧视图，A-F)中，col22a1在眼周组织(箭头，C)、颅面肌肉(包括舌骨骨突(sh)和舌骨舌突(hh)肌肉)、副骨(Ps)、心脏(h)、角状鳃裂(cb)和角状弓(ch)内推定的软骨细胞以及发育中的耳内结缔组织(耳囊，oc)中表达明显。注意，这两种标记物的表达在副蝶骨、耳部组织、眼周结缔组织(箭头，C)以及胸骨舌骨肌和舌骨舌肌的肌腱/韧带附着部位(箭头，C)重叠。在主干区域的肌腱连接处(G-l)，所有表达col22a1的细胞也都是colfaf表达阳性。请注意，colfaf也标记表皮内的角化细胞。HCR分析(J-L) col22af表达与血管内皮细胞kdrl:GFP表达部分重叠。用共聚焦显微镜对3 dpf全胚的颅血管系统进行背侧成像。前指顶部。所选切片的最大强度投影。(M-O) 72hpf下，用WISH/免疫荧光染色染色col22a1(红色)和血管内皮fi1:GFP(绿色)的胚胎纵向颅骨切片。col22a1在血管周围基质细胞内表达明显(箭头，K)。b，脑;e,眼睛;Ec，内皮细胞。注意，与J-L中col22at的血管表达相比，这些切片位于更腹侧。

最近的几项研究对小鼠脑和血管成体或胚胎组织进行了单细胞分析。我们分析了单细胞图谱(R)获得的数据集中Col22al的表达。Col22al在成年小鼠的血管周成纤维细胞样细胞中表达最高(图S2A,B)，而血管内皮细胞的Col22al表达低得多，但仍然显著。另一项研究在出生后日(P) 2和P11对出生后小鼠脑和脊髓进行了scRNA-seq。在出生后的小鼠中，在合并的脑和脊髓簇中，Col22al的平均表达在一组“血管和软脑膜细胞2”(图S2C)中最高，这些细胞也呈Sle6a13和包括Collal和Colla2在内的多种其他胶原同源物阳性，提示这些细胞可能与Vanlandewijck等(2018)报道的血管周成纤维细胞样细胞相似。Col22al在室管膜和平滑肌细胞中也有显著表达。我们还观察到内皮细胞中的表达较低，但仍显著(图S2C)。这些结果表明，Col22al在斑马鱼和小鼠中均表达于血管周成纤维细胞样细胞以及血管内皮细胞。

Col22a1缺失导致出血

为了评估col22al在体内的功能，我们设计了一对靶向斑马鱼col22al的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)构建体。我们产生了一个缺失5个碱基对的突变系，预计这将导致移码，导致提前终止密码子(图3A.B)。Col22al蛋白的免疫染色显示，在纯合子突变胚胎中，肌间隔处的特异性免疫荧光完全丧失[图3C,D:野生型(WT)和突变胚胎的定量荧光强度比为20.3:1]，提示该突变可能为无效。col22al纯合或杂合突变的胚胎和幼鱼均未见明显表型，可存活至成鱼。部分col22a纯合突变成人发生眼周出血(图3H)。随着年龄的增长，纯合子突变成人发生肉眼出血的百分比增加，而杂合子兄弟姐妹未表现出任何明显的表型。我们观察到，25%的突变型成人在7月龄时出现出血，而60%的突变型成人在2岁时出现出血(图1 3e)。这些数据表明，衰老可能是促进成年鱼疾病进展的一个潜在因素。因此，我们假设，施加强迫的过度心脏超负荷应激会导致突变体在较年轻时出现更频繁的出血表型。我们完成了为期3周的强制快速间歇性游泳运动方案，并分析了眼部可见出血的频率，观察到在之前无明显表型的6月龄纯合子突变体中，67%在运动后出现了眼部血池(图3E-G)。在这些条件下，野生型鱼没有发生出血。

由于心脏应激会导致成年鱼出血，我们推测类似的环境应激也会加剧胚胎的表型。我们采用了之前描述的心血管应激策略，从24 hpf开始，将纯合子和杂合子col22al突变体和野生型胚胎在33.5℃的高温下饲养连续两天。纯合突变胚胎对热应激的敏感性增加，颅内出血的发生率是野生型和杂合型胚胎的2.5倍(图4 a - c)。与杂合或WT胚胎相比，有更多的热应激冷突变胚胎在头部区域、眼睛和躯干表现出血液积累(图4D-F;表S1)。有趣的是，这些出血发生在col22al表达的位置或附近。

图3 Col22af——突变的成鱼表现出出血。(AB)使用TALEN生成col22af斑马鱼突变系。纯合子col22af突变体的Sanger测序数据显示，有一个5 bp的缺失TCTTC(框;右图箭头)导致帧移位(a)和蛋白质序列中的过早终止密码子(B)。(C.D) col22a1和col22af胚胎中3dpf处对斑马鱼Col22at的免疫染色。与col22at -胚胎相比，col22af-突变体(箭头)的肌隔没有染色，这表明该突变可能为零。使用Axiovision软件(蔡司)中的Extended Focus功能合并Z-stack中选定的切片。(E) col22at-f突变体出血的频率随着年龄的增长而增加，而运动导致col22af-突变体在更早的年龄表现出这种表型。(F.G) 6个月大的col22a-成人在3周的间歇性强迫运动后出现明显的眼部积血(黑色箭头，G)，而WT成鱼则没有(F)。(H)没有运动，2岁的col22a1-成鱼也表现出明显的眼部积血(白色箭头)。

图4 在温度升高的情况下，同质杂交的col22at-胚胎显示出出血百分比增加。胚胎用3 dpf的o-Dianisidine染色。(A)异种杂交的col22a1-胚胎显示头部有小的分散的血细胞，而col22a1胚胎的大脑内有明显的大出血(箭头，B)。(C)与WT和col22a1-胚胎相比，col22at-突变胚胎在热应激后出现出血的比例明显更高。“Pc0.005，由卡方检验确定。胚胎数由三个独立实验(两个为col22at-胚胎)组合而成。每个实验的评分数见表S1。(D-F)热应激col22a1-'胚胎不同部位出血(箭头)的例子。

Col22a1缺失破坏血管完整性

为了确定col22a突变体的血管模式是否受到影响，将它们杂交到血管内皮特异性Tg(kdrl: GFP)报告细胞系中。在3 dpf和4 dpf(图5A-D)时，热应激冷突变胚胎的颅骨血管模式没有明显变化。在col22突变体和WT对照胚胎之间，包括中央动脉在内的背侧颅骨血管的直径和大体外观没有显示出任何显著差异(图5A-D，数据未显示)。然而，几个位于较深位置的血管的显著差异是明显的。在WT胚胎中，包括原始后脑通道(PHBC)、初级头窦、原始中脑通道(PMBC)和腭脑静脉(PLV)在内的几条血管在位于两侧分支点的周围融合。这些分支点的脉管系统在col22突变体中严重扩张，单个血管经常出现合并，无法分离(图SE-H)。PLV将血液返回到位于双侧的PMBC和PHBC，具有高度不均匀和畸形的外观，具有多个扩张区域，通常表现出额外的分支或丛状网络(图SE,FIJ)。col22突变体胚胎在该分支点和PLV内的平均血管直径显著增加(图50)，此外，col22突变体的侧背主动脉(LDA)直径增加。

为了分析低温突变体的血管通透性是否受到影响，从1 dpf开始对胚胎进行热应激，并在3 dpf或4 dpf时向循环系统注射10 kDa的四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)-葡聚糖。纯合子col22al突变体显示颅骨血管中微球和四乙基若丹明异硫氰酸盐-葡聚糖渗漏增加(图5K-P)，表明染料外溢是由血管通透性增加引起的。

我们使用透射电子显微镜(TEM)分析了col22al突变体和野生型胚胎的血管内皮结构。根据透射电镜分析，血管内皮细胞 col22a1突变的颅内血管表现出高度不均匀和畸形外观(图5R,S)。

我们通过共聚焦显微镜进一步分析了进入acta2:GFP转基因系的col22突变体的壁细胞(平滑肌和周细胞)覆盖率。在大多数col22al胚胎中，壁细胞中acta2:GFP的表达没有显著变化(图S3A,B)。此外，周细胞标记物pdgfrb的表达在col22al突变胚中未受影响(图S3C-H)。这些结果表明，出血和血管通透性缺陷不是由col22al突变体中壁细胞覆盖不足引起的。总的来说，我们的数据显示Col22al在维持血管稳定性方面起着关键作用。

图5 纯合子col22a1—突变胚胎显示颅骨血管扩张和畸形，血管通透性增加。(A-D) col22af突变体在3dpf和4dpf时血管模式不受影响。活体kdrl共聚焦最大强度投影:GFP胚胎，背面视图。前指顶部。(E-J) col22a1突变体血管扩张和畸形，注意眼周区血管分支点的血管扩张和融合(箭头)，以及扩张和畸形的腭脑静脉(PLV，箭头)。高倍(40*)的PLV图像如图1和J所示。注意，PLV的一部分形成了一个神经丛(箭头，J)，这在WT胚胎中没有观察到。活体kdrl:GFP胚胎切片共聚焦最大强度投影显示，背面视图，前方为顶部。PLV、侧背主动脉(LDA, E)和眼周分支点(星号，G)的横截面在q中标记了选择测量直径的血管。相同胚胎的不同z堆叠投影在E和G中，在F和H中显示;I和J表示不同的胚胎。(K-P)血管通透性微血管造影分析。将FluoSpheres聚苯乙烯微球(红色，K,L)或低Mw (10 kDa) tritc -葡聚糖(红色，M-P)注射到kdrt: gfp阳性WT和col22a1-胚胎的循环系统中。合并图像的背侧视图(红色，葡聚糖/微球;绿色，kdr:GFP)显示在3 dpf和4 dpf时col22af-胚胎脑室和脉络膜丛(虚线，N.P)和血管外微球积聚(虚线，K.L)。共聚焦z堆叠的最大强度投影图。(Q)热应激col22af突变体和野生型(wt)胚胎在3dpf时的LDA血管直径(E)、PLV和眼周分支点(星号，G)。在两个独立实验中获得的12个突变体和野生型胚胎的每个血管的三个随机选择的点进行测量。在可能的情况下，测量左右两侧的LDA和眼周血管。LDA的总测点数n-57 (wt和突变体胚胎的sd分别为-1.9和2.5)。眼周血管的n= 54和57(变异胚的标准差分别为4.3和6.5)，PLV的n=36(变异胚的标准差分别为3.2和5.9)。在所有胚胎的所有测点上，使用wt和col22a1胚胎之间的Student's t检验计算p值。(R,S)颅内血管内皮的TEM分析。与WT胚胎(箭头，R)的正常血管内皮相比，col22af突变体的血管内皮高度畸形(箭头，S)。

家族性颅内动脉瘤(FIA)研究中COL22A1突变体的鉴定

接下来，我们想要研究人类个体中COL22Al的多态性是否与血管稳定性缺陷有关。在最近的FIA研究中，选择了7个家庭和45个欧裔美国人进行WES，以确定与IAs相关的变异。尽管该研究报告了68个通过多种选择标准筛选和优先排序后保留的变异，但在该研究中发现了多个其他被排除在最终列表之外的突变变异。在这些变异中，在一个家族(家族D)的受影响成员的胶原XXII (COL22A1)蛋白编码序列中发现了一个SNP rs142175725 G/T，预计会导致E736D氨基酸替代(图6A)。rs142175725在所有患病家庭成员中的分离度计算为1.11(等位基因频率为0.0001264;次要等位基因频率，6.04×10-5)。看到D家族所有成员携带SNP的随机概率是5.17×10-8。虽然这个LOD评分还不够高，不足以明确地将SNP与IA表型联系起来，但它仍然暗示了一种潜在的关联。突变变体位于三螺旋结构域，该结构域通常与单体胶原亚基的低聚化有关。谷氨酸E736在多个脊椎动物之间100%保守(图6B;图S4)，使用COL22A/位点内外显子特异性引物的多重PCR对460个不相关的家族性FIA样本进行靶向测序，鉴定出仅存在于受影响个体中但未发现的另外6个变体:在ExAC外显子聚集联盟(ExAC)非芬兰欧洲人群中发现的频率非常低(图6B;表S2)。所有这些SNPs在多个哺乳动物生物之间都是100%保守的，其中3个在人类和斑马鱼之间是保守的(图S4，数据未显示)。此外，根据polyphen2分析，所有SNPs都被预测为“可能具有破坏性”，其中4个SNPs被SIFT预测为具有破坏性(表S2)。鉴定出的变体中有两个在Gly-X-Y三螺旋重复序列中具有影响甘氨酸的突变(图S4)。受影响的个体对所有这些变异都是杂合的，这表明这些SNPs可能具有显性效应。这些结果表明，COL22Al突变可能与IAs风险增加有关。然后，我们在斑马鱼模型中实验测试了E736D突变变体是否影响COL22Al功能。

图6 COL22A1 SNP变异的鉴定。(A) rs142175725 SNP预测会导致家族中受影响个体COL22A1分离中的E736D氨基酸替代。(B)预测CoL22A1的蛋白质结构和通过WES和靶向基因组测序鉴定的snp的特定氨基酸位置(红色星号)。WWFA, von Willebrand因子;LamG，层粘连蛋白G。

人E736D COL22A1变异体的可诱导过表达增加出血的发生率

全外显子组测序结果显示4例患者均为E736D杂合变异，符合显性遗传模式。因此，我们在斑马鱼胚胎中进行了一项过表达实验，以检验E736D替换是否表现出显性的有害影响。我们在热休克诱导启动子下将携带突变体或WT人COL22AI与自裂病毒肽2A和mCherry融合的构建体注入单细胞期胚胎(图S5A)。在23 hpf下，对胚胎进行热休克，然后在33.5°C下孵育，诱导热应激2天。对注射的胚胎进行荧光探针筛选，这是人类COL22A1过表达的指示性信号(图S5B,C)，并通过o-二苯胺血红素染色分析出血情况。在WT背景下，诱导过表达人类E736D COL22AI变体导致出血明显更频繁，类似于斑马鱼COL22AI突变胚胎(图7A)。相比之下，与未注射的胚胎相比，诱导人WT COL22AI表达并没有引起胚胎出血百分比的显著增加。

接下来，我们通过测试人类WT COL22Al和E736D突变体挽救热应激col22胚胎中出血表型的能力，评估了它们的功能活性。正如预期的那样，WT人COL22A1的过表达部分挽救了突变胚胎的表型(图7B)。相反，过度表达可诱导的人类E736D变体未能在注射的col22 -胚胎中挽救表型。这些实验表明，E736D变异导致无功能的COL22A1蛋白，并具有显性效应，干扰WT等位基因的功能。

E736D COL22A1变异通过上调mmp9的表达引起出血性事件

接下来，我们研究COL22A1缺乏如何介导出血性表型。先前的研究表明，金属蛋白酶(MMPs)在IAs患者组织中的表达。我们采用实时荧光定量PCR (qPCR)检测了热休克人类E736D突变体和WT col22al过表达胚胎中mmp9和mmp13的表达变化。在3 dpf时，当出血通常很明显时，我们观察到在短暂过表达的E736D COL22Al胚胎和具有稳定hsp70:COL22A1整合的转基因胚胎中mmp表达上调，而mmpl3表达保持不变(图7C;图S5D,E和未显示的数据)，提示mmp9对斑马鱼IAs病理的潜在贡献。为了检验抑制MMPs是否能缓解E736D col22al过表达胚胎的出血性表型，我们用化学MMP抑制剂GM6100处理注射的E736D胚胎。GM6100抑制MMP导致人类E736D col22a1过表达胚胎出血频率显著降低(图7D)。总之，我们的研究结果提供了col22al依赖性出血表型可能通过上调mmp9表达介导的证据，并提示MMP抑制剂可能对COL22AI突变患者的临床治疗有效。

图7 E736D突变影响COL22A1功能，导致胚胎出血比例增加。(A)在WT胚胎背景下，人类COL22A1 E736D变异体的短暂过表达导致出血性表型。与未转染的胚胎和WT hsp70:COL22A1质粒dna注射的胚胎相比，人E736D变异体hsp70:COL22A1 dna注射的胚胎在热休克诱导COL22Af表达后出血比例更高。(B)人类E736D CoL22A1构建体未能挽救斑马鱼col22af突变表型。相反，热休克诱导的人WT coL22A1过表达部分地挽救了col22at突变体胚胎的出血性表型。(C.D) MMP9介导E736D col22a1过表达胚胎的出血形成。(C) gPCR分析mmp9在未注射的对照胚胎、注射了人WT和E736D hsp70:COL22A1构建体的胚胎以及热休克后稳定的转基因WT和E736D hsp70:COL22A1胚胎中的表达。过表达E736D col22af的转基因胚胎中mmp9的表达增加。未转染胚胎的表达水平归一化为1。(D) GM6001化学处理对MMPs的抑制可以挽救人E7360 hsp70: col22a1过表达胚胎的出血表型。与注射相同结构的dmso处理胚胎相比，注射E736D hsp70:COL22A1 DNA结构的gm6001处理胚胎中出血的胚胎百分比减少。“Pc0.05;NS，不显著;使用学生t检验确定。N，实验中使用的胚胎数量。误差条表示s.e。

E736D COL22A1变体刺激内质网(ER)应激反应

我们在细胞水平上探讨了人类E736D变异是否对胚胎有害。我们将人WT或突变体COL22AI的mRNA注射到斑马鱼的单细胞阶段中。注射突变体E736D mRNA会在胚胎原肠形成过程中引起严重缺陷，干扰49%的胚胎的表观代谢运动。卵裂球中的细胞经常与卵黄分离并裂解(图8A,B)。这种表型仅在注射了E736D COL22A1 mRNA的胚胎中观察到:在大多数胚胎中，过表达相同剂量的WT 人COL22A1 mRNA不会引起任何明显的缺陷。为了确定这种表型的原因，我们通过对注射胚胎中的人COL22A1进行免疫荧光染色来分析胶原分泌。捕获原肠胚期细胞的共聚焦图像显示，与分泌的WT形式相比，突变变体主要出现在细胞内(图8C-D)。这表明突变变体不能分泌到细胞外环境中。分泌失败可能是由于蛋白质错误折叠引起的，错误折叠蛋白质的积累会导致ER应激反应。事实上，qPCR显示hsp5和bip标记物的表达升高，与ER应激有关(图8E)。我们进一步分析了E736D突变体对体外ECM成分表达的影响，方法是将携带人类WT或带有His/Mye标记的E736D突变体COL22Al的DNA构建物瞬时转染人成纤维细胞。与瞬时转染人WT COL22A1的细胞相比，E736D COL22A1突变构建的细胞除了层粘合蛋白染色减少外，还显示出更强烈的细胞内COL22AI染色，这表明有缺陷的COL22Al蛋白保留在细胞质中(图S6)。层粘连蛋白缺失可能是由于突变蛋白在细胞内聚集，导致内质网应激，干扰其他ECM分子的合成和分泌。综上所述，这些结果表明E736D COL22A1突变体可能会干扰蛋白质折叠，从而导致内质网应激反应和细胞外基质成分的错误表达，最终导致细胞死亡。

图8 人E736D COL22A1 mRNA的过表达导致原肠胚形成期间细胞脱离，而该蛋白保留在细胞质中，导致ER应激增加。(A.B)与人WT COL22A1 mrna注射的胚胎(A)相比，E736D COL22A1 mrna注射的胚胎(B)在原肠形成过程中细胞不能经历表皮代谢和脱离蛋黄。(C-D”)人E736D COL22A1蛋白在原肠形成过程中保留在细胞质中，而WT COL22A1分泌到细胞外空间(箭头)。共聚焦显微镜分析人COL22A1蛋白免疫荧光(绿色，C,D)和phalloidin染色(红色，C'，D)。蓝色，核DAPI染色。(E)细胞质中人类突变体COL22A1的聚集诱导ER应激。gPCR证实，人E736D COL 22A1 mrna注射的胚胎与人WT mrna注射的胚胎相比，ER应激标记hsp5和bip升高。未注射样品中的表达归一化为1。* P < 0.05。使用Student's I-test确定。误差条表示s.d。

讨论

在这项研究中，我们已经证明了Col22al ir在斑马鱼模型系统中维持血管稳定性的功能作用。我们还发现了与受影响个体IAs相关的COL22A1突变变体。过表达分析表明，E736D变体对Col22al功能有有害影响，并可能干扰蛋白质折叠。总之，我们的研究结果表明，COL22A1突变可能是人类IAs的原因之一。需要使用更大的患者样本进行进一步的遗传分析，以确认COL22A/突变与颅内动脉瘤的关联。

我们的研究结果表明，col22al在颅脉管系统的血管内皮细胞以及结缔组织和颅面肌肉组织中表达。在斑马鱼和小鼠的血管周围成纤维细胞样细胞中观察到col22al的表达，在血管内皮细胞中表达水平较低。基于单细胞数据分析，在室管膜中也发现了小鼠胚胎中显著的Col22al表达有趣的是，斑马鱼Col22al表达与Krt18表达部分重叠，Krt18已知在大鼠室管膜细胞中表达，这些数据表明斑马鱼和哺乳动物之间的许多Col22al表达域相似，Col22al功能很可能在进化上也是保守的。

我们证明了col22纯合子突变的成年人，而不是他们的杂合子兄弟姐妹，表现出出血的频率增加。经历出血性表型的col22a1 -/-成年鱼的百分比随着年龄或心血管应激而增加。此外，col22突变胚胎的出血比例增加，这可能是由于孵化温度升高引起的心血管压力所致。虽然我们没有在col22突变体中观察到浆果样动脉瘤，但它们表现出血管扩张，这在梭状动脉瘤中很常见。其中一些血管形状不规则。这些血管管腔增大，血管壁不规则且宽度可变。有趣的是，TEM分析在col22突变胚胎中检测到畸形的血管内皮。虽然周细胞和平滑肌细胞似乎没有受到明显影响，但col22al突变表型中的血管通透性缺陷可能是由ECM的结构或组成改变引起的。col22al突变表型的确切原因还需要进一步研究。

先前的一项研究表明，斑马鱼胚胎中morpholino介导的col22功能基因敲低会导致肌腱连接缺陷。在这里，我们没有观察到在遗传col22al突变胚胎或成体中骨骼肌或肌腱连接有任何明显缺陷。从免疫染色缺失可以明显看出，col22al突变导致col22al蛋白完全或几乎完全缺失，这表明先前报道的表型可能是由morpholino脱靶效应引起的。然而，最近有证据表明，遗传补偿发生在基因突变体中，而不是在变形体中。这也可以解释col22al突变体中没有缺陷肌肉的原因。相反，我们在纯合子突变胚胎和成人中目睹了心血管应激后脑血管完整性的丧失。

我们还证实了人类COL22A1家族E736D变体的表达干扰COL22A1功能并可导致细胞死亡。此外，人类E736D COL22A1变异体的诱导过表达重现了COL22A1突变斑马鱼在3dpf时所见的出血表型。在早期发育和体外，E736D COL22Al人变异体不能分泌，可能保留在细胞质中。ER应激标记的表达增加表明E736D变异影响COL22Al蛋白折叠。错误折叠的蛋白质可能在ER中积累，触发错误折叠的蛋白质反应途径，导致ER应激升高。最终，这可能导致其他ECM蛋白(如层粘连蛋白)的错误表达，并最终导致细胞死亡。这解释了早期E736D过表达是如何在原肠胚形成阶段导致致死性表型的。未来的研究将集中于确定CoL22Al如何介导动脉瘤的形成。

一些研究描述了MMP9在人类颅内动脉瘤患者中的病理生理参与以及MMP9与胶原原纤维之间的关系。在斑马鱼胚胎中，我们证明了人类E736D COL22A1变异的过表达会导致mmp9上调。这表明mmp9在COL22Al下游发挥作用，介导出血性表型。事实上，在抑制MMPs后，由人类CoL22Al突变体诱导过表达引起的出血性表型的频率降低。我们发现mmp9可以在col22al下游发挥作用，这与MMP9在小鼠颅内动脉瘤形成中的作用一致。诱发高血压的小鼠发生IA，血管壁或厚或薄，以及弹性层紊乱。目前，我们不知道在col22a1过表达的斑马鱼胚胎中是否存在高血压，但记录的表型类似于IA的典型特征。后续的研究需要确定COL22A1和MMP9是否直接或间接相互作用影响疾病的病理。

结论

综上所述，我们的研究结果认为COL22AI具有维持血管稳定性的功能。他们进一步提出，COL22A1的突变可能是人类颅内动脉瘤的原因之一。有必要进一步研究COL22Al变异在家族性和散发性IAs中的频率。未来的研究可以利用斑马鱼作为筛选化合物的模型系统，这些化合物可以减少出血频率并促进IAs新治疗方法的开发。

基金：资金这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持[R01HL134815 to S.S.;R15HDO84262 to P.J.L;F32HL124889至Q.V.T]和美国心脏协会[16GRNT27370004至S.S.]。

文章原文：Disease Models & Mechanisms (2018) 11, dmm033654. doi:10.1242/dmm.033654

详细网址：http://dmm.biologists.org/lookup/doi/10.1242/dmm.033654.

注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。