关于动脉粥样硬化（Atherosclerosis） 动脉粥样硬化(AS)是许多心血管疾病(CVDs)的病理基础，对人类健康构成严重威胁。AS的特点是动脉血管内大量脂质沉积形成斑块，引起肌肉弹性动脉狭窄，导致管腔闭塞或破裂出血。AS的发病机制有几种理论，包括内皮损伤、平滑肌细胞迁移和增殖，以及单核细胞衍生的泡沫细胞形成。AS的病理过程非常复杂，与氧化应激、非编码RNA、炎症有关。 首先，过多的低密度脂蛋白(LDL)在内皮细胞下逐渐积累，成为氧化LDL (Ox-LDL)，从而诱导炎症，导致内皮细胞释放过多的趋化因子。单核细胞在趋化因子的吸引下，在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的刺激下向血管内膜迁移，成为巨噬细胞。然后巨噬细胞吞噬Ox-LDL并转化为泡沫细胞，泡沫细胞释放出许多诱导平滑肌细胞(SMCs)迁移和纤维帽形成的因子。随后，纤维帽上的SMCs逐渐丢失，而浸润的巨噬细胞降解富含胶原的帽基质。这两种机制导致纤维帽变薄，从而导致斑块破裂和血栓形成。 建立AS动物模型对研究其复杂的发病机制及相关药物的筛选和评价具有重要意义。虽然研究人员已经建立了多种用于AS研究的模型，包括家兔、小鼠和大鼠，但这些模型的局限性使其难以监测动脉粥样硬化的发展，并且这些模型不适合大规模筛选潜在的治疗靶点。 图1 动脉粥样硬化研究用斑马鱼模型 相比之下，斑马鱼具有繁殖力强、体外发育快、胚胎透明、脂质代谢过程保守等特点。因此，斑马鱼已成为动脉粥样硬化研究的一种流行的替代动物模型。 斑马鱼具有体型小、饲养成本低、后代数量多、体外受精和发育快等优点，因此对候选靶点进行大规模筛选是可行且经济实惠的。此外，探究AS复杂多样的病理生理过程，特别是其时空特异性具有重要意义。哺乳动物模型，如小鼠和兔子，以及人类活检样本，只能提供终点结果，而斑马鱼由于其胚胎透明和丰富的荧光报告系，可以使用体内活体成像动态监测AS的发展。尽管斑马鱼和人类的血浆脂质谱差异很大，但脂质代谢过程是高度保守的。参与脂蛋白和脂质代谢的基因，如apob、apoe、apoa1、ldlr、apoc2、lpl、lcat和cetp，在斑马鱼中是保守的。此外，胆固醇酯转移蛋白(CETP)是一种促进人类AS发展的酶，在斑马鱼中表达，但在小鼠中不表达。与其他AS动物模型相比，在高胆固醇饲料(HCD)中，氧化脂蛋白的急剧增加最为显著，使其成为研究脂蛋白氧化机制的优秀模型。 经8-12周4% (w/w) HCD喂养的成年斑马鱼易发生高胆固醇血症，其血浆总胆固醇水平达到800 mg/dL，比正常饲料(ND)喂养的鱼高4倍。主动脉背段可见血管内膜肿大、脂质积聚及细胞浸润。这种病变被归类为脂肪条纹，相当于人类II型AS病变，即I-VI型病变的早期阶段。用HCD刺激10天后，斑马鱼幼鱼表现出血管脂质积累、髓细胞聚集和早期脂蛋白氧化。血管脂质积累是剂量依赖性的，取决于饲喂不同浓度的胆固醇(2-10%)，大多数可重复的结果是在4%的胆固醇。因此，斑马鱼HCD模型经常被用于研究AS的早期发展。然而，最近的一项研究报告称，10天的HCD刺激并没有导致斑马鱼幼鱼血管中巨噬细胞的积累。造成这种差异的原因值得进一步调查，但这种差异表明，与成年鱼一样，更长时间的HCD喂养可能是必要的。 图2 8dpf斑马鱼幼鱼经45d 8%HCD喂养，构建斑马鱼动脉粥样硬化模型（a：血管中的胆固醇蓄积；b：血管中的巨噬细胞浸润；c：血管中的中性粒细胞蓄积；d：体内脂质水平。A：正常组；B：动脉粥样硬化模型组。） 图3 动脉粥样硬化斑马鱼血管中的斑块形成 低密度脂蛋白受体(LDLR)缺乏导致人类家族性高胆固醇血症。Liu等人利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼中的ldlr。ND喂养的ldlr突变斑马鱼表现出SREBP-2通路的激活，并出现中度高胆固醇血症。在喂食HCD仅5天后，ldlr突变体幼鱼表现出血管脂质积累增加，高胆固醇血症加剧，导致II型AS病变。饮食改变时间的减少使该模型对高胆固醇血症的机制研究和潜在药物的筛选更有用。 APOC2是脂蛋白脂肪酶的激活剂，在脂质代谢中起重要作用。Liu 等人利用TALEN技术敲除斑马鱼体内的apoc2。结果显示，apoc2突变体中存在乳糜小血症和严重的高甘油三酯血症，与apoc2缺失患者的特征相似。饲喂ND的apoc2-/-幼鱼在脉管系统中出现脂质积累和含脂巨噬细胞，这与人类II型AS病变发展过程中观察到的情况相似。因此，不饲喂HCD的apoc2-/-斑马鱼可作为血脂异常模型，研究血管壁巨噬细胞对LDL浸润、氧化和吞噬的分子机制，并可作为筛选高脂血症药物的模型。 肝脏X受体(Liver X receptors, LXRs)在胆固醇分解代谢中起重要作用。哺乳动物中存在lxr α和lxr β两种亚型，而斑马鱼中只存在一种与lxr α具有较高同源性的lxr基因。lxr靶向缺失的斑马鱼在喂食HCD或高脂肪饮食(HFD)时，LDL显著增加，出现严重的高胆固醇血症和肝脂肪变性，脂质沉积类似于人类的脂肪条纹。该模型可用于筛选肠道限制性LXR激动剂，用于抑制血脂异常和动脉粥样硬化的发展。 斑马鱼动脉粥样硬化模型评价指标 理化指标：总胆固醇（TC）含量、总甘油三酯（TG）含量、低密度脂蛋白（LDL）含量、高密度脂蛋白（HDL）含量； 脂质影响：体内脂质（油红O染色）、血管脂质（血管脂质沉积）； 血管影响：血管厚度； 氧化影响：MDA含量、SOD活性、ROS水平等； 炎症影响：免疫因子（IL-6、TNF-α、IL-1等）水平、免疫细胞数量（中性粒细胞、巨噬细胞等）、NO水平。 AS是一种复杂的进行性疾病，其发病机制尚不完全清楚。它不仅受糖尿病、慢性肾病、高血压和高脂血症等致病因素的影响，还与其他危险因素有关，如遗传、年龄、性别、吸烟、肥胖、饮食和营养状况。目前临床治疗AS的药物包括他汀类药物、抗血栓药物和手术干预以减轻并发症，但仍没有有效或特异性的治疗AS的药物。斑马鱼模型可能有助于理解AS的发病机制和确定新的治疗靶点和方法。此外，评估环境因素、微量元素、药物等危险因素对AS发病机制的影响，也是今后治疗干预的重点。 木芮生物具有完善的斑马鱼实验平台，并建立起了上百种的临床疾病模型，利用遗传、行为、细胞、生化分子等实验技术，深入探索疾病发生的机制，进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或药物筛选机制。我们依托成熟的科研技术，可以为广大客户提供基础科研、毒理测试、药物筛选等服务，助力生物医学领域发展。
斑马鱼动脉粥样硬化模型
高胆固醇饮食模型
ldlr突变斑马鱼
apoc2突变斑马鱼
lxr突变斑马鱼
