摘要

二甲双胍不仅在糖尿病治疗中具有良好的作用，而且由于其抗氧化能力，它作为一种治疗炎症相关疾病的有前景的药物而受到关注。然而，这种效应的机制基础仍然难以捉摸。利用斑马鱼体内炎症模型，我们探索了二甲双胍对中性粒细胞募集的影响及其潜在机制。我们的数据表明，二甲双胍降低组蛋白(H3K18)乳酸化，导致活性氧(ROS)的产生减少，中性粒细胞对尾鳍损伤和耳囊泡炎症的反应减弱。为了研究二甲双胍通过ROS和H3K18乳酸化调节中性粒细胞迁移的确切机制，我们精心建立了二甲双胍诱导的H3K18乳酸化抑制与ROS水平之间的相关性。通过乳酸和ROS恢复的补充实验，我们的研究结果表明，乳酸和ROS水平的升高显著促进了斑马鱼的炎症反应。总的来说，我们的研究阐明了二甲双胍通过下调H3K18乳酸化和ROS产生的抗氧化和抗炎作用的先前未被探索的途径，强调了表观遗传调节在炎症中的关键作用，并指出二甲双胍在治疗炎症相关疾病方面的潜力。

炎症是免疫系统对损伤或致病性威胁的先天反应，目的是防止疾病扩散，促进组织修复。中性粒细胞是免疫反应的前线卫士，在消除外部威胁方面发挥着关键作用。它们不仅吞噬坏死细胞，抑制免疫细胞的进一步募集，还分泌介质刺激生长和血管生成，同时产生裂解酶和保护酶，加速组织修复。深入了解中性粒细胞介导的炎症的调节机制可以为以中性粒细胞异常活化为特征的疾病提供新的治疗途径。

二甲双胍(Metformin, Met)是一种著名的口服降糖药，它不仅能降低胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖的产生，还能调节免疫反应。它抑制巨噬细胞和淋巴细胞的细胞因子产生并抑制NF-κB信号通路。此外，二甲双胍促进调节性T细胞的增殖，这对于调节过度活跃的免疫反应至关重要。尽管有这些已知的作用，二甲双胍对中性粒细胞炎症行为的具体影响尚未得到充分探讨。由于斑马鱼在胚胎和幼鱼阶段表现出的光学透明性，它们是研究先天免疫的理想模型。我们的目标是利用转基因斑马鱼模型Tg (lyz: EGFP）来利用斑马鱼幼鱼的这一优势 。该模型使我们能够研究二甲双胍是否影响中性粒细胞向生物体炎症部位的募集。

二甲双胍调节活性氧(ROS)的能力已经确立;它通过抑制线粒体复合体I和活化amp活化的蛋白激酶(AMPK)来抑制ROS的产生，同时增强抗氧化防御。据报道，过量的ROS会诱导中性粒细胞在炎症部位异常聚集，从而加剧炎症过程。为了进一步研究二甲双胍、炎症和ROS之间的关系，我们计划使用炎症诱导的斑马鱼模型进行进一步的实验。通过监测二甲双胍治疗后ROS水平的动态变化，我们旨在阐明二甲双胍调节ROS的具体机制。本研究对二甲双胍在中性粒细胞迁移和炎症过程中的作用提供了更全面的了解。这些见解将有助于揭示二甲双胍的精确免疫调节机制，有助于阐明相关炎症性疾病的治疗。

二甲双胍作为治疗糖尿病的一线药物，可能通过其血糖控制机制影响机体糖酵解代谢及糖酵解相关基因。乳酸在糖酵解过程中起着至关重要的作用，作为代谢副产物显著调节组蛋白乳酸化水平。组蛋白乳酸化是最近发现的一种与多种生物过程相关的翻译修饰，包括肿瘤发生、神经发育和炎症。我们研究了二甲双胍是否影响组蛋白乳酸化，从而调节中性粒细胞迁移并影响体内的炎症和免疫反应。总之，我们的研究采用斑马鱼成像来探索二甲双胍如何影响中性粒细胞募集。我们首次揭示了组蛋白乳酸化在调节ROS产生中的作用，从而影响二甲双胍对中性粒细胞活性的调节作用。我们的发现引入了一种新的ROS调控机制，丰富了目前对ROS生物学领域的理解，并扩展了我们对二甲双胍如何调节免疫反应的见解。

成年野生型(WT/AB)和转基因Tg(lyz: EGFP)品系在28.5°C的自动循环水系统中培养，光照周期为14 h，暗循环为10 h。系统自动监测和调节水的pH值和盐离子浓度，使其保持在pH 7.0-7.5，盐离子浓度约为500 - 550mg /mL。野生型(WT)和转基因Tg( lyz: EGFP)品系自然交配获得胚胎。将斑马鱼胚胎置于Hank’s溶液中，温度28.5℃，pH 6.5-7.5，培养3-5天。N-phenylthiourea (PTU;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)用于防止幼鱼形成色素。我们严格遵循安徽农业大学动物资源中心SYXK(安徽)2016-007的指导方针和规定。

二甲双胍(Met) (Aladdin, Shanghai, China)在ddH₂O中溶解，制备原液(10mM)。为了评估Met对斑马鱼发育的毒性，使用不同浓度的二甲双胍(0μM, 50μM, 100μM, 400μM和800μM)进行连续浸泡处理。通过对斑马鱼的孵化率、体长和流动性进行毒性评价后，选择50μM的Met进行后续实验，10μM的浓度处理细胞8h。通过显微注射将LPS (0.15mg/mL, 50nL) (Sigma, L2630)注射到斑马鱼的耳囊中，建立全身性炎症模型。LPS (2.5μg/mL)作用2h诱导细胞炎症。5dpf(受精d)时，用乳酸(50mM) (Macklin，中国)处理10h，并用乳酸(25mM)处理6h，以提高细胞的乳酸化水平。H₂O₂用(200μM)在5 dpf下处理斑马鱼2h，以增加体内活性氧水平，同时用25mM浓度处理细胞0.5h。

使用Viewpoint仪器(Viewpoint, Lyon, France)的Photomotor Response (PMR)模型对斑马鱼幼体(5dpf)的短期运动行为进行了评估。简单地说，将斑马鱼幼鱼置于48孔板中进行测试，每组10只幼鱼。实验流程为:30min黑暗，5min光照，5min黑暗，三个周期。仪器置于恒温28.5℃的培养箱中。采用自动视频跟踪系统(ViewPoint, Lyon, France)监测幼鱼运动30 min，并用Zebralab 3.11软件(ViewPoint, Lyon, France)记录幼鱼运动情况。

体视显微镜下观察30hpf时的摇尾率(时间/1 min)、48hpf和72hpf时的心率(时间/20s)、96hpf时的体长(cm)和96hpf时的存活率。每次实验大约使用30只斑马鱼。

用0.1 g/mL MS-222溶液(Sigma, E10521)麻醉Tg(lyz:EGFP)幼鱼(5 dpf)。在体视显微镜下用叶片对尾鳍进行手术损伤。伤后3h，用荧光显微镜观察尾鳍中性粒细胞的迁移情况，用ImageJ软件(1.6.0版)分析中性粒细胞数量。每组共20尾斑马鱼。

斑马鱼Tg( lyz: EGFP)品系用0.1g/mL MS-222溶液(Sigma, E10521)麻醉，并在斑马鱼幼鱼耳囊内注射约50nL LPS (0.2 μg/L, Sigma)。注射LPS 3h后，用荧光显微镜观察中性粒细胞向耳小泡募集情况，用ImageJ软件(1.6.0版)分析中性粒细胞数量。每个实验组共选用斑马鱼幼鱼20只。

DCFH-DA (Beyotime, China)用于检测细胞和斑马鱼中ROS的产生。检测细胞时，先将NIH/3T3细胞接种于12孔板，接种密度为2.5 × 10⁴个/孔。药物处理后，细胞与约500 μL DCFH-DA (10μM)在37℃下孵育30 min。孵育后，用1倍PBS洗涤细胞2次，去除未穿透的DCFH-DA。然后使用多功能微孔板读卡器(VICTOR Nivo, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)在FITC检测模式(488/525nm)下测量荧光，使用荧光显微镜(Carl Zeiss, Jena，德国)捕获图像。将斑马鱼幼鱼与DCFH-DA (10μM)在28℃下孵育25 min，然后用PBS洗涤2次以去除未穿透的DCFH-DA。最后在荧光显微镜下采集图像，使用ImageJ软件(1.6.0版本)对幼鱼的荧光强度进行定量分析。

使用乳酸测定试剂盒(Abbkine，中国武汉)测定斑马鱼幼鱼和细胞的乳酸含量。简而言之，经药物处理后，共采集幼鱼30只，收集到约5 × 10⁶个细胞。将样品加入萃取液中，混合均匀，在12,000× g下离心10 min。将上清液置于565nm的分光光度计中测量吸光度。

小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)购自Pricella(中国武汉)。RAW264.7细胞培养于α-MEM(Hyclone, Logan, UT, USA)添加10%胎牛血清(FBS;康源生物，天津，中国)，然后放置在细胞培养箱(5% CO₂，37℃)。所有实验均采用3-7代细胞进行。

分析不同药物治疗后各组蛋白泌乳水平。药物处理后，收集各组斑马鱼幼鱼和细胞，离心，在RIPA缓冲液(Servicebio, Wuhan, China)中裂解，进行Western blotting。将收集的样品煮沸5分钟，在12.5% SDS-PAGE凝胶上电泳。用5%牛奶阻断硝化纤维素膜，用抗H3K18la (1:1000, PTM-1406, PTMBIO)、组蛋白H3 (1:1000, PTM-7093, PTMBIO)或pan-Kla (1:1000, PTM-1401, PTMBIO)抗体孵育过夜。清洗后，切片用酶标二抗(Sangon, Shanghai, China)室温孵育2小时，并用化学发光溶液成像。

结果

为了确定二甲双胍治疗斑马鱼幼鱼的最佳浓度，我们将24hpf斑马鱼幼鱼浸泡在含有不同浓度二甲双胍的溶液中。通过连续监测96hpf以上斑马鱼的存活率、心率、甩尾、体长和活动，我们评估了二甲双胍对斑马鱼幼鱼生长发育的影响。与对照组相比，50μM Met对斑马鱼幼鱼的存活率(96hpf)、甩尾频率(30hpf)、心率(24hpf、48hpf、72hpf)和体长(96hpf)均无显著影响(图1b-h)。在体内显微镜下，二甲双胍处理后，幼鱼的整体形态与对照组没有显著差异(图1g)。此外，我们还利用行为探测器对斑马鱼幼鱼进行了PMR实验。与对照组相比，在光照和黑暗条件下，50μM Met对斑马鱼幼鱼的活性没有显著影响(图1i–l)。综上所述，50 μM Met对斑马鱼幼体的基本生理功能和生长发育无显著影响。

随后，使用转基因斑马鱼Tg（lyz: EGFP)用荧光中性粒细胞标记，建立两种急性炎症模型:尾鳍损伤和耳囊注射。我们通过体内成像评估二甲双胍治疗是否会影响中性粒细胞向炎症部位的迁移。结果显示，在尾鳍损伤模型中，二甲双胍处理可显著抑制中性粒细胞向损伤部位的迁移( 图2a、b)。这在耳泡模型中也得到了类似的验证( 图2c, d)。促炎细胞因子是机体免疫细胞在炎症反应中分泌的一组蛋白质。Tnf-α， il-1β， il-6和 cxcl8a都在这些因素之中。它们在免疫反应中起着至关重要的作用，通常用于评估体内的炎症水平。每只幼鱼微注射LPS后，用50μM二甲双胍处理3h，提取RNA检测细胞因子表达。结果显示，与对照组相比，LPS处理组促炎细胞因子的表达显著升高( 图2e、h)。但与LPS组相比，二甲双胍预处理组的表达明显降低。在细胞实验中，我们也检测了基因的表达 Tnf-α， il-1β， il-6和 cxcl8a ( 图2i,l)。与先前的研究结果一致，二甲双胍降低了促炎细胞因子的水平，表明其对细胞内免疫的影响。

总之，我们证明了二甲双胍通过下调中性粒细胞迁移和降低促炎细胞因子水平来减轻炎症反应。

研究表明，二甲双胍的抗炎作用可能与其阻断线粒体DNA合成和激活AMPK信号通路有关。我们假设二甲双胍可能会降低体内活性氧(ROS)的水平。在这项研究中，我们通过斑马鱼实验和细胞分析探讨了二甲双胍对ROS水平的影响。首先，在斑马鱼实验中，我们将斑马鱼暴露在过氧化氢中以诱导ROS的产生。然后，另一组斑马鱼用二甲双胍治疗，以评估其对活性氧水平的影响。结果显示，二甲双胍处理组，ROS水平显著降低(图3a、b)。我们还检测了关键基因的表达，如 duox， sod1发现二甲双胍显著下调了这些基因( 图3c–f)。这些基因在调节活性氧水平中起着关键作用，表明二甲双胍有效地减弱了生物体的氧化应激反应。其次，通过细胞检测，我们测量了二甲双胍对ROS浓度的影响，并观察到二甲双胍显著降低了细胞内ROS水平。我们研究了关键基因的表达谱，包括 duox, sod1, cat，在ROS调节中起关键作用。将细胞暴露于过氧化氢后，我们给予二甲双胍并监测其对这些基因表达的影响。值得注意的是，二甲双胍处理显著抑制了 duox(一种产生ROS的重要酶)，并下调抗氧化基因的表达，如 cat和 sod1．

这些结果进一步支持二甲双胍在减少ROS介导的细胞损伤中的保护作用。通过这两个角度的验证，我们得出结论:二甲双胍可以有效降低过氧化氢诱导的ROS水平。这些发现突出了二甲双胍作为一种潜在的治疗药物减轻氧化应激相关疾病的潜力，并值得进一步研究其减轻氧化损伤的作用机制。

在我们之前的实验中，我们测量了斑马鱼体内活性氧的水平以及相关基因的表达duox sod1,和 cat。研究结果表明，过氧化氢处理显著提高了斑马鱼体内的活性氧水平，并导致 duox基因的表达。这一发现表明过氧化氢处理可能通过激活Duox复合物来增加活性氧的产生，从而导致细胞内氧化应激反应的增加。

在进一步的实验中，我们故意增加细胞内活性氧的水平，以研究它们对中性粒细胞迁移和免疫功能的潜在影响。我们采用两种急性炎症模型，尾鳍损伤和耳石囊损伤来评估过氧化氢处理对中性粒细胞迁移的影响。令人惊讶的是，在活性氧浓度升高的条件下，中性粒细胞的迁移显著增强( 图4a–d)。此外，过氧化氢处理诱导这些促炎细胞因子的表达上调(Tnf-α， iL-1β， iL-6，和 cxcl8a） ( 图4E-h)，免疫应答也增强。这一发现与之前活性氧水平升高和促炎因子表达上调的结果一致，提示过氧化氢可能通过上调活性氧水平和促炎因子表达来影响中性粒细胞迁移。然而，当我们引入二甲双胍作为干预措施时，这种效果被显著抑制。虽然活性氧水平仍然很高，但在二甲双胍的影响下，中性粒细胞的迁移能力和免疫反应都比未治疗组明显减弱。在细胞实验中，我们还评估了二甲双胍对活性氧水平的影响。同样，二甲双胍显著降低了促炎因子( 图4i–l)。这些发现提示过氧化氢处理可能通过激活氧化应激反应诱导促炎因子的表达，导致炎症反应，而二甲双胍可以抑制这一现象。

在我们的研究中，我们对二甲双胍的功能进行了深入的研究，特别是它在调节细胞乳酸生成中的作用。在斑马鱼实验中，我们彻底检查了乳酸含量和基因表达，如hdac3，pkma, gapdh．

结果表明，经二甲双胍处理后，乳酸浓度显著降低( 图5a)，表明二甲双胍对乳酸水平有调节作用。此外，我们观察到hdac3、pkma和gapdh基因表达水平的变化，二甲双胍治疗下调了它们的表达(图5b-d)。这些基因在乳酸代谢中起着至关重要的作用，它们的下调暗示着对乳酸代谢率的潜在影响。这些发现提示二甲双胍可能通过影响这些乳酸酶相关基因的表达来调节乳酸代谢。在蛋白水平上，我们检测了斑马鱼组蛋白的泌乳水平，发现二甲双胍显著下调了H3组蛋白的泌乳修饰，尤其是H3K18位点( 图5e–g)。在细胞实验中，我们还测量了乳酸水平和基因表达，如 hdac3, pkma, gapdh。与斑马鱼实验一样，二甲双胍处理导致细胞内乳酸浓度显著降低，表明其对细胞乳酸代谢的影响( 图5h)。此外， hdac3, pkma, gapdh也改变了( 图5i–k)。这些结果支持二甲双胍通过调节乳酸酶相关基因影响细胞内组蛋白乳酸化的观点。结合斑马鱼和细胞实验的结果，我们得出结论，二甲双胍影响斑马鱼/免疫细胞中乳酸酶相关基因，并下调组蛋白乳酸化。

这些发现为二甲双胍调节新陈代谢的机制提供了重要的见解。

在我们之前的研究中，我们发现二甲双胍对降低组蛋白乳酸化有显著的作用。基于这一发现，我们进一步探讨了乳酸对乳酸化和H3K18乳酸化的影响，并考察了二甲双胍在这一背景下的作用。Western blot结果清楚地显示，与Con组相比，乳酸组总体乳酸化水平和H3K18乳酸化水平显著升高(图6a-c)。然而，当乳酸和二甲双胍联合使用时，乳酸诱导的上调被有效抑制。此外，乳酸显著提高了 pkma和 gapdh基因( 图6d, e)。然而，在同时使用乳酸和二甲双胍的组中，这些基因的表达明显受到抑制，进一步证明了二甲双胍调节乳酸化修饰的能力。关于活性氧，我们注意到乳酸不仅增加了斑马鱼体内活性氧的产生( 图6f,g)，也显著上调氧化应激相关基因的表达 duox和 sod1。这些结果表明，乳酸可能通过激活氧化应激途径来调节活性氧的产生。最后，我们采用尾鳍损伤和耳石囊损伤两种急性炎症模型，研究乳酸处理对中性粒细胞迁移的影响。我们观察到，在斑马鱼的乳酸处理后，无论是割尾还是耳石囊损伤实验中，乳酸组均表现出中性粒细胞的显著增加。二甲双胍的加入削弱了中性粒细胞的迁移，从而减少了体内的炎症反应( 图6j-q)。这些发现与之前活性氧水平升高的研究结果一致，表明乳酸可能通过上调活性氧水平来影响中性粒细胞的迁移行为。

总的来说，我们的研究结果表明，乳酸通过提高活性氧的水平来影响中性粒细胞的迁移。二甲双胍可减轻乳酸升高引起的氧化应激和炎症。这些发现为乳酸盐在免疫调节和炎症中的作用提供了重要的见解。尽管如此，需要进一步的研究来阐明乳酸和活性氧之间的调节相互作用，并发掘其在治疗炎症相关疾病中的潜在应用。

总之，我们的研究强调过氧化氢通过上调活性氧水平来影响中性粒细胞的迁移，并可能在此过程中诱导炎症反应。这为深入了解氧化应激在免疫调节和炎症过程中的作用提供了重要线索。这些发现清楚地表明，虽然活性氧可以调节中性粒细胞的迁移和免疫功能，但二甲双胍具有潜在的调节作用，可以有效减轻活性氧过量产生的生物学效应。这一发现为二甲双胍在细胞免疫调节中的潜在应用提供了新的见解。然而，二甲双胍与活性氧之间的调节机制，以及其在炎症相关疾病中的潜在治疗价值，仍需要进一步的研究来阐明。我们的研究为该领域提供了有价值的信息，为今后相关领域的研究奠定了基础。

我们的研究提供了对二甲双胍更细致入微的理解，二甲双胍通常以其抗糖尿病能力而闻名，并表明其作为一种多功能治疗工具的潜力。具体来说，我们发现二甲双胍通过H3K18乳酸化/ROS轴调节炎症，开辟了一条令人兴奋的新研究路线。这种表观遗传控制机制为针对以未抑制ROS和炎症为典型的疾病的新疗法提供了有希望的途径。

虽然二甲双胍的抗炎和抗氧化作用已被广泛证实，但其潜在的分子机制仍然复杂且具有挑战性。最近的研究发现，PEN2是二甲双胍的直接分子靶点，阐明了分子相互作用介导的溶酶体途径和AMPK的特异性激活。这一澄清强调了ampk相关通路在二甲双胍多种功能中的关键作用，包括葡萄糖降低、延长寿命和抗衰老作用。此外，二甲双胍的抗炎作用也逐渐受到重视。研究表明二甲双胍可以显著降低il-1β和 il-6但不抑制炎症通路NF-κB的激活。在免疫调节方面，二甲双胍已被证明可能调节人体内的免疫活性，包括抑制t细胞介导的免疫反应。此外，二甲双胍通过保守的PMK-1/p38 MAPK通路促进小鼠先天免疫。我们的研究结果与这些观察结果一致，因为我们也证实了二甲双胍治疗斑马鱼的促炎因子(TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8)的减少。这些发现与先前关于二甲双胍抗炎作用的研究一致(Jing et al.， 2018;Xian et al.， 2021)，进一步证实了二甲双胍在抑制炎症反应中的作用。

二甲双胍调控活性氧的多种作用机制引起了广泛关注。研究表明，二甲双胍可以通过多种途径调节ROS。值得注意的是，研究报告强调了二甲双胍在NLRP3激活后减轻巨噬细胞线粒体ROS (mtROS)积累的能力。因此，二甲双胍已被证实通过激活AMPK通路或直接影响线粒体来减少ROS的产生。与这些发现一致，我们的研究结果与Sekar等人的研究结果一致，他们证明了过氧化氢在斑马鱼和巨噬细胞中诱导的高ROS生成显著减少。这一发现进一步巩固了对二甲双胍在调节ROS水平方面的有效性的理解，为揭示其调节细胞活动能力的其他细节提供了关键线索。

ROS在中性粒细胞功能的调节中起着关键作用。早期研究表明，ROS水平的增加会引发一系列细胞反应，包括中性粒细胞的迁移。此外，氧化应激升高可能引起炎症微环境的改变，破坏组织酸碱平衡。值得注意的是，我们的研究表明，当身体处于炎症状态时，二甲双胍的添加会导致乳酸水平的降低。研究表明，高浓度乳酸可使免疫细胞进入免疫抑制状态，影响炎症调节。乳酸也可能通过调节细胞信号通路如NF-κB通路影响炎症介质的表达水平。随着乳酸浓度的增加，体内的乳酸化水平也会增加。先前的研究表明H3K18乳酸化与某些细胞应激反应有关。然而，我们的研究清楚地证明了乳酸和活性氧水平之间的关系。我们的数据进一步证实了ROS在炎症中的核心作用，并将ROS与H3K18乳酸化联系起来，揭示了一个复杂的反馈回路，其中细微的分子变化深刻影响细胞行为和整体健康。这一发现不仅扩大了我们对活性氧与代谢产物之间相互作用的理解，而且为更深入地理解炎症调节的分子机制提供了新的视角。

有趣的是，我们的研究发现二甲双胍可以降低组蛋白H3K18和乳酸化基因的表达，表明二甲双胍可以降低乳酸化水平。这是一项新发现，之前没有文献报道二甲双胍会影响乳酸化，这为深入研究二甲双胍抗炎作用的分子机制开辟了新的途径。更重要的是，我们的研究揭示了乳酸化和活性氧的产生之间的潜在联系。我们观察到乳酸的添加可以增加ROS水平，随后影响中性粒细胞迁移，而二甲双胍可以减轻这种影响。这一发现表明，乳酸化可能通过影响ROS的产生来影响中性粒细胞的功能，二甲双胍可能通过调节这一过程发挥抗炎作用。最后，我们的工作表明，过氧化氢处理提高了斑马鱼的促炎因子表达，放大了中性粒细胞的迁移，并强调了ROS在炎症中的关键作用。

总之，随着我们继续解开免疫、炎症和代谢之间复杂的相互作用，二甲双胍等影响这些途径的药物可能成为新治疗方法的基石。未来的工作应该探索H3K18乙酰化的确切机制和潜在应用，从而丰富这一新兴的研究领域。

综上所述，二甲双胍通过抑制组蛋白(H3K18)乳酸化，导致随后的活性氧(ROS)水平下降，有效地减少斑马鱼炎症模型中的中性粒细胞募集。组蛋白乳酸化和ROS生成之间的直接联系揭示了有希望的抗炎靶点，强调了二甲双胍在免疫相关疾病中的潜在治疗意义。

原文地址：https://www.mdpi.com/2076-3921/13/2/176

注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。