斑马鱼肾脏器官发生：对脊椎动物肾发生与再生的研究启示

标题：Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration

期刊：Wiley Interdiscip Rev Dev Biol.

摘要

脊椎动物在发育过程中会逐步形成多达三种肾脏器官——前肾、中肾和后肾。每种肾脏均源自中间中胚层，由被称为肾单位的保守排泄单位构成。斑马鱼是脊椎动物发育遗传学的理想研究模型，近期研究表明斑马鱼与哺乳动物在肾单位的组成和生理功能上存在诸多相似之处。斑马鱼胚胎会形成结构简单的前肾，仅包含两个肾单位；而在幼体阶段，数百个肾单位构成的中肾会以此为基础逐步发育形成。成年斑马鱼的中肾会持续进行肾发生过程，在生长阶段或肾损伤后，会从局部肾祖细胞库中生成新的肾单位。斑马鱼前肾和中肾的特性使其成为遗传研究中易操作的肾脏系统，为研究肾脏基因功能、解答肾发生机制相关关键问题提供了良好模型。本文概述了斑马鱼这两种肾脏器官的形成过程与组成结构，并探讨了各类斑马鱼突变体、基因敲低模型及转基因模型如何为进一步阐明肾发生通路构建了研究框架。

引言

脊椎动物的肾脏具有多种功能——它们排泄废物、进行渗透调节、重吸收代谢物、维持酸碱平衡，甚至还能分泌激素。为了完成这一系列多样的生理活动，肾脏由许多特化细胞构成。例如，在人类体内，就有超过20种分化的肾细胞类型。肾细胞大致分为实质细胞（功能性细胞）和基质细胞（支持细胞），这两类包含了多种上皮细胞和间充质细胞类型。上皮细胞排列成被称为肾单位的功能单位，而间充质细胞则占据肾单位之间的间质间隙。肾单位由滤血器、肾小管和集合管组成，每个区域都呈现分段结构，表型不同的上皮亚区在此执行特定的生理功能¹。肾单位在其近端端过滤血浆，并将滤液输送至肾小管。在肾小管内部，近端小管、中间小管和远端小管等一系列节段对流经的滤液进行改造，以重吸收和/或分泌溶质，最终将液态废物排入集合管。与此同时，间质细胞分泌激素，并调控局部细胞外基质的动态变化。脊椎动物的肾脏包含数百到数百万个沉浸在这一复杂组织微环境中的肾单位，因此是解剖结构和生理功能都极为复杂的器官。在脊椎动物的个体发育过程中，肾脏的发育与其他器官相比具有独特性，因为在胚胎期和/或幼体期会生成多种肾脏结构，随后这些结构又会发生退化²。值得注意的是，每种肾脏结构均由相似的肾单位基本单元构成，且均源自中间中胚层（((IM) ^{2})）。高等脊椎动物（如哺乳动物）会形成多达三种肾脏，它们依次从中胚层间叶（IM）发育而来：前肾、中肾和后肾。每一种后续形成的肾脏结构通常都比前一种结构更复杂，其所含肾单位的数量、排列方式乃至功能程度均有所不同。已有研究在鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物等多种动物模型中对肾脏发育展开了广泛探讨。具体而言，对哺乳动物的研究极大推动了我们对中间中胚层特化及后肾形成过程的认知，例如间充质与上皮成分之间的诱导信号如何驱动分支形态发生，进而形成树状导管和肾单位阵列。然而，哺乳动物后肾复杂的结构在很大程度上阻碍了对肾脏前体细胞生成肾单位机制的深入分析，目前对于不同肾单位上皮节段的模式建成机制，我们的认知仍处于基础阶段。

近年来，斑马鱼已成为研究脊椎动物发育的重要模式生物⁴。包括大规模正向和反向遗传筛选、基因组学以及化学遗传学在内的方法，推动了人们对调控器官发生通路的诸多发现。斑马鱼肾脏如今被视为识别和评估肾脏基因功能、构建肾脏疾病模型的有价值范式。在胚胎发育阶段，斑马鱼会形成由一对肾单位组成的简单前肾，并在幼体生长的数周内持续使用这一肾脏结构（图1）。斑马鱼幼鱼最终会发育出中肾，中肾包含数百个肾单位，在幼鱼持续生长和成年阶段发挥功能（图1）。与其他硬骨鱼一样，斑马鱼从不发育第三种后肾。有趣的是，成年斑马鱼肾脏具有新肾发生的特性，随着鱼体体型增大或肾脏受损，新的肾单位会从肾前体细胞簇中生成，这一特征在高等脊椎动物中并不常见。斑马鱼与其他脊椎动物在肾脏发育的多个特征上也存在差异。例如，哺乳动物的前肾由退化的肾单位构成，哺乳动物的中肾仅短暂发挥功能，随后在妊娠期间后肾发育完成时发生退化。

图1. 斑马鱼肾脏发育时间线（上）彩色条块标注主要发育事件，以体节（s）数量或受精后天数（dpf）标记。（下）黑色条块代表前肾和中肾形成各事件的大致时间区间。

尽管存在这些差异，但不同物种间肾单位基本组成单元的高度保守性，使得斑马鱼的前肾和中肾成为研究脊椎动物肾发生机制的有用模型。斑马鱼中的肾单位前体细胞表达与其他脊椎动物同源的基因，其分化的肾单位上皮细胞具有许多共同的细胞和分子特征。此外，斑马鱼的发育特性使其能够以两栖动物、鸟类或哺乳动物模型无法实现的方式研究肾单位的发育。斑马鱼胚胎的体外受精和光学透明性，使得可以在体内观察前肾的发育和功能，这可通过基因表达、转基因和生理学实验进行评估。斑马鱼中肾形成的早期阶段也可在体内监测，从而能在比幼胚更复杂的环境中研究肾单位的生长和形态发生。斑马鱼前肾和中肾还可用于研究肾脏稳态维持过程中以及损伤刺激下的肾发生过程，为探究上皮再生和肾脏干细胞的生物学特性提供了契机。综上，在这些完整生物体的环境中研究肾发生过程的能力，为阐明肾脏发育机制提供了一种新颖且有效的手段，可与其他动物模型形成互补。本综述阐述了目前对斑马鱼肾脏发育的认知。文章探讨了前肾的组成、模式形成、分化及成熟过程。随后，文章讨论了斑马鱼中肾发育所涉及的过程，以及通过新肾发生和再生维持该肾脏的机制。最后，介绍了斑马鱼肾脏发育相关知识在理解和治疗先天性肾脏缺陷及肾脏疾病中的部分应用。

前肾的特化与模式建成

原肾中肾单位的胚胎起源与组成——斑马鱼原肾源自由间中胚层前体细胞形成的双侧肾祖细胞区域条纹。盾期胚胎的命运图谱分析表明，原肾细胞来源于腹侧中胚层的一个区域，该区域紧邻血液和血管祖细胞并与其部分混合（图2、3）。在外胚层内卷和原肠胚形成过程中，细胞运动使间中胚层在尾芽期形成典型的“U”形结构，即间中胚层以平行束状分布于中线两侧，在尾芽处呈半圆形弧形尾侧汇合（图2(a)）。间中胚层位于注定形成轴体体节的体旁中胚层与占据胚胎最外侧位置的侧板中胚层之间。随着体节发生阶段的发育推进，U形的间中胚层区域进一步延长，平行的间中胚层束向中线及彼此方向靠拢。这些形态变化很可能是由细胞运动与生长共同作用所致，在躯干轴向延伸过程中延长了体后部，例如会聚延伸运动使肾单位紧密贴。

图2.斑马鱼前肾来自IM

图3. 肾祖细胞区域的特化、轴向定位与维持（A）背腹轴特化过程中，骨形态发生蛋白（BMP）信号通路激活可诱导腹侧中胚层命运的形成。胚胎盾期的命运图谱研究已确定了血液、成血管细胞和前肾细胞谱系的起源区域（蓝色）。血液和成血管细胞源自最腹侧的中胚层，前肾命运细胞与之部分混杂，但也占据稍偏外侧的位置。（B）促进中间中胚层（IM）命运（蓝色）形成的中胚层特化事件涉及T-box转录因子家族的作用，如ntla和tbx16，它们在原肠胚晚期（外包期）至体节发生全程均有表达（未展示）。（C）尾型同源盒（cdx）因子介导的中胚层模式化负责确定中间中胚层区域（蓝色）的轴向位置。邻近组织的模式化事件也会影响前肾祖细胞，例如osr1的活性可通过调控内胚层和成血管细胞谱系，维持肾祖细胞前端区域中pax2a的表达。

基于基因表达研究，在体节发生早期从中间中胚层（IM）形成的肾祖细胞区域，紧邻一个产生成血管细胞和原始血液前体细胞混合物的细胞区域。成血管细胞前体细胞位于侧板中胚层（PM）旁的侧带中，血液前体细胞位于成血管细胞外侧的后带中，而肾祖细胞区域则处于最外侧位置（图2(b)）。在5体节期，血管祖细胞被认为包含表达转录因子T细胞急性淋巴细胞白血病1（tal1，原称干细胞白血病基因scl）的细胞，而造血祖细胞则被认为包含共表达tal1和转录因子GATA结合蛋白1a（gata1a）的细胞。至5体节期，肾祖细胞区域的标志物包括配对盒转录因子pax2a、pax8以及基因LIM同源盒1a（lhx1a，原称lim1）。这些基因在15体节期仍持续标记肾祖细胞区域。

随着发育进程超过15体节阶段，肾前体间充质前体开始发生物理和形态重排，最终形成一对肾单位，这些肾单位以平行排列的方式分布于躯干两侧（图2(c)）。间充质肾单位前体转变为上皮状态（MET），经历肾小管发生过程并形成管腔。肾单位发生过程还涉及肾单位前体向空间上不同的上皮细胞类型节段进行区域分化26。通过对动态基因表达谱的分析可知，到28体节阶段时，肾单位节段的边界已形成，在此之前基因表达谱一直处于波动状态。最前端区域的肾单位前体分化为构成肾小球的足细胞，并表达威尔姆斯瘤1（Wt1）旁系同源基因wt1a和wt1b。位于剩余前端、中部和后端区域的肾单位前体则形成一系列肾小管节段，节段后方连接着导管。紧邻足细胞区域的前端细胞发育形成颈段，该结构连接肾小球与肾小管，其特征为表达纤毛发生相关转录因子调节因子X，2（影响HLA II类分子表达）。((r f x 2)^{26})。后续的肾小管包含两个近端节段和两个远端节段，这些节段由特定溶质转运蛋白基因的非重叠表达结构域所定义。例如，近端曲小管（PCT）节段表达溶质载体家族20成员1a（slc20a1a），近端直小管（PST）表达瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员7（trpm7），早期远端节段（DE）表达溶质载体家族12成员1（slc12a1），晚期远端节段（DL）表达溶质载体家族（钠/氯转运蛋白）成员3（slc12a3）26,30。DL节段连接至双侧原肾管（PD）节段，该节段由转录因子GATA结合蛋白3（gata3）的表达所定义，并与泄殖腔（C）相连形成共同的排泄通道。斯坦尼氏体（CS）也与肾单位相关联，它是在DE与DL节段边界处形成的双侧细胞簇，之后会定位于该区域的背侧26。斑马鱼原肾肾单位的节段结构遵循近端和远端结构域的典型模式，这一模式在从两栖动物到人类的各类脊椎动物中广泛保守，不过斑马鱼缺少哺乳动物中有助于尿液浓缩的等效中间节段或细段5。

在受精后24至48小时发生的形态发生事件将形成具有功能的原肾。这些事件包括肾小球的形成，该过程涉及足细胞前体向中线迁移，在此处它们招募血管并形成由一对肾单位共用的复合滤血器。此外，在接下来的几天里，近端曲小管会发生盘曲，肾小管各段也会发生区域性生长。尽管斑马鱼胚胎原肾在结构上相当简单，仅由这一对肾单位构成，但它足以支持幼体数周的生长，此时中肾将开始形成。在接下来的章节中，我们将探讨已知的引导间中胚层区域形成的信号、各肾单位细胞类型的形成过程，以及肾单位形态发生事件的调控机制。

前肾肾祖细胞区域的特化与早期模式建立——指导中胚层发育的事件对于正确的中间中胚层形成以及肾祖细胞区域的后续界定至关重要。中胚层发育与建立胚胎轴线的模式建立过程紧密交织，中胚层形成的异常会对肾祖细胞区域是否形成以及该区域沿前后轴线的定位产生显著影响（图3）。

中胚层诱导与背腹轴模式形成：腹侧中胚层的发育依赖于背腹（D-V）模式的建立以及胚胎轴的正确形成（图3(a)）。脊椎动物的背腹轴通过一系列事件建立，这些事件会导致骨形态发生蛋白（BMP）家族成员的活性呈现区域化分布；BMP家族成员通过其受体传递信号，激活SMAD家族转录因子成员。高浓度的BMP会指定腹侧命运并引发中胚层诱导。背侧区域的抑制因子会拮抗BMP的活性，这些抑制因子由组织者细胞分泌，能够促进背侧组织的形成。正常腹侧发育受到干扰时，胚胎会表现出背侧化表型，这会导致包含肾祖细胞区域的中胚层减少或缺失，这一点可通过pax2a的表达情况来评估³¹。斑马鱼胚胎中，若bmp2b（原名为swirl (swr)）³²,³³和bmp7a（原名为bmp7/snailhouse (snh)）³⁴所编码的BMP配体发生突变，其表达pax2a的细胞数量会出现最严重的减少；而若BMP受体激活素A受体1型样蛋白（acvr1l，原名为alk8/lost-a-fin/mini fin）³⁵⁻³⁷以及信号传导靶点smad5（原名为somitabun (sbn)/piggytail (pgy)）³⁸发生突变，则会导致该细胞数量出现较轻微的减少³¹。背侧发育的改变也会影响原肾腹侧命运的变化，细胞外BMP拮抗因子Chordin的功能获得与缺失实验就证明了这一点。Chordin的过表达以牺牲表达pax2a的细胞为代价促进背侧命运，而dino40突变体所编码的Chordin截短型则与表达pax2a的细胞区域扩大相关。

T-box转录因子与中胚层特化：前肾命运的进一步形成需要T-box转录因子的活性，这类因子在指导脊椎动物躯干和尾部中胚层的形成过程中发挥关键作用（图3(b)）。无尾a基因（ntla）是哺乳动物短尾（Brachyury，亦称T）基因的斑马鱼同源基因，它是一种参与中胚层发育的T-box转录因子42。ntla的表达受脊索和尾芽细胞的中胚层诱导调控，并驱动一套中胚层基因调控网络，该网络会影响形态发生运动、后部身份确定、肌肉与脊索特化以及左右模式形成43。ntla的靶基因数量众多，其中包括tbx16基因（原称为spadetail，简称spt）等其他T-box转录因子43，而tbx16又会调控躯干中胚层细胞命运的诱导及汇聚运动44,45。尽管单独缺失ntla或tbx16并不会消除肾祖细胞区域，但ntla/tbx16双缺陷胚胎无法形成肾祖细胞及其他中胚层衍生物，这表明这些基因以协同和/或冗余的方式发挥作用，共同促进前肾命运的形成46。

cdx基因与原肾域的轴向定位：斑马鱼原肾沿胚胎前后（A-P）轴的正确定位需要尾型同源盒（cdx）转录因子的部分重叠活性（图3(c)）。在斑马鱼中，cdx4和cdx1a在各胚层中功能冗余，通过影响同源盒（hox）转录因子的表达结构域来赋予前后轴的节段身份，同时还控制躯体后部的伸长，这一功能与哺乳动物中Cdx1、Cdx2和Cdx4的活性保守一致。cdx功能的逐步丧失会导致躯体后部截断，并使肾祖细胞结构域的前后轴位置发生后移。例如，肾祖细胞域的前缘通常紧邻第三体节发育，但cdx4纯合缺失胚胎的该结构域会后移至第五体节旁，而cdx4/1a双缺失胚胎的结构域则进一步后移至第七体节26。值得注意的是，仅缺失cdx1a不足以改变肾祖细胞域的轴向定位。cdx4纯合缺失胚胎中肾单位祖细胞域的后移还与远端节段的截断相关，尽管各肾单位节段均能形成。相比之下，cdx4/1a缺失胚胎出现的严重躯体后部截断，会导致包括近端小管（PST）和所有远端节段在内的多个节段缺失，且肾小管无法融合形成泄殖腔26。cdx4/1a缺失胚胎中肾单位节段的缺失可能受其轴向伸长表型的影响，因此未必反映cdx基因在肾单位远端节段模式形成中的直接需求。目前尚不清楚cdx基因是否通过中胚层或其他胚层中hox基因的全局调控来介导肾祖细胞域的定位，不过基于cdx在其他发育组织中的活性先例，这一观点具有合理性。

前肾区域的维持：锌指转录因子 odd-skipped related 1（果蝇）（osr1）基因的活性对于维持近端肾单位的命运至关重要（图3(c)）。osr1 在原肠胚期于中胚层中表达，随后在体节发生期，于肾祖细胞区域旁的侧板细胞双侧条纹中表达。敲低 osr1 会导致足细胞特异性缺失以及近端曲小管的片段缺。基于 pax2a 的表达情况，osr1 形态发生子在体节5期时肾祖细胞区域未受影响，这表明前肾的特化过程正常进行⁵²。然而，osr1 形态发生子从体节14期开始，pax2a 和 lhx1a 在中间体节前端的表达区域出现缩减，并且tal1+成血管细胞群出现伴随性扩张。osr1基因敲低也会导致内胚层扩张，且令人意外的是，当通过抑制内胚层关键转录因子SRY-box含基因32（sox32，原名为casanova（cas））或mixer（原名为bonnie and clyde（bon））的活性来减少内胚层时，osr1基因敲低胚胎中的pax2a表达可得到恢复52。这些发现揭示了内胚层来源的信号在原肾维持中的作用。这些数据还表明，osr1可能通过限制成血管细胞扩张或阻止原肾细胞向其他命运转化，直接维持原肾区域。由于pax2a过表达足以恢复osr1基因敲低胚胎中的近端命运，因此在osr1活性缺失的情况下，pax2a水平似乎是原肾维持的关键枢纽。

有趣的是，在体节发生早期抑制WNT信号通路会导致近端肾单位的缺失，这与osr1缺陷情况下近端小管缺失的表型相似⁵³。研究人员使用热休克诱导型Dkk1构建体，通过在12体节阶段启动的一系列热休克处理，在胚胎发生过程中抑制了WNT/ctnnb2（原称为β-连环蛋白）信号通路，最终导致72小时post-fertilization（hpf）胚胎的近端小管出现大小不一的缺失。未来还需进一步研究来明确WNT/ctnnb2缺陷是在何时以及通过何种方式消除近端区域的。一个值得探究的可能性是，WNT/ctnnb2信号通路的作用与osr1类似，可通过调控pax2a等靶基因来维持原肾区域。

近端-远端肾单位节段身份的模式形成——肾单位分节是肾单位形成过程中区域身份逐步确立的过程。在肾单位节段出现之前的体节发生阶段，肾前体细胞区域内的众多基因表达模式会发生动态变化。研究人员已鉴定出一些决定肾单位分节的关键事件和分子信号，但仍有诸多问题亟待解答（图4、图5）。例如，视黄酸（RA）的作用可调控肾前体细胞的数量，并将其细分为广泛的吻侧和尾侧区域，然而这些区域如何进一步区域化的机制尚不清楚。近期研究为指导足细胞谱系分化的信号提供了一些见解，但调控各肾小管节段模式形成的过程在很大程度上仍未明确，目前仅鉴定出少数关键必需组分。

前肾区域的视黄酸（RA）模式形成：在体节发生早期，基于基因表达和命运图谱研究，肾祖细胞区域会分化为多个肾单位祖细胞结构域（图4(a–c)）。在5-6体节阶段，一个宽阔的吻侧结构域紧邻2-5体节，以Notch配体基因deltaC（dlc）和jagged 2（jag2）的表达为特征；值得注意的是，紧邻2-3体节的一部分细胞也会表达wt1a，且注定发育为足细胞系。一个宽阔的尾侧结构域始于6体节旁，以锌指转录因子基因MDS1和EVI1复合位点（mecom，原名为evi1）的表达为标记。尽管这些吻侧/尾侧结构域最初看似相互排斥（图4(b)），但到8体节阶段，jag2表达的结构域会向尾侧扩张，在肾祖细胞区域中形成吻侧与尾侧区域重叠的嵌套模式（图4(c)）。这些早期分化的意义目前尚未阐明。然而，吻侧和尾侧区域的变化分别与近端和远端节段的形成改变密切相关。

图4. 肾单位祖细胞亚区的形成

多条证据表明，肾祖细胞区域在前/后区域的模式形成依赖于视黄酸（RA）信号通路，这一通路可使前部区域形成近端细胞特性。视黄酸生物合成缺陷的胚胎（无论是由于乙醛脱氢酶1家族A2成员（aldh1a2）基因缺陷导致）此前被称为raldh2/无颈（nls）/无鳍（nof））的突变体，或用二乙氨基苯甲醛（DEAB）进行可抑制醛脱氢酶（Aldh）酶活性的化学处理，会导致肾前端结构域缺失，后续无法形成足细胞和近端肾小管节段。近端细胞命运的丧失伴随尾端结构域的扩张，随后远端肾小管和导管节段也随之扩张、相反，暴露于外源性视黄酸（RA）会使肾前端结构域和近端节段扩张，而尾端结构域和远端节段则会缩小。这些结果表明，视黄酸（RA）是诱导近端细胞命运的关键因子，且可能抑制远端细胞命运的形成（图5）。值得注意的是，最有力的证据是视黄酸（RA）可诱导近端曲管（PCT）和近端直小管（PST）中的足细胞及转运上皮细胞形成，同时抑制集合管（CS）细胞以及背外侧管（DL）和后肾管（PD）中转运上皮细胞的生成；还需开展更多标志物分析，以更全面地评估视黄酸（RA）对颈节段等其他细胞类型的影响。原肾近远侧节段模式最显著的改变发生于原肠胚形成末期至体节形成早期，这一过程与肾间质（IM）前后端结构域的变化相关，这些变化最早可在8体节期被检测到。例如，二乙氨基苯甲醛（DEAB）处理会消除肾间质（IM）前端结构域，而醛脱氢酶1a2（aldh1a2）活性降低的突变体则表现为肾间质（IM）前端结构域缩短、尾端结构域扩张(IM^{26,27})。这些研究结果表明，视黄酸（RA）在早期发挥剂量依赖性作用，对肾祖细胞区域进行特化。此外，这些数据也提示，在此阶段内，肾祖细胞区域对视黄酸（RA）信号通路的改变具有响应性。

视黄酸（RA）是一种成熟的形态发生素，其发挥浓度依赖性的模式形成效应，该效应受发育组织中其产生与降解过程的调控。在肾祖细胞区域对RA具有响应性的时间窗口内，前部（或颈部）体节中胚层（PM）会分泌RA（图4(a)）。通过对(t b ×16^{27})进行敲低研究，证实了PM是为肾祖细胞区域形成模式提供主要RA来源的关键证据。Tbx16基因的敲除会减少体节中胚层的发育，并在5体节阶段显著降低体节中胚层区域中醛脱氢酶1A2（aldh1a2）的表达；后续研究发现，这些变化与肾单位近端节段缩短、远端节段扩张相关。值得注意的是，尾侧型同源盒基因（cdx）缺陷改变肾祖细胞区域位置的机制，似乎与早期体节发生过程中体节中胚层产生的RA活性在躯干组织中的轴向位置有关。cdx缺陷的程度逐渐加重，与aldh1a2表达结构域以及由细胞色素P450第XXVIA亚家族多肽1（cyp26a1）编码的RA降解酶的表达区域均向后方移位相关，这表明当Cdx功能缺失时，大片“生物可利用”的RA会沿躯干向后移位26。未来仍需开展更多研究，以确定RA的非体节中胚层来源，并进一步深入理解这些所谓RA“来源与汇”的动态变化如何影响肾单位的模式形成。值得注意的是，在体节发生后期，肾单位远端细胞会表达aldh1a2转录本，且在(24 hpf^{57})标记的RA转基因报告系统中呈现出活性。这些数据表明，RA可能在肾发生的后期阶段发挥额外的作用，甚至前肾分泌RA也可能是实现这一作用的机制之一。

对视黄酸（RA）影响肾单位祖细胞发育的另一维度的进一步研究，来自揭示组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂对肾祖细胞区域影响的研究。从受精后2小时（2 hpf）开始，用HDAC抑制剂4-苯基硫代丁酸（PTBA）、4-苯基丁酸（PBA）或曲古抑菌素A（TSA）处理，会在10体节阶段使肾祖细胞区域出现浓度依赖性扩张。当显性负效视黄酸受体α（DN-RARa）过表达时，胚胎中肾祖细胞的扩张受到抑制。这一发现表明，HDAC活性通过介导RA信号通路影响肾祖细胞区域的数量。肾小管节段祖细胞基因表达的动态性：指导斑马鱼原肾中每个特定肾小管和导管节段形成的机制在很大程度上仍不明确。在5-8体节阶段头侧/尾侧亚区出现后，许多转录因子和信号通路组件在肾祖细胞区域中表达²⁷。到15体节阶段，头侧/尾侧亚区进一步分化为肾单位祖细胞的一系列复杂重叠亚区²⁷（图4(d)展示了示例）。基因表达域似乎遵循由多个头侧、中央和尾侧域组成的嵌套阵列，分别以肝细胞核因子4α（hnf4a）、艾罗奎司同源盒蛋白3b（irx3b）和gata3等转录因子基因为标记²⁷。在肾发生过程中，这种嵌套模式既复杂又具有高度动态性。肾单位祖细胞在15至28体节阶段表现出基因表达的持续波动，且许多转录因子域逐渐缩小为更小的域（图6³⁵⁷e34a-132f-42e9-b7f3-9f42105816b8）。基因表达变化似乎并未反映肾细胞增殖的实质性改变，尽管可以推测细胞更新可能在15体节阶段之前或该阶段就已发挥作用²⁷。未来研究需要阐明基因表达组合的变化是否以及如何影响肾单位分节和/或上皮分化。迄今为止，转录因子pax2a和irx3b已被证实在肾发生中发挥重要作用（见下文讨论）。

图5. 肾单位基因调控网络

pax2a介导足细胞与颈部边界的调控：有证据表明，pax2a调控颈部节段是否从最前端肾祖细胞区域形成。在pax2a突变体无峡突变体（noi）中，pax2a功能缺失会导致24小时pf阶段wt1a转录本在颈部节段本该形成的区域异位表达。在后续时间点，这些细胞无法表达通常作为肾小管上皮细胞标记的Na+/K+ ATPase蛋白，转而表达分化足细胞的标记物血管内皮生长因子Aa（vegfaa，旧称vegf）。这些表型表明，足细胞基因程序已取代了颈部肾小管节段程序（图5）。对此结果的一种解释是，pax2a可能通过拮抗wt1a的活性，直接抑制足细胞的形成。

pax2a介导足细胞与颈部边界的调控：有证据表明，pax2a调控颈部节段是否从最前端肾祖细胞区域形成。在pax2a突变体无峡突变体（noi）中，pax2a功能缺失会导致24小时pf阶段wt1a转录本在颈部节段本该形成的区域异位表达。在后续时间点，这些细胞无法表达通常作为肾小管上皮细胞标记的Na+/K+ ATPase蛋白，转而表达分化足细胞的标记物血管内皮生长因子Aa（vegfaa，旧称vegf）。这些表型表明，足细胞基因程序已取代了颈部肾小管节段程序（图5）。对此结果的一种解释是，pax2a可能通过拮抗wt1a的活性，直接抑制足细胞的形成。

DE节段的形成与irx3b：在其他脊椎动物的肾发生过程中，已有研究报道了15至28体节阶段斑马鱼肾单位前体特有的多个区域化基因表达域5。其中，两栖动物前肾和哺乳动物后肾中的发育中肾单位表现出irx3b同源基因(Irx 3^{61})的集中式表达域。此外，在非洲爪蟾前肾中对Irx3的敲低研究61以及斑马鱼前肾中对irx3b的敲低研究27已证实，Irx3/3b功能对于形成slc12a1阳性远端小管细胞（对应斑马鱼中的DE节段）具有保守的必要性（图5）。值得注意的是，15体节阶段的斑马鱼肾单位前体在一个可能包含为近端曲小管尾部、近端直小管以及(DE^{27})贡献细胞的区域中表达(irx 3 b)转录本。irx3b的敲除使用吗啉代敲除技术可消除DE片段，这一点可从DE片段特异性溶质转运蛋白基因的表达缺失得到证实，而irx3b吗啉代 morphant 个体的PCT和PST片段会发生扩张²⁷。这些研究结果表明，irx3b会激活DE基因程序，并可能在协调PCT/PST边界形成中发挥作用²⁷。未来还需对肾祖细胞中表达的其他转录因子开展持续的功能缺失与功能获得性分析，以明确它们的功能，以及它们与pax2a、ponzr1和irx3b之间的相互关系。

图6. 肾小球和肾间腺体的发育

前肾成熟：细胞分化与形态发生

形成肾小球——成熟的脊椎动物肾小球是一种血液过滤装置，由血管内皮细胞和被称为足细胞的肾细胞构成⁶²。肾小球中央是有窗孔内皮细胞构成的毛细血管，其周围被足细胞上皮细胞包裹。这些细胞层之间存在肾小球基底膜（GBM），它是内皮细胞和足细胞基底膜的复合物，也是进入滤液的滤过结构的一部分。成熟足细胞从其基底表面沿肾小球基底膜伸出长的细胞突起，这些突起在末端细胞处呈树枝状分支，称为足突。相邻足细胞的足突相互交错，并形成独特的连接复合体——裂孔膜（SD），这一结构进一步限制大分子物质和细胞进入肾单位。尽管人们早就认识到足细胞源自构成肾单位的肾祖细胞，但指导足细胞特化和分化的通路尚不完全清楚⁶²。对斑马鱼足细胞形成的研究为足细胞祖细胞发育和分化的分子通路提供了一些新见解，其中许多或全部通路可能在高等脊椎动物中保守。已知斑马鱼前肾中的足细胞发育涉及视黄酸（RA）、转录因子活性和Notch信号传导指令的协调，这些指令从肾祖细胞群中确立了足细胞的身份（图5）。

足细胞谱系和肾间腺前体的进一步界定：斑马鱼足细胞祖细胞在中间中胚层形成后早期被特化²⁸，起源于紧邻3体节的双侧细胞群，最初共表达pax2a以及wt1a和wt1b²⁸,²⁹（图6）。尽管wt1a转录本存在于广泛的双侧细胞区域中²⁸，但wt1b的表达在发育过程中稍晚出现，其转录本可在15体节阶段出现在肾祖细胞区域内的双侧细胞簇中，并在整个足细胞迁移和肾小球形成过程中持续存在²⁹（图4(b–e)）。wt1a⁺和wt1b⁺细胞的重叠区域被认为是足细胞祖细胞²⁹。15体节阶段的足细胞祖细胞还可通过转录因子叉头框C1a（foxc1a）、lhx1a、v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因家族蛋白B（mafba，前称mafb）以及转录抑制子 hairy/增强子分裂相关YRPW基序1（hey1）的表达来标记⁶³,⁶⁴。随着体节发生的推进，足细胞会依次表达额外的成熟标记基因，这些基因使其能够形成裂孔隔膜的细胞间连接：例如在24小时胚胎期表达肾病1（芬兰型先天性）样蛋白（nphs1，前称nephrin）和足细胞黏蛋白样蛋白（podxl），随后在36小时胚胎期表达nphs2和整合素α3a（itga3a）⁶⁴,⁶⁵。仅表达wt1a的细胞的身份和命运尚未完全阐明。然而，在受精后20-22小时，在双侧wt1a阳性区域的相同位置出现了一群分散的独特细胞，这些细胞表达核受体超家族的Ftz-F1成员，即核受体亚家族5、A组、成员1a（nr5a1a，以前称为SF/，以及(ffl b)^{66})）（图6(b)）。nr5a1a阳性细胞发育为肾上腺，这是一群位于胚胎阶段足细胞后方的中线细胞簇⁶⁶。在受精后22-30小时之间，分散的nr5a1a阳性细胞发生形态发生运动，在中线处聚集形成一个中央簇（图6(c–d)）。形成后，肾间腺体作为内分泌器官发挥作用，被认为是硬骨鱼中对应哺乳动物肾上腺的结构。肾间腺体与肾上腺的共同特征是均为类固醇合成的主要场所。斑马鱼胚胎的肾间器官紧邻肾小球尾部分布，且随着中央肾间簇的形成，会表达类固醇生成相关基因（图6(e)）。

wt1旁系同源基因的差异表达模式提示了其存在潜在亚功能的可能性，这一观点已在吗啉代寡核苷酸研究中得到验证。wt1a基因敲低会导致足细胞数量减少，且足细胞无法表达成熟标志物。这些数据为视黄酸（RA）缺乏时足细胞丢失的机制提供了一种解释，因为RA水平降低会导致wt1a表达的丧失。对斑马鱼wt1a增强子和人类Wt1增强子的分析还发现了具有视黄酸反应性的保守基序。体外研究表明，斑马鱼wt1a和人类Wt1增强子可与视黄酸受体（RAR）转录因子及其伴侣蛋白视黄醇X受体（RXR）的异二聚体复合物结合，这为RA可直接调控wt1a/Wt1转录提供了有力证据]。wt1b的作用仍存在争议。有研究报道，wt1b基因敲低会导致成熟足细胞基因转录本的表达轻微下降，这可能意味着足细胞数量减少或其分化受阻]。研究还观察到，wt1b吗啉代寡核苷酸处理的胚胎会在肾小球区域形成充满液体的囊肿，并出现心包水肿，这表明其肾功能会随时间受损。然而，也有研究报道，同时注射wt1a和wt1b吗啉代寡核苷酸所呈现的表型与wt1a基因敲低相似，这提示wt1a缺乏症中的足细胞形成不依赖于wt1b的功能。综上，这些研究结果支持wt1a和wt1b可能在足细胞的形成与维持中发挥不同作用的观点。

近期针对wt1a、foxc1a以及Notch转录介导子免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白（rbpj）的研究，为揭示wt1a在前肾中确立足细胞命运的机制提供了新见解。以往研究表明，叉头转录因子FoxC2的活性与Notch通路是脊椎动物足细胞发育所必需的，但二者活性的协调机制至今仍不明确70-76。斑马鱼体节发生早期的基因表达结构域，与相关叉头因子foxc1a的活性及前端间介中胚层（IM）祖细胞中的Notch信号通路特征相符。编码dlC、锯齿状1b（jag1b，原称jag3）和jag2配体的转录本，存在于与wt1a/b+足细胞区域重叠或部分重叠的前端间介中胚层区；notch1a和notch3受体转录本分布于整个间介中胚层79；而rbpja和rbpjb转录本则呈普遍分布。通过吗啉代敲低wt1a、foxc1a或rbpja/b，可减少15个体节阶段wt1b+足细胞的数量。研究发现，需对其中多种因子进行双敲低才能完全消除足细胞，这一结果揭示了这些因子间存在遗传相互作用。在谷胱甘肽S-转移酶下拉实验（GST-pull-downs）和免疫共沉淀等生化分析中，研究人员发现斑马鱼Wt1a、Foxc1a、Notch 3胞内结构域（NICD3）与Rbpj之间存在物理相互作用。基于此，研究人员推测这些蛋白质通过形成多聚体转录复合物，协同调控足细胞的发育。

此外，结合发育过程中足细胞基因表达变化的时间顺序，有研究提出Wt1a/Foxc1a复合物在斑马鱼足细胞发育过程中以时间和化学计量依赖性的方式发挥作用，其分子组成会随着足细胞的成熟而发生相应变化。在足细胞祖细胞中，该复合物被认为依赖高水平的Notch信号通路来调控Hey1等Notch反应性转录靶基因⁶⁴。随着足细胞的成熟，有研究推测wt1a水平的升高会改变其组成该复合物结构复杂，能够激活成熟足细胞相关靶基因的转录，例如裂孔隔膜（SD）蛋白 NPHS1 等（对应标识：(nphs 11^{64})）。目前尚不清楚该模型是否适用于哺乳动物足细胞的发育过程。然而值得注意的是，研究发现鼠源 Rbpj、Wt1、Foxc2 与 Notch1 的胞内结构域（NICD1）的不同组合，在体外实验中可对鼠源 Hey1、Podocalyxin 启动子以及合成型 Notch 报告基因产生不同程度的激活作用。这些数据支持一种推测：这些蛋白质形成的物理复合物共同调控哺乳动物足细胞的发育，这为研究足细胞发育的分子调控网络提供了极具价值的模型，有待进一步深入探究。肾间腺祖细胞的数量也受wt1a和rbpj表达水平变化的影响⁶⁴。wt1a和rbpja/b形态突变体均会形成数量增多的nr5a1a⁺肾间腺祖细胞，而wt1a/rbpj双缺陷会导致其扩增更为显著。相反，仅改变foxc1a的表达并不会对nr5a1a⁺肾间腺祖细胞产生影响，但wt1a/foxc1a双缺陷会使nr5a1a⁺肾间腺祖细胞完全消失⁶⁴。这些研究结果表明，Wt1a、Foxc1a与Rbpj之间复杂的相互作用可能也参与了足细胞与肾间腺细胞命运的特化过程。这些因子是否协同调控肾间腺转录网络仍有待探究，但可以合理推测，它们通过不同组合形式和/或与其他辅助因子共同作用，来调控肾间腺细胞的命运决定。

肾小球组装与足细胞终末分化过程：肾小球的发育依赖于足细胞前体向中线位置的迁移，这些前体在受精后30-40小时聚合并形成单个肾小球（图6）。导致血液循环缺失的心脏缺陷也会破坏肾小球发生，且与足细胞未能正常迁移相关。足细胞在中线完成分化。随着足细胞分化，血管生成开始启动，这是对足细胞产生血管内皮生长因子（VEGF）的响应，该因子会从附近的背侧主动脉招募内皮细胞。足细胞的迁移受源自脊索的中线信号调控，对斑马鱼突变体floater head（flh）、sonic hedgehog a（shha，原名为sonic you，syu）以及GLI-Kruppel家族成员GLI2a（gli2a，原名为you-too）的分析已证实了这一点。flh突变体缺乏脊索，因脊索特异性螺旋-环-螺旋转录因子的缺陷，还同时缺失背侧主动脉，其足细胞无法发生迁移。尽管shha突变体胚胎能形成脊索，但这些突变均会降低Shh信号通路及其在响应组织中的转录效应。在这些中线突变体中，足细胞仍停留在侧方位置。有趣的是，flh突变体的足细胞会表达VEGF，并被内皮细胞包围，这表明flh突变体的足细胞可从非主动脉来源招募内皮细胞。通过荧光右旋糖酐摄取实验证实，flh突变体也存在肾小球滤过功能。

募集的内皮细胞会分泌细胞外基质，这对肾小球基底膜（GBM）的生成有促进作用，但有证据表明足细胞的分化与血管生成过程存在一定程度的解偶联。在缺乏内皮细胞的cloche（clo）突变体中，足细胞通过延伸的足突附着于基底膜，这些足突在(48 hpf^{84})处与相邻足突形成相互交错的结构。这些数据表明，足细胞分化的某些方面可自主进行。然而在受精后48小时和96小时，研究人员检测到了足细胞足突融合的位点，这说明在clo胚胎发育的后期阶段，肾小球基底膜的完整性和/或足细胞的维持功能受到了损害84。值得注意的是，足细胞和内皮细胞均表达非肌肉型肌球蛋白重链9a基因（myh9a），该基因编码非肌肉肌球蛋白IIa（NMHC-IIA）蛋白85。敲低斑马鱼NMHC-IIA会导致多种肾小球缺陷，包括内皮细胞无法形成窗孔、肾小球基底膜增厚、足突形态不规则，且与肾小球滤过率降低相关。这些研究结果表明，多种肾小球细胞类型可能利用共同的基因完成正常的发育过程。分化的足细胞具有多种独特特征，足细胞分化过程包括建立上皮细胞的顶-基极性、足细胞及足突与肾小球基底膜（GBM）的黏附，以及裂孔隔膜（SD）的正常表达与形成，以此构建出高保真的滤过屏障。斑马鱼足细胞上皮特性的某些方面依赖于由Crb同源物2b（crb2b）介导的细胞极性特征。crb2b是顶-基极性复合物的保守成员，自48小时胚胎形成期（hpf）起、在肾小球滤过开始后便由足细胞表达。吗啉代敲低crb2b会导致足突延伸异常、 nephrin表达紊乱及定位异常，同时引发足细胞足突消失。crb2b敲低胚胎的足细胞，其细胞体/细胞核的相对取向正常，肾小球基底膜也无异常。这些数据表明，crb2b并非建立整体顶-基极性所必需，而是通过优化足细胞极性，促进nephrin的正常定位，并助力足突的成熟。研究发现，Crb蛋白可与FERM结构域蛋白类红细胞膜蛋白带4.1 5（Epb41l5，该蛋白在斑马鱼突变体“镶嵌眼（moe）”中存在缺陷）结合，这为进一步研究crb2b提供了新的思路。Epb41l5缺陷突变体的足细胞，其顶端表面会形成异常的细胞突起。上述观察结果支持“epb41l5与crb2b可能协同作用以优化足细胞的上皮特性”这一假说。

足细胞必须合成并维持与肾小球基底膜（GBM）及邻近细胞的黏附，以调控肾小球的完整性。为完成这些功能，足细胞依赖于分支状的肌动蛋白细胞骨架，该结构被认为可为足细胞膜的延伸以及与肾小球基底膜的黏附提供机械支持。这种特殊的结构对足细胞的功能至关重要。对肌动蛋白相关蛋白Cofilin-1的破坏会导致裂孔（SD）完整性降低以及足细胞足突消失融合88。此外，研究表明，抑制裂孔相关成分的合成会损害肾小球完整性并破坏正常足突的形成，例如敲低nphs1和nphs2基因即可证实这一点65。有趣的是，近期研究发现肾小球完整性依赖于氨基酸转运蛋白溶质载体家族43成员1a（slc43a1a，原称为L系统氨基酸转运蛋白3，lat3）的表达。Slc43a1a定位于足细胞足突的顶质膜。在斑马鱼发育过程中敲低slc43a1a会导致肾小球塌陷和肾小球基底膜增厚，但该转运蛋白如何影响足细胞的生理功能目前尚不清楚。越来越多不同种类的蛋白质被发现其敲低会破坏肾小球功能，且/或与足细胞足突消失相关，这表明肾小球完整性涉及多种细胞通路，而这些通路的重要性才刚刚被人们认识到。

肾小管上皮细胞分化：顶-基底极性的建立与区域功能形成——原肾肾小管由四段相邻的转运上皮节段和其后的原肾管构成。这些相互独立的节段边界在28体节期形成，此时间充质细胞也从松散的间充质组织转变为上皮管，其中心为管腔，基底侧与细胞外基质相连²⁵（图7(a–b′)）。然而基因表达数据显示，上皮细胞群的分化在发育的第二天仍在持续²⁶。每个节段均表达特定的溶质转运蛋白基因，这很可能反映了上皮细胞的成熟/终末分化过程²⁶。至48小时胚胎期，已分化的肾小管上皮细胞呈现出更多极性特征，形成一根或多根初级纤毛，随着肾小球滤过的开始，管腔内也建立起液体流动（图7(c)）。

图7 肾小管上皮发育

(A) 在24小时受精后（28体节期），肾单位小管已完成间充质向上皮转化（MET），在横切面中表现为双侧小管结构。(B) cdh17::eGFP胚胎冷冻切片的免疫组化图像，右侧肾单位小管在(B′ ((B')))中放大显示；(B′)为单个肾单位小管横切面的数字放大（6.25倍），肾单位表现为绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞，上皮顶端表面检测到微管蛋白（浅蓝色，红色标注），细胞核经4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色），放大倍数60倍。白色标尺表示5微米。(C) 在48小时受精后，肾单位小管上皮进一步分化，近端小管（PST）和远端小管（DE）细胞中出现单个或多个纤毛细胞器，示意图为矢状切面（注：PST区域的细胞数量不代表实际PST节段的细胞数量）；上皮成熟与肾小球滤过的启动及小管内后续液体流动同步发生（蓝色箭头）。

上皮极性：肾小管各节段的共有与特有特征：在分化过程中，肾单位上皮细胞获得独特的顶-基底极性，并展现出与这种极化状态相关的、在脊椎动物中普遍存在的基本特征。极化上皮细胞的特征包括连接复合体、肌动蛋白以及由蛋白激酶C-ι型（prkci，原名为非典型蛋白激酶C）、 partitioning缺陷3同源物（秀丽隐杆线虫）（pard3，原名为par3）和partitioning缺陷6同源物α（秀丽隐杆线虫）（pard6a）编码的蛋白所生成的三元极性复合物等衔接复合物的顶端定位。已有研究表明，前肾小管存在Prkci的顶端表面定位92。有一种表现为基底外侧膜限制性的蛋白是(Na^{+} / K^{+}) ATPase25。在多种突变体和基因敲低实验中均观察到了顶-基底蛋白定位的破坏现象。例如，在吗啉代寡核苷酸敲低Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子11（arhgef11）后，可观察到(Na^{+} / K^{+}) ATPase的基底定位被破坏93。Arhgef11定位于前肾上皮细胞的顶端表面，可能在协调肌动蛋白细胞骨架方面发挥潜在的直接或间接作用93。然而，arhgef11敲低胚胎并未出现顶端表面Prkci等其他极性成分的破坏，这表明抑制Arhgef11并不能完全消除细胞极性93。同样，其他极性成分的缺失也未导致广泛的肾单位极性破坏，这与crb2b敲低胚胎的情况类似86。这些研究结果表明，上皮极性对肾单位功能至关重要，但对某些干预手段可能具有一定的耐受性。这种耐受性的程度以及其他极性成分之间的冗余机制，目前仍未完全明确。

斑马鱼原肾的各类上皮还表现出分节特异性的特征，其中近端曲细管（PCT）的特征研究得最为透彻。近端小管的一个保守特征是拥有广泛的内吞机制，用于大量回收低分子量溶质。斑马鱼的近端曲细管可对可追踪的葡聚糖结合物进行重吸收25（图8(a)），且已有研究证实这些葡聚糖结合物会与内吞机制相关蛋白以及早期内体标志物Rab4发生共定位94。顶端极性对于近端小管的内吞作用至关重要，有研究发现，心脏与灵魂（has）突变体中Prkci的缺失会扰乱Rab4阳性内吞过程，这一发现也印证了这一点95。斑马鱼近端曲细管利用保守的受体介导内吞机制，该机制在近端曲细管形成过程中组装，包含由低密度脂蛋白受体相关蛋白2a（lrp2a，原名为巨蛋白）编码的蛋白，以及由内因子-钴胺素受体（cubilin）编码的其结合伴侣（cubn）和果蝇Disabled同源物2（dab2）94,95。在受精后20小时（20 hpf）即可在近端曲细管中检测到lrp2a和dab2的转录本，而cubn的表达则始于受精后24小时（24 hpf）94,95。Lrp2a或Dab2功能缺失会导致重吸收失败，这可通过70千道尔顿荧光葡聚糖的摄取实验得到证实，同时也会破坏早期内体的运输过程95,96。这些研究结果表明，内吞作用在斑马鱼原肾近端曲细管上皮的正常重吸收过程中发挥着关键作用。

图8. 原肾近端小管的形态发生

(A) 近端曲小管（PCT）具有受体介导的内吞作用，可吸收溶质，这一点可通过40千道尔顿异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖结合物的吸收得到证实。（上图）2天胚胎龄（dpf）时注射FITC-葡聚糖的4天胚胎龄胚胎明场图像，呈侧面观；（中图）通过FITC滤光镜观察到的近端曲小管；（下图）单个近端曲小管的放大视图。(B) 近端曲小管卷曲形态发生，通过整体原位杂交检测slc20a1a转录本（紫色染色）后的背侧视图呈现。（上图）3天胚胎龄胚胎显示前端近端曲小管的“衣架状”钩状结构；（中图）4天胚胎龄胚胎已发生卷曲；（下图）5天胚胎龄胚胎的近端曲小管形成多个环和卷曲。

单纤毛或多纤毛肾小管细胞类型的出现：肾小管上皮细胞的分化还涉及纤毛发生。纤毛是肾细胞的重要细胞器，主要是因为纤毛在机械感觉转导和液体流动中发挥作用。肾小管中以镶嵌模式存在两种纤毛细胞类型：单纤毛溶质转运细胞（或初级纤毛细胞）和多纤毛细胞（MCCs）（图7(c)）。这两种细胞类型之间的转换依赖于Notch信号通路，由相邻肾小管祖细胞上的Notch受体与配体之间的相互作用介导（图5）。Notch信号通路调控多个多纤毛细胞命运相关基因的表达，例如纤毛发生转录因子rfx2。例如，(rfx2)最初在整个肾小管和导管肾单位祖细胞中广泛表达，直至约17体节期。在此时间点后，Notch信号通路会限制rfx2转录本在肾小管细胞中的表达，从而使细胞获得转运细胞的表型。用DAPT化学抑制Notch信号通路会导致多纤毛细胞扩增，而在6-7体节期过表达激活的Notch1a胞内结构域（NICD1a）（在双转基因hsp70:UAS/Gal4:Notch1aICD中由热休克调控）则会消除多纤毛细胞的形成79,97。这种分化机制在微纤毛细胞与转运细胞之间的相互作用属于经典的Notch侧向抑制机制，该机制分别形成了表达Jagged和Notch的细胞呈“椒盐式”分布的模式79,97。

纤毛发生过程涉及由叉头盒（Fox）家族的含叉头/翼状螺旋结构域的转录因子调控的基因网络。斑马鱼中存在Foxj1的两个旁系同源基因（foxj1a、foxj1b），它们在斑马鱼发育过程中的纤毛器官中表达，如底板中胚层（神经管/脊髓）、背前体细胞（DFC）/库普弗囊泡、耳囊和原肾管。研究发现foxj1a转录本在24小时胚胎期（hpf）的所有肾小管细胞类型中均一表达，但在48小时胚胎期的近端肾小管单纤毛细胞中表达下调，而foxj1a和foxj1b均存在于原肾管的多纤毛细胞（MCC）中。有趣的证据表明，Foxj1a在底板的表达依赖于刺猬蛋白发信号通路，而通过在推定的Lef1/Tcf结合位点进行转基因增强子敲除实验发现，Foxj1a在原肾管内的表达则依赖于WNT信号通路。Foxj1a可促进运动性纤毛转录组的特异性激活，表明其是纤毛结构组装的关键调控因子。已有研究证实，Foxj1a是激活运动性纤毛特异性组分所必需且足够的，这些组分包括：dnah9（动力蛋白，轴丝，重链9）、cetn2（中心蛋白2）、efhc1（含EF手结构域蛋白）、rfx2以及zgc:101797（原名为微管蛋白1）。然而，敲低foxj1a并不会完全破坏多纤毛细胞的纤毛运动性，这可能是因为原肾管中存在foxj1b的功能冗余。

前肾与斯坦尼乌斯小体的关系——前肾在发育上与一种名为斯坦尼乌斯小体（CS）的内分泌腺体相关联（图2）。斯坦尼乌斯小体存在于硬骨鱼和全骨鱼体内，其功能是维持钙稳态¹⁰¹。斑马鱼的斯坦尼小体源自前肾肾小管区域，即近端小管（DE）和远端小管（DL）节段相接的边界区域²⁶。斯坦尼小体前体细胞最早在受精后24小时以散在细胞的形式被检测到，这些细胞表达斯氏钙调节蛋白1样基因（stc1l，原名为stc1）、锌指蛋白转录调控因子类唾液样1a（果蝇）基因（sall1a）以及gata3基因。随后，斯坦尼小体细胞向背侧迁移，在受精后48小时聚集成一对双侧细胞团。目前尚不清楚在其他脊椎动物体内，斯坦尼小体细胞是否对应某一特定的肾细胞类型。有推测认为，斯坦尼小体细胞可能在进化上与致密斑相关，致密斑是哺乳动物远端肾小管中一组感知肾小球滤液溶质浓度并调节血压的细胞群⁵。

前肾管的形态发生与泄殖腔的形成——前肾的最后一部分即前肾管（PD），必须与外部环境融合以实现废物的正常排泄。同时引流肠道和前肾的共同开口被称为泄殖腔。在体节发生后期，前肾管将发生形态发生，并与腹侧尾细胞融合形成泄殖腔。因此，泄殖腔由两种细胞类型组成——即中间中胚层来源的前肾管和表皮细胞。前肾管细胞群的细胞黏附对这一过程至关重要，而钙黏蛋白17（肝-肠钙黏蛋白，cdh17）的缺失会导致前肾管无法在泄殖腔处正常融合。

泄殖腔的发育和正常形态发生也依赖于骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，该信号通路对于腹外胚层细胞的特化至关重要（图5）。BMP信号通路机制复杂，通过多种下游因子来发挥其作用。鉴于这种信号通路的复杂性，泄殖腔的形态发生依赖于包括细胞凋亡、细胞迁移和细胞重排在内的多种细胞过程。用绿色荧光蛋白（GFP，msxb-gfp）标记腹表皮细胞的研究表明，一个大型空泡化细胞会迁移至泄殖腔的预定位置。该表皮细胞融合至表皮的最腹侧部分以形成泄殖腔，且有研究推测其通过细胞死亡形成表皮上的孔道。终末肾细胞细胞几乎同时迁移以形成此腹侧孔。完成此次细胞迁移后，随着泄殖腔的形成，终末肾细胞呈现高柱状形态。通过针对gata3的核糖探针检测腹侧肾末端重塑的时间进程显示，肾末端在22体节阶段到达尾部的腹侧边界，并在25体节阶段形成外部开口。在胚胎形成泄殖腔之前，gata3的表达被限制在胚胎最远端（即假定的泄殖腔开口处）之外。关于gata3表达减少的一个合理解释是，泄殖腔形成前表皮细胞可能会迁移至肾末端上方。但目前尚未排除终末肾细胞死亡的可能性，而细胞死亡可使表皮细胞占据腹侧末端空间以形成泄殖腔。此外，已知野生型胚胎中假定的泄殖腔形成区域会发生细胞死亡。在可诱导抑制BMP信号通路的转基因胚胎中，不会发生细胞死亡，泄殖腔也无法形成。

被称为肾囊肿蛋白的纤毛蛋白会在纤毛基部形成复合物，在调节纤毛功能方面发挥作用，同时也与泄殖腔形态发生有关。例如，敲低肾性尿崩症4型（nphp4，旧称肾囊肿蛋白4）的胚胎在泄殖腔形成过程中也无法引发细胞死亡反应¹⁰⁸。尽管nphp4敲低胚胎的骨形态发生蛋白（BMP）信号级联完整，但少数胚胎无法形成正常的泄殖腔，随后在预计的泄殖腔开口部位出现膨大的囊性积液。有趣的是，同时敲低nphp4和分区缺陷6同源物γ B（秀丽隐杆线虫）（pard6gb）后，泄殖腔发育异常的胚胎数量显著。对这些双敲低胚胎的延时成像显示，其迁移过程存在缺陷，缺乏野生型胚胎中通常朝向表皮延伸的细胞突起¹⁰⁸。正如不同基因异常所揭示的那样，干扰泄殖腔形态发生的相关环节会引发严重后果，包括生物体无法排泄废物，最终导致死亡。

前肾功能启动与肾小管形态发生

流体流动的关键作用：目前已知，流体流动在斑马鱼原肾的形态发生过程中发挥着至关重要的作用。如前所述，肾小球大约在受精后48小时开始发挥功能，紧随内皮细胞侵入和血管界面形成之后发生。研究人员通过向斑马鱼胚胎的循环系统注射荧光共轭葡聚糖分子，然后检测葡聚糖是否能在肾单位管腔和近端上皮细胞中被观察到，以此评估肾小球滤过作用。在受精后33至36小时注射葡聚糖的胚胎未出现管腔荧光，而受精后48小时的胚胎则在肾单位管腔和染色明亮的膜囊泡中均观察到荧光²⁵（见图8(a)）。滤出液一旦离开肾小球，便会通过运动性纤毛推动其在肾单位中流动。纤毛驱动的流体流动是原肾正常发育所必需的，同时也介导肾小管损伤反应（将在下一节中讨论）。纤毛形成或功能缺陷会导致肾囊肿形成，此时肾单位内会积聚液腔，扰乱肾脏的持续活动⁷,⁸（见侧边栏方框1）。

纤毛与囊性肾病

纤毛是一种由质膜包裹、从细胞顶端向外突出的细胞器，其中心为微管轴丝。真核生物的纤毛通过鞭毛内运输过程组装并维持，在这一过程中，蛋白质组分沿轴丝以顺向和逆向两种方式被运输。目前相关条目已超过2600条从纤毛蛋白质组数据库（www.ciliaproteome.org）中可清晰看出纤毛复杂性的相关证据。纤毛功能障碍与多种不同类型的肾脏疾病相关。纤毛的两项主要功能——流体流动和机械感觉转导的丧失，似乎是引发这些肾脏疾病的重要因素。这表明纤毛是维持肾脏正常功能的关键基石。大量研究表明，斑马鱼是模拟多囊肾病病理生理学的极佳模型系统。例如，多囊蛋白（PC1和PC2）的突变均定位于纤毛，会导致常染色体显性多囊肾病（ADPKD），这是人类最常见的遗传性疾病。PC1和PC2的斑马鱼突变体可出现肾囊肿，并重现多囊肾病的诸多病理特征。因此，斑马鱼模型为在体内研究纤毛生物学及其功能障碍提供了可能。相关研究也不断为纤毛发生以及包括平面细胞极性（PCP）通路在内的其他细胞机制带来新见解，而平面细胞极性通路也被证实与肾脏疾病进展有关。

肾小管形态发生与细胞集体迁移：在48小时胚胎（hpf）流体流动开始后，肾小管节段的解剖位置和大小在接下来几天的发育过程中发生显著变化（图8）。远端肾小管节段的基因表达区域会扩张，并逐渐占据更前端的位置。这些变化伴随近曲小管（PCT）的形态发生，其逐渐盘曲，变得更向前端浓缩且卷曲（图8(b)）。近曲小管节段首先呈现出类似“衣架”或发夹状的独特形态，随后形成袢和盘曲结构（图8(b)）。此外，远曲小管（PST）区域会扩大体积，并沿躯干向前端移位。有趣的是，延时活体成像已捕捉到远端细胞群在受精后28.5小时至84小时期间以前向方式迁移。针对这一现象的一种解释认为，远端细胞以集体单元的形式逆流而上，朝着肾小球方向迁移。研究推测，这些肾小管细胞会保持上皮细胞特性（包括顶-基极性和连接复合体），并以前向方式集体迁移。即使在细胞增殖抑制剂喜树碱的作用下，远端小管中仍观察到了集体细胞迁移现象，这表明细胞运动并非仅由肾单位生长驱动。不过，这些数据并未排除细胞增殖在原肾形态发生过程中发生的可能性，而是表明在短时间内抑制细胞增殖并不会完全破坏形态发生过程。实际上，在生命的第一周内，细胞增殖很可能最终会促进原肾的生长。

钙以及作为阳离子通道蛋白的多囊蛋白的缺乏，揭示了这些成分与细胞集体迁移之间的潜在相互作用。早期发育阶段（约受精后16小时）的钙信号传导，在早期原肾原基的与会聚相关的细胞定位和形态形成中发挥着重要作用18。此外，一种保守的钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚型——钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaM激酶）IIγ1（camk2g1），被证实存在于斑马鱼肾脏中，并定位于该部位，时间为受精后30小时。研究发现，camk2g1的激活依赖于多囊肾病2（pkd2）基因编码的TRP离子通道PKD2所调控的钙水平。在PKD2和camk2g1的吗啉代寡核苷酸敲低胚胎中，前肾管的卷曲结构均减少，这一现象被归因于前部细胞迁移失败。也有证据表明，肾前上皮的集体细胞迁移需要流体流动。据报道，远端肾单位阻塞和肾小球滤波异常均会消除近端小管卷曲和细胞集体迁移。这些发现有力表明流体流动影响小管形态发生。鉴于此，值得注意的是，PKD2和Camk2g1 morphant胚胎在纤毛数量和长度上也存在缺陷。这些缺陷可能会扰乱流体流动，并间接导致细胞集体迁移出现异常。需要进一步阐明流体流动动力学和细胞集体迁移的机制，以厘清这两个过程之间的相互关联。

前肾对损伤的动态管状反应与急性肾损伤模型——在生命的第一周，前肾具备由纤毛机械感觉细胞器介导的损伤反应能力，其中前肾管腔直径的增大可提高纤毛摆动频率⁹⁹。纤毛摆动频率的这一升高与流体流动的相应增加，与扩张的肾小管节段中foxj1a基因表达的上调密切相关。此外，foxj1a基因是维持多纤毛细胞（MCC）摆动频率最大增幅所必需的，因为foxj1a基因敲低胚胎在损伤后纤毛摆动频率的反应性减弱⁹⁹。肾单位的机械阻塞以及fleer（flr）等囊性肾病突变体均表现出foxj1a基因表达的上调⁹⁹。研究发现，foxj1a基因表达的上调发生于囊性扩张之后，且有趣的是，该基因表达仅在发生上皮扩张的机械阻塞部位近端的肾小管节段中升高⁹⁹。这一发现提出了一种假说，即基于上皮拉伸的机制激活了foxj1a基因的表达。

在肾小管损伤的背景下，有研究为肾单位内存在进一步的动态性提供了有趣的证据：研究人员通过细胞消融技术选择性破坏近端小管上皮细胞。消融后观察到上皮间隙，并通过上皮细胞标志物的整体原位杂交技术得到了证实。当培育肾单位受损的胚胎时，数天后检测到完整的肾单位肾小管，这提示上皮细胞发生了再生。目前尚不清楚这些细胞的来源，但一种可能性是附近上皮细胞的集体迁移和增殖。这些观察结果表明，斑马鱼将成为研究肾上皮再生的理想模型¹¹³。

胚胎期前肾也被用于研究肾毒性抗生素氨基糖苷类的庆大霉素所引发的急性肾损伤。向心脏静脉窦或主静脉注射庆大霉素，会导致肾小球滤过率呈剂量依赖性下降、肾小管细胞死亡、上皮细胞从基底膜脱落、肾小管扩张以及严重水肿形成，最终引发死亡。注射顺铂药物会引发类似的肾单位毒性，同样导致肾小管上皮细胞脱落和水肿。这两种肾毒性模型均展现出人类在接触庆大霉素或顺铂后出现急性肾损伤的典型特征。因此，胚胎接触庆大霉素或顺铂可作为研究肾损伤相关事件的模型，还可用于筛选在临床环境中能够预防、减轻或加重肾单位损伤的药物。

最近，有研究报道了一种可诱导的前肾损伤模型，该模型构建了转基因系统以损伤足细胞。研究人员对转基因斑马鱼进行基因工程改造，使其在斑马鱼足细胞特异性启动子nphs2的控制下表达细菌硝基还原酶（NTR）。当加入前药甲硝唑时，无论是胚胎还是成鱼体内的足细胞都会发生损伤。该研究表明，NTR-甲硝唑系统也可用于构建可诱导的肾小管损伤模型。由于细胞损伤程度与甲硝唑剂量相关，与庆大霉素模型类似，且对于无法使用激光消融技术的研究人员来说，NTR系统或许能提供一种在不发生肾衰竭的情况下，精准调控特定前肾肾小管节段损伤程度的方法。造血干细胞的定植——受精后约5天（dpf），斑马鱼的前肾成为造血干细胞（HSCs）的定植场所。造血干细胞迁移至肾小球区域，并可在肾小管的迁移路径中被检测到。在幼鱼期剩余时间及成年期，造血干细胞均与斑马鱼的肾单位肾小管相伴存在。这一特征使斑马鱼的前肾和中肾区别于哺乳动物等许多高等脊椎动物，后者的骨髓是成年造血干细胞的微环境及造血作用发生的场所。

斑马鱼中肾的发育

中肾的发育始于生命约2周后，此时幼体生长至体长约4–5毫米，发育过程表现为在已存在的原肾小管上新增肾单位（图9(a)）。新的肾单位由与原肾小管相关的单个间充质细胞生成。最初的肾单位出现在保守的空间位置，即第六体节腹侧、鱼鳔正后。中肾中新肾单位的生成以多个发育基因的类似表达为特征。例如，在由lhx1a启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的转基因品系中，单个间充质细胞呈现报告基因表达。当幼体体长达到4毫米（对应约10天胚胎期）时，lhx1a::eGFP阳性细胞具有迁移性，可观察到其沿原肾小管移动¹²²。这些间充质lhx1a:eGFP阳性细胞先聚集，随后扩张形成细胞团¹²²（图9(b)）。该细胞团伸长形成与原有原肾紧密相连的肾小管样结构（图9(b)）。随着新肾小管伸长，通过其他转基因报告基因检测到了区域基因表达的变化（图9(b)）。新肾单位与原肾连接处的细胞表达lhx1a::eGFP，远端肾小管区域以pax8::DsRed为标记，wt1b::eGFP则标记近端肾小管和肾小球区域¹²²（图9(b)）。当幼鱼生长至体长5毫米（约13天胚胎期）时，已形成伸长的肾小管¹²²。这些研究结果表明，肾发生过程极为迅速，仅在数天内即可完成。

图9. 中肾发育：向原肾中添加肾单位

（A）（上图）斑马鱼幼鱼在约10-14天胚胎期（体长约4毫米）时，开始中肾发育。图中标示了下方放大的前肾区域。（左下小图）单个lhx1a阳性的间充质细胞最初出现在鳔附近的远曲小管旁，即星号（绿色）标示区域。（右下小图）随着时间推移，中肾小管（粉色）不断新增，形成密集的肾单位群，最终与一对前肾单位（蓝色）相连。（B）图示肾小管发生过程。单个lhx1a阳性细胞增殖并在紧邻现有前肾小管的位置形成细胞团。数天内，lhx1a阳性细胞快速增殖并形成肾小管，最终该肾小管呈现出表达lhx1a（绿色）、pax8（紫色）和wt1b（粉色）的细胞极化基因表达区域。

随着幼体持续生长，更多新的肾单位原基聚集并伸入已存在的肾小管，形成肾小囊，肾小囊随后发育为新的肾单位。随着时间推移，在鳔前方的区域以及肾小管最远端区域，可观察到新的肾小囊与前肾相关联。幼体生命期间持续的肾发生过程形成了由数百个肾单位组成的中肾（图9(a)）。基于中肾小管与前肾肾单位形成引流连接这一观察结果，前肾成分似乎会长期存在，并逐渐转变为类似集合管的功能。事实上，成体中肾包含两条平行的中央集合管，因此推测这些导管是原始前肾的残余（尽管很可能已发生重塑）颇具吸引力。需进行命运图谱研究以明确确定前肾与中肾成分之间的关系。成体中肾位于体腔背壁（图10）。中肾具有独特的区域：位于头侧位置的头部区域，其后依次为鞍状区和尾部区域（图10(a)）。中肾中的肾单位展现出与前肾相似的分节模式。例如，它们表现出近端曲小管、近端直小管、远曲小管和远直小管标记基因的限制性表达。有趣的是，在成体肾脏中检测到了分支状的远曲小管和远直小管节段，这表明肾单位可在现有肾单位的多个位置新增。肾单位之间散布着由造血干细胞、多种血细胞衍生物和肾前体细胞构成的致密基质（图10(a, b)）。

图10. 成体中肾

(A)（上）成年斑马鱼，粉色框标注中肾的背体壁位置。（中）中肾的背侧示意图，包含头部、躯干和尾部区域；腹侧位置的肾间腺体大致位置用星号（*）标注。（下）中肾分支管状网络示意图。 nephron 的风车状分支阵列汇入大收集管。间质基质包含造血干细胞（HSC）（浅蓝色）、血细胞（粉色；未标注具体谱系）和肾祖细胞（绿色）。基质中还可能包含其他尚未被鉴定的间充质细胞类型。(B) 经苏木精-伊红染色的石蜡包埋成年肾脏组织学切片（60倍放大）。肾小球（G）、肾小管（T）和血液（b）区域用黑色箭头标注。

中肾单位的绝对数量与动物的体型呈线性关系。尽管中肾不同区段的单位密度存在差异，但成年斑马鱼中肾特定区段的单位密度却高度一致。这使得研究人员可根据单位密度将成年斑马鱼中肾划分为四个区域：前部单位密集区（ANDR）、中部单位稀疏区（MNSR）、中部单位密集区（MNDR）和后部单位稀疏区（PNSR）。这种分段式的单位密度分布表明，新形成的单位在空间排布上受到一定程度的调控。然而，目前尚未发现支撑这一调控机制的分子证据，也缺乏相关的深入认知。

成年中肾与前肾一样，也与肾间腺组分相关。头部肾脏左右叶各自内部嵌有双侧肾间腺⁶⁶（图10(a)）。这些腺体位于腹侧，可通过类固醇生成基因细胞色素P450亚家族XIA多肽1（cyp11a1，旧称侧链裂解酶scc）的表达，在整体原位杂交分析中被鉴定。需进行命运图谱分析，以确定成年肾间腺的起源，并明确其与单一胚胎肾间腺簇的关系。

成年中肾的新肾单位生成

在成年期，斑马鱼的身体仍会持续生长。中肾会不断新增肾单位，同时对现有肾单位所受的损伤具有较强的修复能力，在受损后能够再生肾单位上皮细胞。此外，研究人员通过探究庆大霉素对成年斑马鱼的影响发现，分布在中肾整个基质中的肾祖细胞在损伤后可生成全新的肾单位（图10）。这些肾祖细胞表达pax2a、pax8、wt1b和lhx1a等多种转录因子，这表明其与幼体阶段形成中肾的生肾原基前肾单位前体细胞及间充质前体细胞存在诸多相似之处。

研究人员利用细胞分选和移植技术分离出了这些成年斑马鱼肾祖细胞，并通过lhx1a和wt1b转基因技术对其谱系潜能进行了表征。lhx1a阳性的肾细胞聚集体可被移植到成年受体体内，其子代细胞会在与移植部位不同的位置形成新的肾单位。此外，新生成的肾单位能够功能性整合到受体肾脏中。这些开创性的实验提供了有力证据，证明在lhx1a标记的(I h x 1 a^{+})细胞聚集体中存在能够从头形成肾单位（即新肾发生）的肾祖细胞。值得注意的是，将供体的lhx1a阳性/wt1b阳性细胞移植到肾脏功能受损的预处理受体体内，并未形成移植的肾单位¹²²。这一发现表明wt1b表达的变化反映了肾祖细胞潜能的改变。

对以lhx1a表达为标志的肾祖细胞群的进一步研究，揭示了斑马鱼新肾生成中一个有趣的例外情况。研究反复证实，单个lhx1a (I h ×1 a^{+})细胞在肾脏受损的条件个体中无法生成新的肾单位。这表明新肾生成的潜力可能依赖于lhx1a (lhxia)细胞群内的“群体效应”，而缺乏该效应时，细胞形成新肾单位的能力便会丧失。与这些发现一致的是，激光消融研究证实，正常中肾肾单位的形成是细胞自主过程，即消融一个(lhx 1 a^{+})细胞群不会对邻近细胞群产生影响。因此，尽管(lhx 1 a^{+})聚集体是在中肾内启动肾发生所必需的，但该聚集体内不同细胞之间的干性特性、细胞相互作用以及超微结构仍不明确。

结论

对斑马鱼肾脏发育的研究为肾脏个体发育的持续探索提供了坚实的基础。展望未来，肾脏病学中的几个主要问题可以通过对斑马鱼的未来研究来解决。首先，斑马鱼前肾的保守节段解剖学提供了一个遗传系统来识别分割途径。对肾发生的洞察可能会提供有用的信息来理解先天性肾缺陷的原因，并可能建议治疗方法。前肾肾上腺对损伤做出反应的能力为研究急性肾单位损伤提供了机会，这在人类中仍然是一种知之甚少且具有破坏性的疾病。最后，了解中肾发育和成人稳态期间调节肾祖细胞的途径可能会导致识别其哺乳动物对应物，或者揭示如何刺激成人的再生途径。因此，斑马鱼模型的属性为研究人员提供了丰富的令人兴奋的机会，以便在未来几年内在理解这些现象方面取得进展。