在 syngap1a 和 syngap1b 斑马鱼自闭症模型中情境依赖的过度活跃行为

题目：Context-dependent hyperactivity in syngap1a and syngap1b zebrafish autism models原文链:https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2024.1401746

期刊:Frontiers in Molecular Neuroscience

摘要

背景与目的：SYNGAP1 综合征是自闭症谱系障碍与智力障碍（ASD/ID）的一种常见遗传形式，由SYNGAP1基因单拷贝的新发突变或遗传突变引起。除了ASD/ID外，SYNGAP1综合征还伴随多种共病症状，包括耐药性癫痫、睡眠障碍以及胃肠道不适。这些多样症状与SYNGAP1变异体之间的机制联系仍不明确，因此，本研究的目标是构建一种斑马鱼模型，以研究该综合征的各类症状。

方法：我们利用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼同源基因syngap1a与syngap1b（合称syngap1ab）中引入移码突变，并验证了这些稳定模型存在Syngap1功能缺失的情况。由于SYNGAP1存在广泛的可变剪接，我们将剪接变体定位到斑马鱼的两个syngap1a和b基因上，并鉴定出与哺乳动物相似的异构体。随后，我们在三种通常能诱发野生型斑马鱼幼体不同觉醒状态的条件下，对syngap1ab幼体的运动行为进行了量化分析，这三种条件分别为厌恶性高觉醒声学刺激、中等觉醒黑暗刺激和低觉醒光照刺激。

结果：本研究证实，斑马鱼syngap1a和syngap1b基因中的CRISPR/Cas9插入缺失突变在RNA和蛋白质水平上均产生了功能缺失等位基因。对斑马鱼Syngap1同工型的分析表明，与哺乳动物一样，斑马鱼Syngap1的N端和C端存在广泛的可变剪接。本研究鉴定出一种仅定位于syngap1b基因的斑马鱼syngap1 α1样变异体。运动行为量化分析显示，与野生型相比，syngap1ab突变体幼鱼表现出过度活跃，且过度活跃的程度因刺激类型而异。在低唤醒状态下，过度活跃现象最为显著，且整体运动幅度随突变syngap1等位基因数量的增加而升高。

结论：我们的数据表明，斑马鱼syngap1ab基因的突变是导致与觉醒水平升高相关的多动症状的原因，这种症状在低觉醒环境中尤为显著。

引言

由于它们仅靶向斑马鱼两个重复 syngap1 基因中的一个 (Colon-Rodriguez et al., 2020; Griffin et al., 2021)。

哺乳动物 SYNGAP1 mRNA 在 N 端和 C 端存在广泛剪接，C 端亚型 α1、α2、β 和 γ 已被功能鉴定 (McMahon et al., 2012; Araki et al., 2020; Gou et al., 2020; Kilinc et al., 2022)。α1 亚型通过一个四个氨基酸的 PDZ 相互作用结构域富集于谷氨酸能突触的突触后致密区，该结构域使其能与突触支架蛋白 PSD-95 相互作用 (Chen et al., 1998; Kim et al., 1998; Komiyama et al., 2002)。在此，我们注释了斑马鱼 mRNA 如何对应这些哺乳动物亚型，并将斑马鱼亚型定位到 syngap1a 和 syngap1b 基因上。

SYNGAP1 综合征患者表现出感觉过度活跃，有时甚至是癫痫发作，以响应进食、光、声、触觉和/或疼痛等感觉刺激。这些症状是 SYNGAP1 患者家长和护理人员主要担忧的问题，因为它们可能危及患者生命 (Vlaskamp and Scheffer, 2020; Lyons-Warren et al., 2022)。与人类症状一致，啮齿动物模型也表现出感觉诱导的过度活跃以及可由巨大声音诱导的癫痫发作 (Guo et al., 2009; Ozkan et al., 2014; Michaelson et al., 2018; Creson et al., 2019; Sullivan et al., 2020)。为了评估 syngap1ab 斑马鱼突变体的感觉诱导行为，我们使用了两种标准的感觉运动测定法：用振动诱发声惊吓反应 (ASR) 以及用光暗转换诱发视觉运动反应 (VMR) (Emran et al., 2008; Gao et al., 2014; Dunn et al., 2016)。由于感觉习惯化的改变可能导致 SYNGAP1 患者的感觉处理问题 (Tavassoli et al., 2014; Robertson and Baron-Cohen, 2017; Oldehinkel et al., 2019)，我们还进行了一项短期习惯化测定，以观察 Syngap1ab 斑马鱼幼虫对快速连续呈现的超阈值刺激的行为反应。

与哺乳动物模型一样，我们的斑马鱼 syngap1ab 突变体模型在 ASR 和 VMR 测定中均表现出过度活跃。过度活跃在应对厌恶性声刺激时最不显著，而在低觉醒光照条件下最为显著。通过分析运动距离和静息时长的频率分布，我们发现 syngap1ab 模型的过度活跃是由于更高频率、更大规模的运动，这些运动类似于与觉醒状态升高相关的目标导向行为。

方法

斑马鱼的饲养与管理

本研究中使用的所有斑马鱼幼鱼和成鱼均在迈阿密大学斑马鱼养殖设施中按照动物伦理委员会（IACUC）第18-129号方案饲养。水温维持在28摄氏度，成鱼和幼鱼均处于14小时光照/10小时黑暗的昼夜节律环境中。养殖成鱼的水体持续监测pH值和电导率，以维持最佳养殖条件。胚胎收集后，置于10厘米培养皿中饲养，培养皿每日清洁，以防真菌滋生——真菌会限制氧气供应并阻碍胚胎早期发育。用于行为学实验的幼鱼，每个培养皿饲养约50尾，以减少幼鱼间的竞争和发育迟缓问题。

利用CRISPR/Cas9技术构建syngap1ab突变斑马鱼

使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术生成 syngap1ab 突变体。将设计用于靶向 syngap1a 基因第 4 外显子和 syngap1b 基因第 5 外显子的小向导 RNA (sgRNA; Integrated DNA Technologies-IDT) 与 Cas9 蛋白按 1:5 的比例混合，注射到一细胞期的野生型胚胎中。为了最小化 sgRNA 竞争并便于测序，每个胚胎仅注射 syngap1a 或 syngap1b sgRNA。将产生的嵌合 F0 代幼虫饲养至成鱼，并与野生型动物杂交以产生 F1 代，用于测序以鉴定由 CRISPR 编辑产生的带有插入缺失突变的 syngap1a 和 syngap1b 突变等位基因（见下文）。鉴定出突变 syngap1a 和 syngap1b 等位基因后，将它们进行内交以获得 syngap1ab 双突变体。成年 syngap1ab 突变鱼跨越 F2-F5 代，具有不同的 syngap1a 和 syngap1b 等位基因组合。在后续实验中，将成年雄性 *syngap1ab-/-* 与 WT (AB/TL) 雌性外交以获得 *syngap1ab+/-* 幼虫，并与 *syngap1ab-/-* 内交以获得 *syngap1ab-/-* 幼虫。为简化起见，在 syngap1a 和 syngap1b 基因上均为杂合的斑马鱼记为 *syngap1ab+/-*，在两个基因上均为纯合的斑马鱼记为 *syngap1ab-/-*。本研究中使用的所有野生型 (WT) 幼虫均为 AB/TL，除非另有说明，记为 *syngap1ab+/+*。

本研究使用的syngap1ab等位基因

通过从每一条麻醉（200毫克/升三卡因（MS-222））的F1成鱼身上取少量尾鳍样本，确定了CRISPR等位基因的分子身份。通过在50微升50毫摩尔/升氢氧化钠溶液中消化每一份鳍样本，提取基因组DNA，在95摄氏度下孵育1小时。若需确定幼虫基因型，将每只幼虫置于冰上麻醉30分钟，或使用200毫克/升的Tricaine（MS-222）进行麻醉。待幼虫完全麻醉后，采用前述方法提取其基因组DNA（gDNA）样本。

补充图1 斑马鱼syngap1a和syngap1b突变等位基因的基因分型。a) 展示了每个突变等位基因的Syngap1a和b蛋白示意图，红色竖线表示每个移码突变的位置。红线下方的红色字体标注了移码突变的详细信息，包括原始氨基酸的位置、突变后的氨基酸类型，以及终止密码子截短前新增的后续氨基酸数量。每个示意图下方有两张电泳图，上方为野生型序列，下方为突变序列。每张电泳图上方标注了对应的密码子和氨基酸。b) 展示了每个等位基因的基因分型凝胶。对于syngap1a1，野生型序列中包含BmgB1限制性酶切位点的2号外显子片段在syngap1a1中被破坏。syngap1a2存在22个碱基的缺失，可通过对突变位点侧翼的2号外显子进行PCR扩增，直接通过条带大小变化检测到。对于syngap1b，野生型中包含DpnII限制性酶切位点的5号外显子片段在syngap1b突变等位基因中被破坏。

使用 Primer3 软件设计了针对这两个基因的基因特异性引物（见表1）。使用 Primer3 软件设计了针对这两个基因的基因特异性引物（见表1）。基于每个基因的 Cas9 靶向区域，选取了用于 Primer3 输入的序列。进行PCR扩增时，每个反应混合物均含有5微升10倍浓度的GOTaq聚合酶（普洛麦格公司），从每 10 微摩尔的 syngap1a 正向引物和反向引物中各取 0.5 微升，或从……中取 0.5 微升各10微摩尔的syngap1b正向引物和反向引物（IDT公司）、3微升无核酸酶水水，以及1微升基因组DNA（来自幼鱼或鱼鳍组织消化物）。得到的聚合酶链式反应产物被送去进行测序（由欧陆芬基因科技公司完成），测序结果随后使用 ApE——质粒编辑器 v2.0.61（Davis 和 Jorgensen，）进行读取和分析2022）和 SnapGene Viewer 软件来确定 syngap1a 和 syngap1b 突变体等位基因（补充图1）。

表1 用于基因分型和qPCR的syngap1引物

syngap1a和syngap1b亚型鉴定

为确定斑马鱼 syngap1ab 的剪接变体/同工型，获取了mRNA序列（包括已发表和预测的序列）均从 NCBI 蛋白质数据库获取。为检测 </response>为检测异构体表达的证据，将这些序列与表达序列标签（EST）和转录组鸟枪法组装（TSA）数据库进行了比对序列标签（EST）和转录组鸟枪法组装（TSA）数据库随后将表达的同工型与UCSC斑马鱼基因组浏览器进行BLAST比对以鉴定独特、共有及可变剪接变体，从而更完善地注释已有的 syngap1ab 同工型（图 1）。

定量聚合酶链反应（qPCR）

为检测 syngap1ab 突变体中是否存在无义介导的 mRNA 降解（NMD），本研究采用 qPCR 技术，定量分析 syngap1ab 突变体幼鱼与野生型（WT）幼鱼中 syngap1ab 的相对表达水平。RNA 提取步骤：取受精后 7 天（7 dpf）的幼鱼，置于冰上麻醉 30 分钟；使用 TRIzol 试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市 Life Technologies 公司）提取总 RNA。对于每种基因型（野生型 WT、杂合突变体 syngap1ab+/-、纯合突变体 syngap1ab-/-），实验均设置 3 次生物学重复，每个样本混合 20 尾幼鱼，取 1 μg RNA 作为逆转录 PCR（RT-PCR）的模板。为富集各样本中的 syngap1 cDNA，采用 syngap1a 和 syngap1b 的基因特异性引物进行扩增，以真核翻译延伸因子 1 类似物 1（eef1a1l1，斑马鱼信息网络 ZFIN 数据库收录）作为内参基因。使用 SuperScript III 逆转录酶（Invitrogen™）合成 cDNA，反应条件为 50℃孵育 1 小时，随后 70℃孵育 15 分钟以终止反应。qPCR 采用 GoTaq qPCR 探针试剂盒（Promega，货号 #A6110），在 QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统（Applied Biosystems™）中按照制造商说明书进行操作。循环参数设置如下：95℃预变性 10 分钟；随后进行 40 个循环的 PCR 扩增，每个循环为 95℃ 15 秒、60℃ 1 分钟；扩增结束后进行熔解曲线分析，条件为 95℃ 15 秒、60℃ 1 分钟。采用 2^(-ΔΔCt) 法计算基因相对表达水平：首先将 syngap1a 和 syngap1b 的循环阈值（Ct 值）与内参基因 eef1a1l1 的 Ct 值进行归一化，计算 ΔCt（ΔCt = Ct_syngap1a - Ct_eef1a1l1、ΔCt = Ct_syngap1b - Ct_eef1a1l1）；再通过计算 2^(-ΔΔCt)，对比野生型、杂合突变体、纯合突变体幼鱼中 syngap1 基因的表达倍数变化。ΔΔCt（即 ΔΔCt = ΔCt_{syngap1ab 突变体} - ΔCt_{WT}），syngap1ab 突变体的表达倍数变化通过将野生型（WT）数值作为参照进行归一化计算（即 2^{-ΔΔCt} 法，以 WT 组为基准计算相对表达量）。

蛋白质免疫印迹分析

从C57BL6小鼠或成年斑马鱼体内切除大脑区域（小鼠）或全脑（斑马鱼）。将组织在10倍体积的裂解缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷 pH 8.0、100 mM 氯化钠、1 mM 乙二胺四乙酸、1 mM 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、1%  TritonX-100、0.2% 十二烷基硫酸钠、0.5% 脱氧胆酸钠，含无乙二胺四乙酸完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏/西格玛））中裂解（对于斑马鱼，每只脑约计15毫克），使用杜恩匀浆器获得匀浆的组织样本。随后用裂解缓冲液将每个样本1:10稀释，每个样本取约20微升上样至凝胶泳道。基于这些实验设置，无论是斑马鱼还是小鼠组织样本，每20微升样品中约含29微克蛋白质。首先用SYNGAP1抗体（英国阿博康公司 ab3344 或 NOVUS 公司 nbp2-27541）检测样本，接着用二抗检测（抗兔免疫球蛋白G IRDye680；LICOR 公司 926-68071 或抗山羊免疫球蛋白G IRDye680；LICOR 公司 926-68074）。使用荧光成像系统（Odyssey CLx 成像系统）检测并成像产生的信号。

视觉运动反应（VMR）测定

所有行为学实验均使用6天龄的斑马鱼幼虫。将syngap1ab突变体与野生型幼虫放置在装有系统水的96孔方形板中。实验开始前，幼虫先暗适应1小时，随后置于Noldus DanioVision™行为观察箱中，维持在28℃环境下。使用Ethovision® XT 11软件编写刺激物递送程序并分析实验结果。对图像进行以40赫兹的频率捕捉。在视觉-运动反应（VMR）测定中，将幼体暴露于5分钟12%（高光设置）的光照刺激下，随后进行5分钟的无光刺激。连续记录四次光照/无光循环的幼体活动，总记录时长为40分钟。随后，使用前文所述的基因分型测定法对幼体进行基因分型，并分析光照开启和关闭条件下幼体的总移动距离，以此作为其活动的替代指标。所得数据进一步使用GraphPad Prism 9.1和MATLAB软件进行分析。

位移与停留时间分析

为了检测观察到的运动亢进是由运动启动次数增加还是运动距离增加导致，我们分析了 Ethovision® XT 11 软件导出的原始数据中的位移和停留时间数据，并通过 MATLAB 脚本（https://github.com/sheyums/Sureni_Sumathipala_syngap1.git）对这些数据进行分析，以探究行为频率分布。所得数据使用 Prism GraphPad（V9.1）进行绘图。

短期习惯化实验

为了检测幼体是否会对声学刺激产生习惯化反应，本研究采用了Wolman等人2015年描述的短期习惯化检测方法。经过30分钟的光适应后，向6天受精后（dpf）的野生型（WT）和syngap1ab+/-幼体呈现5个阶段的声学刺激，实验使用的是Noldus Daniovision观察箱。第一阶段包含10次敲击刺激（强度等级为3），刺激间隔时间（ISI）为20秒。第二阶段同样包含10次敲击刺激（强度等级为5），刺激间隔时间也为20秒。ISI。第三阶段为习惯化测试，包含30次轻敲刺激（强度等级为5），刺激间间隔为1秒。第四阶段为3分钟的休息期。最后，第五阶段包含10次轻敲刺激（强度等级为5），刺激间间隔为20秒。分析每只幼虫每秒移动的总距离，以评估其短期习惯化能力。使用Microsoft Excel和Prism GraphPad软件（V9.1）对数据进行分析。

结果

斑马鱼的 syngap1b 而非 syngap1a 所编码的一种同工型与哺乳动物的 PDZ 相互作用型 Syngap1α1 相似

包括人类在内的哺乳动物仅有一个SYNGAP1基因，该基因编码一种含1343个氨基酸、分子量约149千道尔顿的蛋白质（小宫山等人，2002年）；而斑马鱼基因组中则存在两个syngap1基因。斑马鱼的syngap1a基因位于16号染色体上，编码一种含1290个氨基酸、分子量约146千道尔顿的蛋白质，而syngap1b基因位于19号染色体上，编码一种含1507个氨基酸、分子量约160千道尔顿的蛋白质。与啮齿动物和人类一样，斑马鱼的Syngap1a和Syngap1b均含有四个高度保守的蛋白质-蛋白质相互作用结构域：普列克斯特林同源结构域（PH）、C2结构域、RasGAP结构域和卷曲螺旋结构域（CC）。

我们基于NCBI数据库并与哺乳动物同工型进行对比，对斑马鱼Syngap1同工型进行了特征分析。在哺乳动物Syngap1中，已充分鉴定出四种可变剪接的Syngap1同工型，即α1、α2、β和γ，它们的C端存在差异（McMahon等人，2012）。为了评估斑马鱼syngap1a和syngap1b基因是否能编码类似的同工型，我们整理了所有已发表的和预测的syngap1ab同工型。与哺乳动物同工型类似，斑马鱼syngap1a和syngap1b基因的所有同工型中均包含编码四个蛋白相互作用结构域的外显子，且其N端和C端都存在众多可变外显子。基于表达序列数据库，我们共鉴定出五种syngap1a同工型和十一种syngap1b同工型（图1）。在人类C端同工型中，α1是研究最为广泛的一种，它通过一个四氨基酸（QTRV）PDZ相互作用结构域定位于突触后部位。有趣的是，我们发现了一种斑马鱼syngap1b C端同工型X5，其存在一个推测的类哺乳动物PDZ相互作用结构域，其末端12个氨基酸中有11个与人类的相同（图1b）。由于斑马鱼异构体的C端末端高度可变，我们未能找到类哺乳动物异构体（α2、β和γ）。

图1.剪接机制能够识别的序列。终止密码子用星号标注，表明它们具有相似的核苷酸序列，但存在隐蔽剪接位点（碱基对）或方框（若差异为 (>10 bp）。相似的方框颜色搭配彩色连接线（图 1 斑马鱼 syngap1a 和 syngap1b 异构体）。NCBI 数据库搜索显示 a) 五种 syngap1a 异构体（X1 - X5）和 b) 十一种 syngap1b 异构体（X0、X2-5、X7-11 及 X13）。可变剪接位点分别用点标注（若外显子缺失 <10 个碱基对 (missing <10）或星号标注（*），并对应标注各自的颜色。

N端CRISPR/Cas9编辑产生的等位基因可构建SYNGAP1功能丧失型模型。

为了更好地理解SYNGAP1基因的致病突变如何导致行为改变，我们利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼功能缺失突变体。在人类中，SYNGAP1致病突变分布于整个基因（Hamdan等人，2011；Berryer等人，2013；Vlaskamp等人，2019；Gamache等人，2020）。为了对基因中能影响所有同工型的区域进行突变，我们靶向了syngap1a和syngap1b中最早的共有外显子，即外显子4和外显子5，以构建功能缺失等位基因。CRISPR/Cas9会诱导插入缺失突变，导致阅读框移位并引入提前终止密码子。通过对F1代成年crispant斑马鱼的序列分析，我们筛选出syngap1a的两种突变等位基因（syngap1a +7个核苷酸插入突变体和syngap1a -22个核苷酸缺失突变体）以及syngap1b的一种突变等位基因（-14个核苷酸缺失突变体），所有这些突变预计都会产生严重截短的蛋白质，长度不足200个氨基酸（图2b）。为了最大程度模拟人类SYNGAP1突变单倍剂量不足的情况，我们使用了syngap1a +7和syngap1b -14双杂合子幼虫；为进一步评估基因完全功能缺失的表型，我们使用了双纯合子幼虫（下文分别记为syngap1ab+/-和syngap1ab-/-）。

我们在蛋白质和mRNA水平上对syngap1的功能丧失进行了检测。使用成年斑马鱼脑裂解液进行的蛋白质印迹分析显示，syngap1ab-/-脑组织中的Syngap1蛋白水平降低（图2c）。对从7日龄幼体中收集的RNA进行的定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示，syngap1ab+/-（syngap 1 a=0.001)的校正p值，以及syngap (1 b=0.0495）和syngap1ab-/-（校正p与野生型（WT）幼虫相比，(syngap 1 a=0.0699 ) 和 syngap1 (b=0.0312) 突变体幼虫的相关数值存在差异，这支持了无义介导的衰变机制（图2d）。综上，这些结果表明，我们通过CRISPR/Cas9技术构建的Syngap1ab斑马鱼突变体，其mRNA和蛋白表达水平降低，这证明这些等位基因可作为单倍剂量不足模型使用。

图2. 人类SYNGAP1综合征的斑马鱼功能丧失模型。a) 哺乳动物SYNGAP1蛋白（智人和小家鼠）包含四个主要的蛋白相互作用结构域：普列克斯特林同源结构域（PH结构域）、C2结构域、RasGAP结构域和卷曲螺旋（CC）结构域。斑马鱼（斑马拟丽鱼）的SYNGAP1同源蛋白SYNGAP1a和SYNGAP1b也与哺乳动物蛋白存在结构域保守性。b) SYNGAP1ab蛋白示意图展示了CRISPR诱导的突变位点。用于表型分析的CRISPR突变体包括：SYNGAP1a¹等位基因的p.Ser43Argfs*21突变和SYNGAP1b等位基因的p.Met149Ilefs*9突变。SYNGAP1a¹等位基因在43位氨基酸处发生丝氨酸向精氨酸的改变，在下游21个氨基酸处引入了提前终止密码子。SYNGAP1b突变等位基因在149位氨基酸处发生甲硫氨酸向异亮氨酸的改变，在下游9个氨基酸处引入了提前终止密码子。c) 蛋白质免疫印迹（Western Blots）结果显示了成年小鼠和斑马鱼全脑裂解物中SYNGAP1的表达情况。使用大鼠抗SYNGAP1抗体检测到，野生型斑马鱼SYNGAP1的分子量（约150kDa）与小鼠SYNGAP1相近。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和微管蛋白分别作为小鼠和斑马鱼样本的上样对照。d) 突变型斑马鱼SYNGAP1ab幼鱼在7天龄（dpf）时，SYNGAP1a和SYNGAP1b的mRNA表达水平降低。组间比较采用双因素方差分析（2-way ANOVA），随后进行图基多重比较检验。P值的星号代表：p<0.05-*、p<0.01-**、p<0.001-***、p<0.0001-****

syngap1a与syngap1b基因在存活方面存在协同作用的证据

为研究每个syngap1重复基因如何影响存活率和行为，我们考虑了syngap1a和syngap1b在早期发育过程中重叠的mRNA表达水平（Kozol等人，2015年），并分析了syngap1ab+/-互交产生的九种基因型的幼体存活率。当syngap1b突变等位基因的数量超过syngap1a突变等位基因时，幼体存活率低于预期（补充图2；p<0.0001。这些观察结果表明，syngap1a与syngap1b的表达比例之间存在关联，且当syngap1b突变等位基因数量多于syngap1a时，syngap1b直系同源基因对幼体存活率的重要性高于syngap1a直系同源基因。

附图 2 Syngap1b 对幼虫生存比 Syngap1a 更重要。 a & b) 显示了 *syngap1ab+/-* 内交所产生的不同 syngap1a 和 syngap1b 突变等位基因组合的预期与实际比率。卡方检验表明实际比率与预期比率存在差异，p<0.0001。a & b) 值得注意的是，syngap1b 突变等位基因数量超过 syngap1a 突变等位基因（a<b）的等位基因组合代表性不足，最极端的情况是没有存活的幼虫具有 *syngap1a+/+; syngap1b-/-* 基因型。c) 光照下和 d) 黑暗中的中位移动距离按所有等位基因组合的基因型绘制，最高中位距离见于 *syngap1a-/-;syngap1b-/-* 幼虫。水平线表示其他分析的中位数，以提供背景值。由于某些基因型的数量较少，这些中位数可能不具有代表性。

Syngap1ab+/- 幼虫表现出更大的动态范围、更高的反应概率，且对声学刺激表现出正常的习惯化反应

鉴于 SYNGAP1 已知对感觉处理至关重要，我们想测试 *syngap1ab+/-* 斑马鱼对中强度和高等强度低频振动刺激反应的动态范围，以及它们对重复、高强度、高频刺激的习惯化能力。为了评估这些因素，我们使用了 Wolman 等人 2015 年描述的一项测定，其中将 6 天受精后 (dpf) 的幼虫在测定的第 1-5 阶段暴露于不同强度的振动和不同的刺激间隔 (ISI)（图 3a）。在将幼虫暴露于振动刺激之前，我们让它们在 Noldus 观察箱中适应 30 分钟。在第 1 和第 2 阶段，分别以 20 秒 ISI 传递 10 次中等强度（等级 3）和高强度（等级 5）的轻拍刺激。在第 3 阶段，通过以 1 秒 ISI 传递 30 次高强度轻拍来测试习惯化。随后是第 4 阶段的 3 分钟休息期。最后，第 5 阶段重复第 2 阶段，以 20 秒 ISI 传递 10 次高强度轻拍。总体而言，*syngap1+/-* 幼虫（来自 3 次独立杂交的 n=130）的反应与 WT 幼虫（来自三次独立杂交的 n=110）非常相似（图 3b），对高频刺激表现出正常的习惯化程度（图 3c）。

尽管有这些相似之处，但也存在差异，*syngap1+/-* 幼虫在第 2 和第 5 阶段对高强度刺激的反应持续升高。为了确定这是由于更大的运动还是反应概率的增加，我们计算了每条幼虫在第 1、2 和 5 阶段的中位运动量（图 3d）及其反应概率（图 3e）。对于每秒中位运动量（在给定阶段的所有刺激中计算），阶段和基因型的混合效应模型表明阶段有显著影响 (p = 0.0018)。随后的 Tukey 多重比较检验显示，*syngap1+/-* 幼虫在第 2 和第 5 阶段对高强度振动的移动距离显著大于第 1 阶段对中等强度振动的移动距离（p = 0.0006 和 0.0007），而 WT 幼虫在第 1、2 和 5 阶段的移动距离相似。对于反应概率，混合效应模型表明阶段 (p<0.0001) 和基因型 (p = 0.0009) 均有影响。随后的 Tukey 多重比较检验显示，*syngap1+/-* 幼虫对更强振动刺激的反应概率更高（第 1 阶段 vs. 第 2 阶段 p<0.0001；第 1 阶段 vs. 第 5 阶段 p = 0.0002），并且这种对高强度刺激的更高反应概率在 *syngap1+/-* 幼虫中比 WT 幼虫更显著（第 2 阶段 p = 0.0049；第 5 阶段 p = 0.0014）。

因此，在更强的刺激下，syngap1+/- 斑马鱼幼虫更倾向于移动且移动速度更快，这表明 syngap1+/- 幼虫的反应动态范围更大。在相同刺激下产生反应的概率更高，这也与 syngap1+/- 幼虫的觉醒水平更高相一致。

图 3 Syngap1ab 幼虫对振动刺激表现出短期习惯化，并对更强刺激表现出更多运动。 a) 习惯化测定中所用条件的示意图（修改自 Wolman et al., 2015）。b) WT 和 *syngap1ab+/-* 幼虫在振动后 1 秒的平均移动距离 +/- 标准误。c) 每条幼虫的习惯化指数通过减去习惯化后（第 41-50 次刺激）的平均移动距离与习惯化前（第 11-20 次刺激）的平均移动距离来计算。d) 显示了 WT 和 *syngap1+/-* 幼虫每个阶段的中位移动距离（毫米/秒）。e) 显示了 WT 和 *syngap1+/-* 幼虫每个阶段的反应百分比。对基因型和阶段进行了混合效应模型分析，当 p<0.05 时，随后进行 Tukey 多重比较检验。* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001；**** p<0.0001

syngap1ab 突变体的过度活跃在低唤醒环境中最为显著

我们接下来评估了 syngap1ab 模型中的视觉运动反应（VMR；(Burgess and Granato, 2007; Emran et al., 2008)）。在该检测中，幼鱼的运动在四次光照开启至光照关闭的转换周期内被记录。幼鱼的活动被测量为每30秒移动的总距离。当斑马鱼幼虫突然从光照过渡到黑暗时，其运动活性会显著增强（图4a）。与野生型（WT）幼虫相比，syngap1ab+/-和syngap1ab-/-幼虫在开灯和关灯周期中的活性均有所增加（图4b）。在关灯期间，syngap1ab+/-幼虫的移动距离最大，但这一趋势在一定程度上不同批次幼虫的该变量存在差异（补充图3b）；开灯时，各批次幼虫的活动亢进情况一致，且该表现与突变型syngap1等位基因的数量相关，其中syngap1ab-/-型幼虫的活动量最大（图4；补充图3）。

附图 3 每批次的视觉运动反应数据显示 syngap1 在光照下比在黑暗中更一致地表现出过度活跃。 a-e) 在五个不同的独立试验中，每条 6 dpf 幼虫每 30 秒移动的中位距离 + 95% 置信区间，暴露于交替循环的 5 分钟光开和 5 分钟光关条件。样本量在每个 VMR 图的右侧标出。再右侧是在光照和黑暗条件下分别比较基因型。在光开周期中，syngap1ab 突变体以基因型依赖的方式显示出增加的活动水平，其中 *syngap1ab-/-* 比 *syngap1ab+/-* 更活跃，而后者又比 WT 幼虫活跃。在光关周期中，syngap1ab 突变体幼虫与 WT 幼虫相比，通常（但不总是，见 b）显示出显著增加的活动。使用 Kruskal-Wallis 检验后接 Dunn 多重比较检验进行基因型间的统计分析。P 值星号表示：p<0.05 - *，p<0.01 - ，p<0.001 - *，p<0.0001-。

图4. 由于大动作的发生频率更高，syngap1模型的过度活跃在光照周期中表现得最为显著。a) 五次独立实验中，每只6天龄幼体在每30秒内移动的中位距离及95%置信区间，实验采用5分钟开灯、5分钟关灯的交替周期（补充图2）。b) 在开灯周期中，syngap1ab突变体表现出更高的活动水平以基因型依赖的方式表现为，syngap1ab-/- 突变体幼体的活动量高于 syngap1ab+/- 杂合子幼体，而后者又高于野生型（WT）幼体。在熄灯周期中，syngap1ab 突变体幼体的活动量显著高于野生型幼体，但 syngap1ab-/- 与 syngap1ab+/- 幼体的活动水平无显著差异。不同基因型间的统计分析采用 Kruskal-Wallis 检验，随后进行 Dunn 多重比较检验。P值的星号代表；p<0.05-*、p<0.01-**、p<0.001-***、p<0.0001-****。开灯条件下c）与熄灯条件下d）“理想化幼体”的位移分布。图表通过汇总开灯期间的所有位移事件绘制而成，其中野生型为n=119,135、syngap 1 a b+/-n=196,594，syngap1ab-/- 幼体数量为n=158,443；熄灯期间野生型为n=652,368，syngap1ab+/- 幼体数量为n=777,525，syngap1ab-/- 幼体为n=507、720；数据来源于173只野生型、167只syngap1ab+/- 及119只syngap1ab-/- 幼体。

对于前述实验，野生型（WT）、syngap1ab+/- 和 syngap1ab-/- 幼虫均来自独立杂交。为排除不同亲本遗传背景对观察到的行为的影响，我们检测了 syngap1ab+/- 成体自交产生的幼虫的视觉运动反应（VMR）（补充图2c-d）。与之前的结果一致，在开灯阶段（补充图2c）和关灯阶段（补充图2d），在所有产生的基因型中，syngap1ab-/- 的活性水平最高。

光照下syngap1ab的过度活动与黑暗中野生型行为相似

我们在 syngap1ab 突变体模型中观察到的多动现象，可能源于运动频率增加、单次运动的行进距离变长，或两者兼而有之。为区分这些可能性，我们以更高的时间分辨率分析了幼鱼的运动情况。数据每 25 毫秒采样一次，时间分辨率远高于前述图表中每 30 秒的行进距离数据。斑马鱼的运动周期持续约 250 毫秒，因此 40 赫兹的分辨率足以捕捉大多数运动周期并获取多个数据点。我们重点关注两个参数：两次连续运动周期之间的时间间隔（称为“停留时间”），以及每个运动周期的行进距离（称为“位移”）。我们使用自定义编写的 MATLAB 脚本对这些高分辨率活动数据进行整理和分析，以评估不同行为（由位移和停留时间表征）在光照和黑暗条件下的发生概率。

考虑到单个幼虫的运动具有高度随机性，为了评估整个分布范围内高频和低频事件的整体模式，我们从每种基因型的100多个个体中收集了大量数据点，然后将总运动次数除以个体数量，为每种基因型生成一个“理想化幼虫”（图4b-c）。当将某一基因型所有个体的运动次数合并计算时，每种基因型在每种光照条件下均有对应的运动次数（开灯时：野生型 230f6cf-b92d-4d05-94cd-b3a126e742e6、syngap1ab+/- n=196,594 与 syngap 1 a b-/-n=158,443；关灯时：野生型 n=652,368、syngap1ab+/- n=777,525 以及 syngap1ab-/- n=507,720，这些数据分别来自173只野生型、167只syngap1ab+/-杂合子和119只syngap1ab-/- 单个幼虫。该分析表明，与黑暗、高唤醒状态相比，基因型之间的差异在光照、低唤醒状态下要显著得多。

我们接下来分析了停留时间（两次移动之间的间隔时间）和单次移动距离的概率分布（图5）。黑暗环境下的野生型（WT）幼虫，其停留时间比光照环境下的野生型幼虫更短，移动距离更大（图5a-i、a-ii）。野生型幼虫在光照与黑暗环境下的这些行为差异，可通过下方展示停留时间和位移在黑暗与光照下相对概率的图表进一步凸显（图5a-iii、a-iv）。 随后，我们分别对比了黑暗环境（图5b）和光照环境（图5c）中syngap1ab+/-突变体与野生型幼虫的行为。在黑暗环境下，syngap1ab+/-和syngap1ab-/-突变体的停留时间与位移分布与野生型幼虫高度相似（图5b-i至b-iv）。而在光照环境下，与野生型幼虫相比，syngap1ab-/-和syngap1ab+/-突变体的移动频率更高、位移幅度也更大（图5c-i、c-ii）。下方展示syngap1+/-突变体（紫色）、syngap1-/-突变体（粉色）与野生型（WT）相对概率的图表，清晰体现了光照条件下syngap1+/-突变体与野生型幼虫的这些差异（图5c-iii、c-iv）。 这些分析表明，光照环境下的syngap1突变体与野生型的行为模式，与野生型幼虫在光照与黑暗环境下的行为差异特征一致，即光照环境下的syngap1突变体行为，等同于黑暗环境下的野生型幼虫行为。 综合来看，行为实验证实了syngap1突变体存在**情境依赖性的多动现象**：该特征在厌声性声学刺激下表现最为微弱，而在本底唤醒水平较低的正常环境中则最为显著。

图 5：syngap1ab 突变体幼鱼在光照周期中表现出觉醒水平升高，运动更频繁、位移距离更大(ai & aii) 绘制了全部 173 尾野生型（syngap1ab+/+）幼鱼在光照（黄色）和黑暗（深色，方格）周期中的停留时间概率分布（ai）与位移距离概率分布（aii）。下方（aiii & aiv）通过绘制 “黑暗条件概率−光照条件概率”，对比黑暗与光照下的运动行为。野生型幼鱼在黑暗中比在光照下运动距离更远、频率更高。

b & c) 绘制了全部 173 尾野生型、167 尾 syngap1ab+/- 及 119 尾 syngap1ab-/- 突变体幼鱼的停留时间概率分布（bi、ci）与位移距离概率分布（bii、cii）。在概率分布图下方（biii–iv、ciii–iv），通过绘制 “syngap1ab 突变体概率−野生型概率”，对比 syngap1ab+/-（紫色）、syngap1ab-/-（粉色）与野生型（黑色）的运动差异。

在黑暗条件下，syngap1ab+/- 幼鱼的运动频率高于野生型和 syngap1ab-/- 幼鱼，而所有基因型的位移距离分布相近。与之相反，在光照条件下，syngap1ab+/- 与 syngap1ab-/- 幼鱼的运动频率和位移距离均显著高于野生型，且模式与野生型在黑暗中的行为相似，说明 syngap1ab 突变体在光照下呈现觉醒水平异常升高的状态。

P 值采用双样本 Kolmogorov-Smirnov 检验计算：

· 光照条件下位移：野生型 vs syngap1ab+/-，P=0；野生型 vs syngap1ab-/-，P=0；syngap1ab+/- vs syngap1ab-/-，P<10⁻⁷⁰

· 黑暗条件下位移：野生型 vs syngap1ab+/-，P=10⁻²⁶；野生型 vs syngap1ab-/-，P=1.5×10⁻¹¹

vs syngap1ab⁻/⁻）= P＜10⁻⁴⁵；

光照条件下停留时间：野生型 vs syngap1ab⁺/⁻，P=0；野生型 vs syngap1ab⁻/⁻，P=0；syngap1ab⁺/⁻ vs syngap1ab⁻/⁻，P＜10⁻³¹；

黑暗条件下停留时间：野生型 vs syngap1ab⁺/⁻，P=10⁻²⁰⁰；野生型 vs syngap1ab⁻/⁻，P=10⁻⁵⁰；syngap1ab⁺/⁻ vs syngap1ab⁻/⁻，P＜10⁻²⁰⁰。

讨论

本研究构建了SYNGAP1单倍不足斑马鱼模型，并对斑马鱼syngap1ab剪接变体进行了特征分析，明确其与哺乳动物Syngap1以及斑马鱼syngap1a、syngap1b重复基因的关联。以此为基础，我们通过CRISPR/cas9基因编辑技术对syngap1a和synagp1b两个重复基因进行编辑，构建了SYNGAP1综合征的稳定斑马鱼突变模型，并在mRNA和蛋白水平验证突变基因为功能缺失等位基因。研究发现，syngap1a和syngap1b在斑马鱼中发挥互补的功能作用，当syngap1b突变等位基因数量超过syngap1a时，斑马鱼幼鱼的死亡率会升高。针对syngap1a和syngap1b突变基因型平衡的个体开展更深入分析，我们证实，与哺乳动物模型和人类的研究结果一致，斑马鱼syngap1ab模型表现出情境依赖性的多动行为，且在低唤醒状态下该特征尤为显著。

与哺乳动物的Syngap1同工型相似（Gou等人，2020；Yang等人，2023），斑马鱼的两个Syngap1直系同源基因在N端和C端均存在广泛的剪接，且基因中部的剪接变体仅会改变少数氨基酸。我们有证据表明，syngap1b而非syngap1a编码一种α1样同工型，这是哺乳动物Syngap1同工型中研究最广泛的一种（Chen等人，1998；Kim等人，1998；Walkup等人，2016；Araki等人，2020）。在哺乳动物中，α1同工型已被证实可通过与PSD-95的PDZ结构域相互作用，在谷氨酸能突触的突触后致密区富集（Chen等人，1998；Kim等人，1998；Komiyama等人，2002）。在小鼠中，仅α1同工型的缺失就足以导致认知障碍和癫痫发作（Kilinc等人，2022）。Syngap1 α1同工型的独特表达SYNGAP1B基因产生的同工型或许能解释斑马鱼幼虫中携带更多SYNGAP1B突变等位基因而非SYNGAP1A突变等位基因的个体死亡率更高这一现象。由于斑马鱼存在序列差异，且这种差异与此前在斑马鱼突触蛋白质组中发现的差异相符（Bayes等人，2017），我们无法确定斑马鱼的哪些剪接变体对应于其他特征明确的哺乳动物SYNGAP1α2、β和γ同工型（Kilinc等人，2018；Araki等人，2020；Gou等人，2020）。

其他SYNGAP1综合征的斑马鱼模型仅发生了syngap1b基因的突变（Griffin等人，2021年；Colón-Rodríguez等人，2019年）。我们的存活率差异结果表明，syngap1b模型中报道的表型可能与syngap1a和b之间的功能失衡有关。因此，我们后续更深入的分析聚焦于在syngap1a和syngap1b两个基因上均发生平衡杂合突变的幼虫，以期重现哺乳动物的单倍体不足现象。预测快速眼动睡眠与非快速眼动睡眠之间的转换（沙利文等人，2020年）。综合来看，这一系列症状表明SYNGAP1综合征患者处于高度唤醒状态，且在行为状态转换方面存在困难。

与哺乳动物模型类似，我们的syngap1ab斑马鱼突变体模型表现出情境依赖性的多动行为。在由强烈的厌恶性声学刺激引发的高唤醒情境中，野生型（WT）和syngap1+/-幼体展现出相似的高度刻板、高速的逃逸反应，这类反应与哺乳动物的惊跳反应具有相关性——其特征为对刺激的反应潜伏期短，且依赖于网状脊髓神经元（Liu和Fetcho，1999；Eaton等人，2001；Korn和Faber，2005）。与野生型不同，syngap1ab+/-幼体具有更大的动态范围，随着声学刺激强度的升高，其游动距离和反应概率均有所增加；而野生型幼体在两种测试强度下的反应均相似。斑马鱼糖皮质激素受体突变体中也出现了对声学刺激产生更大位移的现象，这类突变体因缺乏反馈抑制而导致糖皮质激素长期升高（Griffiths等人，2012）。syngap1ab+/-突变体不太可能存在糖皮质激素长期升高的情况，因为糖皮质激素升高会使斑马鱼在光照下的活动减少，而我们的syngap1ab+/-模型在光照下的游动速度更快、频率更高。

另一种可能性是，其他已知能促进行为的唤醒通路、神经元群和/或神经递质在 syngap1 模型中更为活跃。在哺乳动物和斑马鱼中，包括多巴胺、QRFP、血清素以及食欲素/下丘脑泌素等在内的唤醒通路均与运动能力增强相关（Chiu and Prober, 2013; Lovett-Barron et al., 2017; Corradi and Filosa, 2021; Tan et al., 2022）。此外，针对斑马鱼的功能获得性实验研究表明，过表达食欲素/阿片肽或可卡因-安非他命调节转录肽（CART）足以增加斑马鱼幼体对声学刺激产生反应的概率（普罗贝尔等人，2006年；伍兹等人，2014年）；而过表达食欲素/阿片肽、降钙素基因相关肽（CGRP）或胆囊收缩素（CCK）中的任意一种，都能提高斑马鱼幼体白天的活动频率（伍兹等人，2014年）。因此，特定觉醒通路的过度激活与syngap1ab+/-突变体的行为特征相符。

对明暗交替条件下行为反应的测试表明，syngap1+/- 斑马鱼的过度活跃在光照条件下最为显著，而野生型（WT）幼虫在光照环境中表现为停留时间长、活动幅度小。与野生型不同，syngap1ab+/- 和 syngap1ab-/- 幼虫的停留时间更短、活动幅度更大，这种模式与野生型在视觉运动反应（VMR）分析中突然转入黑暗环境时的表现极为相似（Burgess and Granato, 2007; Emran et al., 2008; Kozol et al., 2021）。研究表明，野生型斑马鱼在突然转入黑暗后活动增加，这反映了其具有目标导向的行为——鱼类会试图返回光照环境，这种行为被称为黑暗趋光性（Horstick et al., 2017）。目标导向的活动增加也可能由内部状态引发，例如饥饿，这一特性已在不再拥有卵黄供给的7日龄斑马鱼幼虫中得到研究（Filosa et al., 2016; Wee et al., 2019）。本研究中，过度活跃的 syngap1ab 突变体为6日龄幼虫，因此其过度活跃不太可能由饥饿驱动。饥饿诱导的过度活跃与皮质醇水平降低、血清素能中缝核神经元活动增强相关，同时幼虫在靠近可能为食物或捕食者的物体时会表现出更高的冒险倾向（Filosa et al., 2016）。与饥饿类似，流水也能诱发更频繁的活动，且这种活动同样依赖于背侧血清素能通路（横沟洋等，2012）。我们在syngap1ab+/-幼虫中观察到的过度活跃可能是一种寻求感官刺激的行为，这让人联想到SYNGAP1综合征患者表现出的持续好动以及对流水的偏好。

对遗传性自闭症患者和动物模型的研究表明，尽管自闭症的病因存在一些共同特征，包括神经发生和胶质发生的改变以及兴奋/抑制平衡的改变（Hoffman 等人，2016；Willsey 等人，2021），但神经解剖学、行为特征和相关症状的具体变化因基因型而异，存在显著差异，这支持了自闭症亚型的存在（Ellegood 等人，2015；Thyme 等人，2019；Zerbi 等人，2021；Weinschutz Mendes 等人，2023）。就 SYNGAP1 基因而言，人体和动物模型研究均表明，唤醒通路在情境依赖性多动行为中发挥着重要作用。