标题：GRIK5 Genetically Regulated Expression Associated with Eye and Vascular Phenomes: Discovery through Iteration among Biobanks, Electronic Health Records, and Zebrafish

期刊：The American Journal of Human Genetics

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.01.017.

摘要

尽管利用模型系统研究具有较大效应的突变机制是常见做法，但我们在此重点介绍斑马鱼模型系统对基因 GRIK5 的研究如何帮助阐明血管生物学与眼部疾病相关的机制。GRIK5 基因是导致眼部疾病多基因易感性的因素之一。将参考转录组面板得出的基因表达预测应用于范德比尔特大学医学中心的大型电子健康记录（EHR）关联生物样本库 BioVU 后，发现 GRIK5 表达降低与多种眼部疾病相关。我们通过敲除斑马鱼中的 GRIK5 同源基因来验证其功能，观察到眼部血管数量和完整性减少，且血管通透性增加。对超过 260 万名范德比尔特受试者的电子健康记录分析显示，眼部疾病与血管疾病存在显著共病关系（相对风险为 2 至 15）；这一共病关系在来自大型保险索赔数据集的 1.5 亿个体中得到了证实。随后对 (>60,000) 基因型的 BioVU 参与者的研究证实，GRIK5 基因预测表达降低与血管和眼部共病相关。我们的研究开创了一种方法，能够快速将基因-表型关系的发现迭代为促成人类疾病病理生理学的主要遗传机制。我们的研究结果还丰富了对谷氨酸受体（如 GRIK5，在蛋白质形式中也称为 GLUK5）驱动的生物学的理解，以及对导致人类眼部疾病的机制的认识。

引言

眼部疾病是一类多样的病症，既十分常见，又在很大程度上符合多基因遗传结构。眼部疾病的病理生理学产生于不同的细胞类型，且表现出各自的特异性；然而，对眼部疾病生物学基础的认知主要来自单基因研究或小规模遗传学分析。利用电子健康记录（EHR）的无偏倚、大规模大数据方法或许能提出疾病机制相关假说，这些假说可在动物模型中得到验证。

与单核苷酸多态性（SNP）个体检测不同，基于基因的检测为常见疾病相关基因的鉴定提供了另一种方法。PrediXcan（即预测表达扫描）利用参考面板为每个组织中每个基因的转录本表达构建基于SNP的预测模型。1 与单个SNP关联分析相比，检测与预测表达的关联能提升统计效能，因为我们检测的是基因组功能的某一特定特征（在本研究中为经填充的遗传决定基因表达）；已有研究表明，这一特征是常见变异对常见疾病遗传力的重要贡献因素。2,3 预测基因表达的应用为模型生物验证提供了更清晰的路径，因为关联结果是在基因层面而非单核苷酸多态性（SNP）层面（全基因组关联研究[GWAS]的结果亦是如此），且其效应方向易于解读。

CRISPR-Cas9技术的最新进展彻底革新了动物模型构建的保真度和效率，如今可在动物和细胞系中以高效率实现精准基因组编辑，且脱靶效应极低^{4-7}。透明胚胎和基因修饰成体的快速发展，使得研究人员能够长期对完整斑马鱼中的变异进行表型分析，从而实现四维成像。

过去十年的研究表明，与DNA生物样本库关联的电子健康记录（EHR）数据是人类基因发现的高效途径。8-13 在电子健康记录数据中使用表型算法，既能复制现有的基因关联关系，也能发现新的关联关系，14 还能开展全基因组关联研究和全表型组关联研究，其研究结果可与基于研究级诊断开展的研究结果相印证。15 医疗表型组的广泛范围，以及通过电子健康记录表型组学能够获取（且成本可控的）更大样本量，为相关研究创造了契机我们在此总结一系列研究的成果，这些研究始于在BioVU（范德比尔特大学医学中心与电子健康记录关联的DNA生物样本库）中发现GRIK5基因遗传决定的表达水平降低与多种眼部疾病之间的关联。GRIK5基因编码谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基5。16 我们利用相关的公开大型全基因组关联研究以及斑马鱼验证实验证实，GRIK5表达水平降低会损害动物模型中的血管完整性，并增加BioVU参与者患多种眼部疾病的遗传风险。本研究通过在适用于生物样本库和大型电子健康记录的大数据整合方法（通过转录组检测分析基因组变异）与动物模型系统中基因编辑的现代方法之间反复迭代，开创了一种发现机制并快速阐明基因组变异与人类疾病关联的生理机制的研究模型。

结果

PredixVU 基因-医学表型组电子目录的构建

我们设计了一种将基因组变异与电子健康记录表型关联起来的策略；该项目最终构建出了一套大规模的基因-医学表型组目录（图1）。我们参考了GTEx26、DGN25等数据库中的基因组变异和基因表达水平测量数据，采用PrediXcan1方法构建了基于SNP的预测模型，用于对多达44种组织中已测基因表达水平进行预测（图1A）。随后，我们将该预测模型应用于BioVU队列中已完成基因分型的个体，以估算每种组织中每个基因的遗传调控表达水平（GReX，详见材料与方法）（图1B）。接着，我们针对某生物样本库中携带1145种“ phecode”（表型代码，详见材料与方法）的受试者，检验了计算得到的GReX值与DNA变异之间的关联（图1C）。这些关联研究的结果构成了一套完整的基因-医学表型组电子目录，我们将其命名为PredixVU（图1D）。本文中，我们展示了一项新发现的关联——GRIK5基因表达水平降低与眼部表型组相关，并通过模式生物斑马鱼的体内功能缺失实验，以及对大规模电子健康记录（EHR）数据中表型组关联关系的分析，对该关联进行了验证。

 图1. 实验流程医学表型组目录的构建以及电子健康记录中的每一项临床特征。（A）我们利用GTEx联盟来自同一供体的44个组织的转录组数据和全基因组基因型数据作为参考资源，构建基因表达推断模型。（B）我们采用PrediXcan方法和这些预测模型，对BioVU研究对象的组织水平基因表达进行推断。这种推断的表达水平被称为基因调控表达（GReX），以区别于实测表达水平。在下游分析中，我们主要关注GReX，而非基因表达的特征改变组分或其他因素（如环境调控因子）。（C）将基因型数据与生物样本库关联，针对每个经检测的基因的GReX，与以phecode为表征的临床特征进行关联分析。（D）该分析流程使我们能够生成一份全面的基因-医学表型组目录，涵盖所有关联关系，包括效应方向以及电子健康记录（EHRs）。

GRIK5 基因调控表达与眼部疾病的关联发现

基于DGN全血转录组作为参考面板构建的GReX与眼部疾病表型码（在5240名欧洲裔BioVU受试者中，标识为((p<0.05))）关联的初步分析汇总结果（已确定通过principal-components分析33个基因型数据）如图2A所示。GRIK5的减少GReX显示与至少20个受影响个体证明的55个眼表型中的18个（表S1）和至少50个受影响个体证明的39个眼表型中的16个有名义上的显著关联。我们考虑了基因座中LD污染关联的可能性。每个方向上最相邻的10个基因中没有一个显示出类似的眼部表型关联模式。(p<0.001)GRIK5有四种表型相关，也与20个相邻基因中的一个相关；没有一个是眼部表型。使用置换分析（见材料和方法），保留细胞节之间的相关性和它们之间的相关性LD中的基因组变异（表S2），我们发现观察到的眼病关联数量明显大于预期的偶然（排列(p<)(10^{-6})图2A和表S1；在100,000个排列中，一个基因与最多6个眼表型有显著关联；没有基因与7个或更多眼表型表现出显著关联）。使用Fisher方法并应用于GRIK5 p值的组合测试统计((X_{2 k}^{2} ~-2 sum_{i=1}^{k} ln (p_{i})))在与所有测试基因中最大组合测试统计量的经验频率分布进行比较的基础上具有高度显著性（经验调整(p<10^{-6})）。

在对我们目前可获得的最大样本量的分析中，研究GRIK5的GReX减少的相关性（60,000名参与者），在GRIK5表达最低的人（分布的底部2.5%，图2B）中，外周血管疾病和共病眼特征的风险显著增加（图2C），包括“其他视网膜疾病”（((p=5.57 ×10^{-8}))）、白内障((p=2.41 ×10^{-6}))）和青光眼（((p=6.26 ×10^{-6}))（图2C）；这种增加的风险与这些眼部疾病的病理生理学的血管成分一致。值得注意的是，我们没有发现与眼睛感染（((p=0.61))）或斜视和其他双眼运动障碍（((p=0.22))）的关联，这表明此类眼部疾病具有独特的病理生理学。这些发现导致了GRIK5生理功能的基本问题，以及这与眼睛和血管疾病的潜在共病性之间的关系。

图2. GRIK5基因决定的表达和与疾病表型的关联。（A）在保留成对SNP-SNP相关性（即连锁不平衡[LD]）和成对性状-性状相关性的100,000个置换数据集的基础上，遗传决定的GRIK5表达与眼部疾病的关联数量（((p<0.05))0.05）明显大于随机预期（经验(p<0.001)0.001）。橙色箭头显示实际数据中观察到的数字，绿色条显示置换数据集的零分布。（B）直方图显示60,000名BioVU受试者中遗传决定的GRIK5表达的分布。虚线表示人口中最底层2.5%（遗传决定的GRIK5表达极度减少）的截止值。（C）来自（B）的最底层2.5%人口中外周血管疾病和眼睛表型（性状）之间的共病分析。虚线显示(p=0.05)截止值。黄色=不显著，橙色=名义上显著((p<0.05))，红色=显著（Bonferroni调整(p<0.05)0.05）性状。仅包括(>20)受影响个体中存在的性状。

斑马鱼中Grik5的减少表达导致眼睛表型和出血

GRIK5编码谷氨酸结合受体，通过动物模型研究和关联研究，该受体参与了大脑和感觉器官神经传递的调节。然而，对其其他生理功能的了解却少得多。为了研究Grik5在发育过程中的作用，我们通过使用CRISPR-Cas9基因组编辑策略（敲除；KO）和吗啉oligonucleotide-based（MO）蛋白敲除（KD）（图3A和图3B）生成了功能丧失模型。Grik5的遗传KO系提供了对在形态中观察到的表型的独立评估。我们使用了一种涉及MO的方法，因为它的剂量可以滴定（图S1），从而允许测试部分还原的蛋白质翻译的效果，这反过来又更好地类似于人类中的还原基因表达。我们使用了每个胚胎6 ng的50-UTR靶向MO剂量。Grik5 MO阻断mRNA翻译的有效性通过体内试验得到证实（图S2）。

使用吗啉代寡核苷酸和CRISPR诱导突变敲低斑马鱼grik5基因后，出现两种明显的结构缺陷：眼睛变小（图S3）以及血管完整性受损（图3C和3E）。在斑马鱼中观察到的小眼表型，更可能与grik5在感光细胞和视网膜外网层的表达相关，这一点在小鼠胚胎研究中也已得到证实。我们的原位杂交实验同样证实，发育中的斑马鱼眼睛中存在大量grik5转录本，进一步验证了上述初步发现（图S3）。由于grik5的表达可能与谷氨酸受体的代谢型活性直接或间接相关，因此其导致小眼表型的结果并不意外。血管完整性缺陷表现为斑马鱼在3天胚胎期（3 dpf）时多个器官发生血液外渗（图3C、3D、S1、S4及表S3）。

人和斑马鱼的GRIK5与grik5基因产物在一级结构上的同源性分别为85%和相似性为94%序列水平。利用这一高度同源性，我们通过用人GRIK5（hGRIK5）mRNA（不受grik5 MO靶向）设计针对出血表型的拯救实验，检测了grik5 MO敲低的特异性。在 morphants 中过表达人GRIK5可将出血情况恢复至与对照MO和未注射同窝仔鱼相当的水平（图3D和图S1B），证明出血缺陷是grik5耗竭所特有的。grik5 morphants 中的出血现象最常见于大脑第四脑室和/ *或*心包后间隙。

同时，我们通过向导RNA靶向谷氨酸结合位点诱导了grik5基因突变（图3A、3B、3E和图S5）。我们对携带生殖系grik5基因突变的首代鱼进行了测序，并分析了反式杂合子F1代子代以排除脱靶效应（图3E和3F）。在309条被分析的鱼中，有57条（18%）F1代动物在脑部和/或心包后间隙出现局部出血。为了确保观察到的出血表型是突变体特有的，我们以单盲、无偏倚的方式对单个F1代胚胎进行了测序。我们在出血胚胎中检测到了有害突变，而形态正常的同胞胚胎则为grik5杂合子或野生型纯合子（图S5）。

我们推断grik5的表达与表型的发生相关。我们利用了全鱼RNA测序表达的公开数据37，并通过1-4天胚胎期（dpf）的定量聚合酶链式反应（qPCR，图S3A和S3B）以及3天胚胎期的原位杂交技术（图S3D和S3E）对该数据进行了验证。对全胚胎的定量聚合酶链式反应分析显示，grik5的表达在3天胚胎期达到峰值，且定位于大脑和视网膜（图S3B），这一结果通过另一组独立的引物和核糖探针得到了证实（数据未展示）。来自相同发育阶段斑马鱼中经荧光激活细胞分选（FACS）分离的Tg(flk1:GFP+)内皮细胞的独立RNA测序数据，也进一步佐证了上述发现（图S3C）。综上，grik5的表达时间和位置能够解释grik5敲低型和突变型斑马鱼出现的出血现象（图3C和3E）以及眼部变小的表型（图S3F和S5）。

图3. 斑马鱼中grik5基因功能缺失会导致出血表型。(A) GRIK5蛋白结构模型展示了向导RNA（gRNA）g03靶向的预测谷氨酸结合口袋。(B) 用于构建grik5敲低模型的吗啉代（MO）和gRNA CRISPR-Cas9靶向位点位置。(C) 活体胚胎的实验设计及头部侧视图。方框标注脑部出血区域并在下方放大；箭头指向(4^{th })脑室。(D) MO、人GRIK5 mRNA拯救组及对照组胚胎出血率汇总。拯救实验使用了斑马鱼grik5-MO无法靶向的人GRIK5 mRNA。N为受试动物总数。独立实验结果以不同形状作为数据点标注在图上，图中同时显示平均值和标准差柱。(E) 野生型（WT）和CRISPR-Cas9编辑的(grik 5^{g 03 / g 03})突变体的活体图像。下方为方框内脑部区域的放大图。箭头标记血液积聚处。(F) grik5等位基因序列。高亮区域为(grik5 5^{803})中检测到的突变；短横线（-）代表缺失；红色代表替换；小写字母代表插入。C和E图中比例尺为0.1毫米，其中C图为色素阻断剂（PTU）处理的胚胎，E图为未处理的胚胎。

血管疾病与眼部疾病的共病性

BioVU 数据库中最初及最新的 PrediXcan 研究结果，结合斑马鱼验证实验，共同表明早期且可能贯穿终身的血管功能缺陷（如血管数量与完整性减少、血管通透性增加），可能会增加人类迟发性眼部疾病的发病风险。因此，我们提出假设：眼部疾病与血管疾病可能共病。为验证这一假设，我们利用范德比尔特大学的结构化数据库（SD），计算了眼部疾病的相对风险（RR）。这些眼部疾病最初被发现与 GRIK5 基因的 GReX 水平降低相关，而在针对大量 BioVU 受试者开展的研究中，一组血管疾病表型与 GRIK5 基因 GReX 水平降低的关联最为显著。(>2.6 million) 研究对象的电子健康记录去标识化图像。在所有血管表型范围内，眼部疾病的风险均显著升高（2至15倍；图4A）。“烧伤”表型被纳入作为对照表型，其诊断年龄范围较广；尽管既往血管疾病可能会使烧伤愈合过程复杂化，但该因素不太会对个体是否因烧伤就医产生重大影响，同理，烧伤也不太会对他人是否因烧伤就医产生显著影响血管疾病。在54个眼部/血管表型配对中，72%（39/54）存在R (RR>4.0)关联。在这39个案例中，有2个案例的显著共病性已在文献中有报道。我们同样根据年龄和性别，在MarketScan保险索赔数据集的4000万名受试者中估算了这些表型的(RR^{21})（图4B、4C和图S6），证实了眼部与血管疾病共病性的强度（参见材料与方法）。在男性和女性中，年龄与共病性程度均无显著关联。（分别为 Kruskal-Wallis 检验 (p=0.38) 和 (p=0.70)），且男性与女性之间未观察到显著差异（Mann-Whitney U 检验 (p=0.43)），这表明该观察结果具有稳健性，不太可能受这些人口统计学变量的干扰。

图4. 眼部疾病与血管疾病的共病分析。（A）热图显示了患有一组血管疾病的个体患眼部疾病的相对风险。共病评估通过范德比尔特合成衍生数据集（SD）计算得出，该数据集包含(>2.6)百万名参与者的电子健康记录（EHRs）去标识化影像。在这组血管表型中，眼部疾病的风险增加了2至15倍。“烧伤”被纳入作为对照表型。值得注意的是，72%的眼-血管疾病配对的相对风险（RR）为((RR)>4.0)。（B和C）MarketScan数据集中眼部和血管疾病的RR分析⁴⁰。（B）视网膜脱离（眼部）与缺损 vs 耳部退行性及血管疾病（血管性）。（C）白内障（眼部）vs 骨无菌性坏死（血管性）。（B0和C0）各性别及年龄组的总样本量。（B00和C00）样本量仅包含患病受试者（排除无疾病受试者）也未分析眼部或血管疾病。（(B^{prime prime prime}) 及 C000）不同性别和年龄组中眼部疾病与血管疾病的比值比。

血管与眼表型共有的基因机制

我们通过整合公开的全基因组关联研究（GWAS）汇总数据，进一步探究眼部疾病和血管性状的多效性遗传效应，以此为血管疾病与眼部疾病共享遗传结构这一假说寻找更多支持。利用近期偏头痛风险（一种具有血管病因的神经系统疾病）的全基因组关联研究（GWAS）荟萃分析数据（编号 ((n=375,000))），我们发现全血表达定量性状基因数据库（DGN）转录组来源的谷红氨酸受体激酶5（GRIK5）基因表达调控水平（GReX）降低，与这一血管性状（编号 ((p=9 ×10^{-8}))）显著相关。值得注意的是，在MarketScan数据库中，我们还发现偏头痛与感觉视网膜营养不良之间存在显著的共病关联（相关系数 R 编号 (RR=2.4)，经Bonferroni校正后 P 值 编号 (p=4.3 ×10^{-36})）。相反，我们借助目前规模最大的眼部疾病全基因组关联研究荟萃分析——年龄相关性黄斑变性（AMD）的全基因组关联研究（GWAS）数据（编号 ((n>33,000))），在BioVU数据库中检测其与血管性状的关联（编号 ((n=28,358))）。在与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的前100个基因中，我们发现其中部分基因与“外周血管疾病”存在显著的PrediXcan关联（经Benjamini-Hochberg校正后 P 值 编号 (p<0.05) < 0.05）（表S4）。BioVU。这一结果与最新的 BioVU 样本 ((n=60,000)) 中的类似结果相吻合，在该样本中，我们观察到在 GRIK5 表达量最低（处于最低的 2.5%）的参与者中，一种血管特征（脑血管疾病）与“视网膜黄斑变性（老年性）NOS（未另作说明）”（((p=9.73 ×10^{-4}))）存在共病情况（图S7）。

我们提出假设，眼部疾病与多种血管特征之间存在共同的多基因成分。我们从荟萃分析中筛选出与年龄相关性黄斑变性（AMD）关联度最高的遗传变异（((p<0.05))），在BioVU数据库中检测其与多种血管特征的关联性，并通过独立的基础研究和目标研究验证了这一假设。值得注意的是，我们在AMD相关变异中发现，其与血管特征存在极低P值的高度显著富集，这些血管特征包括外周血管系统先天性异常、骨无菌性坏死以及耳部退行性和血管性疾病，但与外周血管疾病无此关联。Q-Q图（(Q-Q)）中与零分布的显著偏离（图5A-5D，柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验，(p<2.2 ×10^{-16})）也证实了这一富集现象。通过考虑变异间连锁不平衡（LD）的多基因富集经验检验（参见材料与方法），我们进一步发现同一组血管特征仍存在高度显著的富集（经验值，(p<0.001)，0.001）。

我们利用AMD数据集中的效应等位基因构建了遗传风险评分，并发现每种血管特征均与疾病状态存在显著关联，其中尤为值得注意的是外周血管疾病（((p<2.2 ×10^{-16})）（每种表型）均纳入 BioVU 数据库。尽管与年龄相关性黄斑变性相关的变异并未显著富集于与外周血管病关联最强的位点，但对于年龄相关性黄斑变性的顶级变异体，其两个性状间的每单核苷酸多态性遗传力（与 (beta^{2 *} p^{*}(1-p)) 成正比，其中 β 为估计效应量，p 为对照组中的次要等位基因频率）存在显著的斯皮尔曼相关性（((p=7.1 ×10^{-9}))），这一相关性提升了遗传风险评分对血管性状的预测效能。此外，在 BioVU 数据库的参与者中，“未特指视网膜老年性黄斑变性”患者的 GRIK5 基因表达由遗传决定处于最低水平（后 2.5%），且该人群与脑血管疾病（图 S7）、外周血管病（图 2C）等血管性疾病存在显著共病关系（如前所述），这表明 GRIK5 基因的遗传调控机制参与了遗传风险评分对这些血管性状的整体效应调控。

图5. 眼部疾病表型组共有的遗传结构（A-D）(Q-Q) 展示了血管性状的关联p值分布以及年龄相关性黄斑变性（AMD）的顶级变异体。通过一项公开的AMD全基因组关联研究（GWAS），我们发现顶级AMD变异体((p<0.05))（0.05）在多种血管疾病中显著富集，包括骨无菌性坏死（A）、耳部退行性及血管疾病（B）和外周血管系统先天性异常（C），但在外周血管疾病（D）中未出现富集现象。与空集((n=1000))（基于次要等位基因频率（MAF）匹配的单核苷酸多态性（SNP），通过1000基因组计划欧洲样本以5%长度的分箱生成）、最近基因的距离（基于GENCODE基因注释数据）以及连锁不平衡（LD）伙伴数量((r^{2}>0.50))的对比显示，与血管性状关联的富集现象依然存在。

大规模AMD数据集的获取还让我们得以评估，当我们使用非眼部组织作为参考来分析眼部特征时，基因表达插补的效果如何。我们采用一种近期开发的方法，发现组织共享的表达数量性状位点（eQTLs）（定义为在超过90%的GTEx组织中后验概率≥0.90，即40个及以上组织）相比组织特异性eQTLs（在最多10%的组织中后验概率≥0.90，即最多5个组织），对AMD遗传力（解释了2倍比例的遗传力）的解释度更高，且在AMD关联的估计真阳性率方面也表现更优（0.11 vs 0.05）。

grik5 基因敲除动物的血管质量与血管数量受损

对BioVU和MarketScan电子健康记录数据的统计分析显示，眼部特征与血管特征之间存在强烈的共病关系。因此，为研究grik5基因缺失对血管系统的影响，我们观察了出现出血现象的grik5基因敲低斑马鱼胚胎——出血通常由血管破裂、血液渗漏到间质间隙引起。血管内皮完整性受损是出血的常见原因。基于此，我们推断GRIK5基因的表达对维持血管形态和完整性至关重要。为模拟grik5基因表达降低的情况，我们向转基因Tg(flk1:EGFP)胚胎（该胚胎在血管内皮细胞中表达增强绿色荧光蛋白）注射了吗啉代寡核苷酸，并对grik5基因敲低胚胎与对照组进行了分析通过共聚焦成像和三维重建技术观察胚胎的脉管系统（图6A）。我们发现，在grik5严重敲低的胚胎中，脑中央动脉（CtA）和中脑后中央动脉（PMCtA）未能出芽（图6B和图6C）。尽管眼部脉管系统已形成模式，但视神经内环（IOC）的血管全程出现扩张和/或收缩现象（图6B'、图6B''、图6C'、图6C''以及视频S1），这表明脉管系统的结构异常并非由整体发育迟缓导致，而是反映了脉管质量和内皮完整性的下降。在grik5基因突变体中观察到了相似且一致的脉管缺陷，在杂合子同胞中也在一定程度上出现了该缺陷（图S8），这进一步证实了grik5表达量降低与脉管质量受损之间的关联。

为直接检测grik5缺失胚胎的功能性血管完整性，我们在受精后3天通过主心静脉向循环系统注射0.02微米大小的纳米珠（图6D）。我们使用荧光纳米珠监测Tg(flk1:EGFP)转基因品系绿色标记血管内的血流。通过转盘共聚焦显微镜对活体胚胎的头部和躯干进行成像。在对照组胚胎中，纳米珠被限制在GFP阳性血管内，而在grik5形态发生突变体中，纳米珠从看似完整的血管中外渗（图6E）。在头部，我们在grik5形态发生突变体的前脑、眼睛和耳朵中检测到了纳米珠外渗（图6E），而对照组均未出现外渗。同样，在躯干中，形态发生突变体和遗传突变体的节间血管均出现纳米珠外渗（图6F-6I）。总之，吗啉代敲低和CRISPR-Cas9介导的敲除策略在斑马鱼胚胎中均产生了相似的血管缺陷，支持了grik5是斑马鱼血管完整性所必需的这一假说（图6J）。

图6.在Grik5-耗尽胚胎中由纳米珠揭示的血浆外渗

讨论

图7总结了我们在此描述的发现范式。在BioVU中开展的PrediXcan研究得出的整体结果模式具有显著且不同寻常的特点。我们并未观察到基因的遗传预测表达与某一表型之间存在单一的显著关联，而是发现单个基因经遗传决定的表达水平降低会这与许多通常不被认为具有共同遗传机制的不同眼部疾病相关。生物样本库的使用是这一发现的关键，因为若非如此，就不可能检测到它与如此多种眼部疾病的关联。正是这一发现的特殊性，推动了模式系统验证研究的开展。在这种情况下，斑马鱼是一个特别有吸引力的模式系统，因为斑马鱼的眼睛在整个早期发育阶段都易于研究，且现代基因编辑技术为快速验证研究提供了便利。对斑马鱼GRIK5敲低和敲除模型的初步研究结果凸显了该基因对眼睛正常血管生成（包括发育过程中以及整个生命过程中血管通透性方面）的作用。此处斑马鱼发育阶段眼睛中GRIK5高表达的证据，以及其他学者报道的小鼠和松鼠中的相关结果，结合我们关于grik5在血管形成模式中功能的数据，为我们观察到的与GRIK5的GReX相关的多种眼部疾病提供了可能的致病机制线索。我们通过寻找眼部疾病与血管疾病之间共有的遗传结构来为这一假设寻找支持依据；具体做法是在更大样本中验证GRIK5的GReX水平降低与血管疾病和眼部疾病之间的关联BioVU 中的样本规模。我们还寻求在大规模电子健康记录（EHR）研究中，为血管疾病与眼部疾病之间存在显著共病性提供证据支持。在这些研究中，我们发现，基于眼部疾病（黄斑变性）全基因组关联研究（GWAS）荟萃分析结果构建的多基因风险评分，与 BioVU 中的血管疾病存在显著关联；此外，血管疾病与眼部疾病的显著共病性不仅存在于范德比尔特大学生物样本库（SD）中超过 260 万的研究对象中，也存在于某大型保险数据库中 1.5 亿的研究对象中。从生物样本库的研究发现出发，在斑马鱼模型中进行验证并开展进一步研究，再回到生物样本库和更大规模的电子健康记录数据集，开展共病性研究以及眼部与血管表型间共享遗传结构的研究，以此验证斑马鱼机制层面的研究发现，这一可循环迭代的研究模式，是我们发现范式的核心特征。

图7。通过基于EHR和生物库的发现平台和动物模型作为验证工具识别疾病机制的策略。我们将 BioVU 作为基于电子健康记录（EHR）和生物库的发现平台。通过全转录组关联分析方法 PrediXcan，从 BioVU 中鉴定出与性状相关的基因。GRIK5 与多种与眼部疾病相关的 GRIK5 表达特征显著相关，因此被选用于斑马鱼动物模型的功能验证。通过 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑（敲除，KO）和吗啉代寡核苷酸介导的敲低（KD）等功能获得与功能缺失方法，在斑马鱼中发现了相关表型。这些表型进一步为利用独立表型组数据集（通过进一步的生物库基因分型和公开的全基因组关联研究[GWASs]获取）开展的统计分析提供了依据，以验证与斑马鱼中相关的眼部和血管疾病表型。斑马鱼的系统水平分析为疾病机制提供了证据，即血管特征与 BioVU 中的眼部疾病特征相关。随后在范德比尔特大学所有电子健康记录（EHR）数据以及超过1.5亿名受试者中开展的共病研究40，进一步验证了斑马鱼的研究发现，即眼部疾病和血管疾病存在共病关系，且具有共同的遗传结构。缩写 OE 表示过表达（overexpression）。

我们的研究数据支持这一假设：作为此类疾病多基因遗传结构的一部分，发育中人眼血管生成不佳确实可能会增加成年后患上多种不同眼部疾病和病变的风险。基于这些研究结果，维持正常的血管系统也是一个值得进一步探究的明显附加机制，其可作为人类迟发性眼部疾病的致病因素。在这方面，补体系统的作用，多项遗传学研究已证实其与黄斑变性的患病风险相关，而这一因素在血管通透性方面与我们在grik5斑马鱼模型中观察到的血管渗漏现象存在有趣的相似之处。通过对海量个体电子健康记录（EHR）数据进行共病研究发现，黄斑变性与各类血管疾病共病的可能性尤为显著。这些发现或许能进一步印证，补体系统对血管通透性的影响确实可能是补体系统基因变异增加黄斑变性患病风险的机制之一。电子健康记录中眼部与血管疾病共病的特异性，以及基于MarketScan保险索赔数据库中超1.5亿人群的眼/血管疾病共病结果验证，为眼部病变与血管特征之间存在共同遗传成分提供了进一步的支持。

斑马鱼研究提供了关键信息，即斑马鱼grik5同源基因在眼睛、耳朵和大脑的早期胚胎发育阶段（第3天）高度表达；这些结果在小鼠眼睛中也同样被观察到。在此阶段通过吗啉代或CRISPR基因编辑技术完全或大幅敲除grik5，会导致血管数量显著减少以及血管通透性升高。多种共病血管病症均发病极早（血管系统先天性异常或出生时即出现的孟德尔病），且大型黄斑变性荟萃分析中的顶级SNP信号在远早于黄斑变性出现的血管疾病中高度富集，这两点均与以下假说相符：血管功能的早期发育缺陷和/或终身细微缺陷会增加晚发性眼部疾病的发病风险。

人类中观察到的GRIK5表达变异性可能比我们在斑马鱼中鉴定出的变化更为温和，而在BioVU研究对象预测的表达降低范围内，GRIK5表达降低对眼部正常脉管系统造成的影响也可能同样温和。在人类中，影响GRIK5表达的遗传变异无疑是血管生物学和疾病以及眼部疾病多基因结构的一部分，而非将GRIK5归为能够单独引发孟德尔式眼部或血管疾病的“主要基因”，甚至也不是Boyle等人55命名法中的“核心基因”。因此，我们并未发现，甚至也未曾预期在GRIK5表达降低或敲除的斑马鱼中，出现与人类晚发性眼部疾病等效的病症。鉴于晚发性眼部和血管疾病具有多基因特性，我们此前并不确定能否观察到任何表型，最初研究的重点之一就是探究GRIK5在斑马鱼中的表达范围和分布情况。

在斑马鱼中观察到的血管表型与grik5表达的关联，可归因于这种谷氨酸受体具有一项重要功能，这与其他谷氨酸受体多功能性的相关研究发现相符。我们的研究结果表明，GRK5 与血管的形成和维持存在关联。在对基因敲低和基因敲除动物的研究中，我们发现 GRK5 缺陷的胚胎无法在大脑中形成正常的血管结构，这一缺陷导致血管分支更少、更细小。我们还观察到，在活体转基因胚胎中，部分区域的血管直径存在差异，出现扩张和收缩的情况。微血管造影术直接证实，GRK5 缺失的胚胎血管通透性显著增加。由 GRIK5 表达所介导的这些血管功能，使我们提出假设：血管生物学可能与迟发性眼部疾病的发生发展相关。我们通过共享遗传结构分析以及基于大规模电子健康记录（EHR）的共病研究，为这一假设提供了证据支持；研究结果与“血管疾病是导致人类迟发性眼部疾病的诱因之一”的假设相一致。

尽管我们有把握认为GRIK5表达降低所引发的血管相关后果会增加眼部疾病的患病风险，但我们无法确定这是GRIK5表达降低导致眼部疾病的唯一机制。GRIK5在内皮细胞中表达（图S3C），但研究也表明，该基因在小鼠的视网膜感光细胞中也有表达。我们观察到GRIK5在3日龄斑马鱼胚胎的眼部组织中呈高表达状态（图S3）。因此，GRIK5表达降低所引发的其他早期或晚期生物学效应也可能参与眼部疾病的发生发展。

从方法学角度来看，本研究提出了一个高效的基因-疾病关联发现框架。事实上，通过利用生物库中大量可用的疾病表型（测试了1145种表型代码），我们发现，在GRIK5表达水平最低的人群（即最接近表现出GRIK5基因敲除特征的人群）中，血管特征性疾病和眼部疾病的患病风险显著升高。因此，以基因决定的表达水平为条件开展全表型组多效性扫描，能够发现与医学表型组相关的基因。本研究以血管疾病与眼部表型的共病性为研究重点来阐释该方法，这是因为涉及的眼部疾病数量较多，但该方法可广泛应用于关联关系及其相应机制的发现研究中。

基于生物样本库的研究所提出的研究问题与模式系统基因敲除研究的问题本质上相似——都是“这个基因有什么功能？”，而非“哪些基因和变异与该疾病相关？”——因此，基于生物样本库的研究与模式系统研究有着天然的对应关系，这使得在人类研究与模式系统研究之间进行迭代的方式更为明确。尽管与人类常见疾病相关的基因的发现以及在可预见的未来，阐明这种遗传变异影响疾病发病风险的机制仍将是一项艰巨的工作，但将现代基因编辑技术与应用于生物样本库的大规模数据整合方法相结合，为实现这一目标提供了可行的研究模式。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。