标题：In Vivo Measurement of Glycine Receptor Turnover and Synaptic Size Reveals Differences between Functional Classes of Motoneurons in Zebrafish

期刊：Current Biology（2017）

原文链接：http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2017.03.032

摘要

突触受体蛋白在突触处的结合与解偶联之间的相互作用，在决定受体浓度和突触强度方面发挥着重要作用，结合动力学的变化与突触可塑性之间存在已知关联。此类动力学的调控或许能满足完整神经环路中神经元的特定功能需求。然而，绝大多数关于突触更新动力学的研究都是在正常神经环路之外的培养神经元中开展的，且尚未在体内对单个突触位点的突触受体更新进行过测量。我们通过在完整斑马鱼体内对突触进行光转化后荧光恢复的方法，量化了甘氨酸能受体动力学的分布，并将恢复动力学与两种功能不同的细胞——初级运动神经元和次级运动神经元的突触体积相关联。在两种运动神经元中，光转化后荧光恢复的速率均随突触体积增大而降低，即更大的突触恢复速率更慢。初级运动神经元的突触体积更大，且对应的恢复时间也比次级运动神经元更长。我们的研究结果表明，突触动力学与突触体积协同调控，并反映出神经元在其所属神经环路中所承担的功能角色。

引言

尽管突触结构具有长期稳定性，但其分子组成却具有动态性。突触后受体和支架蛋白可在突触周围膜中自由扩散，并能暂时锚定在突触位点上。可塑性的产生部分源于被锚定突触蛋白数量的变化。因此，突触成分结合与解结合之间的动态平衡会影响受体数量和突触强度]。这些突触动力学在短时间尺度上通过依赖于神经活动的过程经翻译后修饰进行调控。在更长的时间尺度上，突触的稳态调节缩放还与受体扩散动力学的变化相关。

受体更新动力学在短时间和长时间尺度上对突触动态的重要性已得到充分证实，这表明此类更新在体内发挥着关键作用。我们可以预期，单个神经元上不同突触的更新模式存在差异，不同细胞类型之间也可能存在差异，这或许能反映它们在神经网络中的功能角色。然而，大多数受体更新研究都集中在培养的神经元上。尽管在完整动物的单个突触上测量受体更新的能力能够将突触特性置于完整神经环路的背景下，但目前尚未实现这一测量。本研究中，我们在完整的斑马幼体中，对不同类型脊髓运动神经元单个突触上甘氨酸能受体的更新动力学进行了测量，以探究体内不同突触以及功能不同的神经元之间受体更新的差异。

斑马鱼运动神经元构成一个功能异质性群体，随着游泳速度的提升，它们会以有序的方式被募集。每个体节中体型更小的所谓次级运动神经元（SMNs）参与低速游泳活动，而可单独识别的初级运动神经元（PMNs）仅在最快的游泳动作和逃逸行为中被募集]。这些神经元按顺序发育，首先是驱动强烈且幅度较大运动的PMNs，随后是控制较弱且幅度较小行为的SMNs。这种有序的神经元募集与运动控制的发育完善相关，为研究受体更新与细胞类型内功能细分之间的关系提供了可能性。

所有类型运动神经元的模式化激活都依赖于甘氨酸能突触，这类突触对于控制游泳过程中的交替弯曲至关重要，且已知其在斑马鱼体内会表现出稳态调节。我们利用多光子成像技术，结合光转化后荧光恢复法，对标记有dendra2的甘氨酸受体（GlyR）α1亚基进行检测，以确定完整斑马鱼突触处GlyR更新的动力学特征。随后，我们验证了以下假设：前主神经元（PMNs）和主运动神经元（SMNs）之间的功能差异，与这两类细胞突触群体中受体更新动力学的差异相关。本研究揭示了前主神经元和主运动神经元上甘氨酸能突触的动力学特征存在差异，前主神经元拥有更大的突触，且受体更新速度更慢。这种差异可能与细胞的功能作用有关，因为主运动神经元突触强度的动态调节或许能实现运动行为的持续、细微优化。从而实现通过较弱运动单位的总和来实现更精细的分级控制。我们的研究提出了一种可能性：神经元之间受体更新的差异，可通过调节突触的不稳定性及可塑性，使神经元与其功能相匹配，从而支持它们在神经环路中的作用。

结果

Dendra2 标记的甘氨酸受体 α1 亚基定位于甘氨酸能突触并可形成功能性通道

为了研究甘氨酸受体（GlyR）更新的动力学，我们通过向单细胞阶段斑马鱼胚胎注射由囊泡乙酰胆碱转运体（VAT）启动子驱动的Gal4以及含有UAS-Dendra2-甘氨酸受体α1亚基（GlyRa1）的质粒，在运动神经元（PMNs）中随机表达了光可转换荧光团dendra2标记的甘氨酸受体α1亚基（GlyRa1）。这使得标记的胆碱能神经元[23]稀疏地分布在脊髓和大脑中。带有dendra2标签的受体形成了离散的斑点（图1A）

在运动神经元的躯体区域、腹侧树突以及树突分支上。在运动神经元腹侧树突上一个已知的甘氨酸能突触位点处，可见一大簇受体，该位点会受到强烈的连合侧抑制[24-26]。这些观察结果以及受体簇的整体分布与受体的突触靶向性相符。为更精准地检测GlyRa1的突触定位，我们对结构相似的增强型绿色荧光蛋白-甘氨酸受体α1（eGFP-GlyRa1，得益于抗eGFP抗体的可获得性）与抑制性突触标志物gephyrin进行双重免疫染色，以探究eGFP-GlyRa1是否定位于内源性gephyrin也存在的位点。二者高度共定位，自动检测[27]出的eGFP超阈值体素中，平均73%同时也呈现gephyrin超阈值染色。在突触区域，两个通道的平均相关系数为(r=0.35)，表明eGFP与gephyrin的荧光信号呈共变关系。这些结果与转基因GlyRa1构建体在体内被转运至突触位点的结论一致（图S1）。

图1. 运动神经元中dendra2-GlyRa1的表达、肌纤维中dendra2-GlyRa1通道的生理学特性以及dendra2光转换的突触水平靶向。(A)单个运动神经元表达树突状2-甘氨酸受体α1（绿色）以及膜靶向tdTomato（品红色），在标记的胞体和树突上呈现出分布的甘氨酸能斑点。与gephyrin的共染色情况参见图S1。(B) 在肌肉中表达树突状2-甘氨酸受体α1以检测通道形成。左侧：用于膜片钳记录的转基因肌纤维。右侧：在肌纤维中指定保持电位下的电压钳记录。(C) 借助405纳米激光的精准靶向，我们能以接近单突触的精度将突触定位的树突状2-甘氨酸受体α1从绿色荧光（上图）转换为红色荧光（下图，以品红色表示）。

单个突触位点光转换后的荧光恢复揭示甘氨酸受体更新动力学与突触大小的相关性

突触结合的甘氨酸受体（GlyRs）及甘氨酸受体-格菲林复合物可能从突触位点解离，并在质膜中侧向扩散。我们通过突触光转换后的荧光恢复实验来估算甘氨酸受体的解离动力学。通过将突触结合的树突状荧光蛋白2-甘氨酸受体（dendra2-GlyR）从绿色光转换为红色，随后随时间追踪被转换的突触，我们得以在体内定量分析甘氨酸受体更新的动态变化。我们使用405纳米激光器的精准低功率多次脉冲，对标记的运动神经元（PMNs）上的一个或多个突触进行光转换（图1C）。被转换的突触呈现出红色荧光的显著增强（相较于未转换突触，增强倍数为12.7±1.5，(n=234)），同时绿色荧光显著下降（降至转换前强度的21.2%±0.75%，图S5E）。我们最初以30至50分钟的间隔对神经元进行监测，持续时长可达3小时，之后则以数小时为间隔继续监测（图2及图S2）。在28小时的观测期内，对单个被转换突触的持续成像与追踪显示，绿色荧光随时间逐渐恢复（图S2A）。不过，标记的整体荧光强度有时会出现波动，这一现象可由光漂白（图S2A插图及图S2B）、光转换过程、幼虫的运动行为，以及长时程实验中包埋深度和角度的差异等因素解释。我们对这些整体强度变化进行了校正处理。通过未转化突触的平均值对每个时间点转化突触的绿色荧光强度进行标准化处理。在持续超过10小时的成像实验中，经校正后的平均恢复水平为原始荧光强度的103%±11.3%（(= 15)，n=15个突触）；而在6至10小时的实验中，该数值为57.1%±5%（(n=24)，n=15个突触）。不同突触位点的校正时间进程显示出异质性的恢复时间（图2B和图2C），这些恢复时间与形如(f(t)=1-exp (-t / tau))的指数恢复曲线拟合效果良好（图2C）。

图2 光转化反应分析恢复时间过程曲线。(B) (A) 中的数据与五个不同光转换突触的估计 rePMNs 以及估计的恢复常数 T 序列一同绘制，另见图 S2。(A) 归一化的最大投影时间

接下来，我们测量了受精后8天（dpf）17个运动神经元（PMN）中采样的恢复常数分布，该发育阶段脊髓运动回路已具备功能。恢复时间存在差异（中位数为(tau=8.8)，四分位距为5.1–17.0小时），且似乎与突触大小相关。相比之下，通过转换前后强度比值量化的转换效率之间无显著相关性（数据未展示，(p=0.25)）。恢复时间与突触相对起始强度的关系图显示，较大的突触具有更长的恢复时间（图3A）。由于我们对每个细胞中的多个突触进行了转换，我们构建了一个关于恢复时间自然对数（ln t，经转换以满足正态性假设）的线性混合效应（LME）模型，该模型可控制细胞重复贡献的影响。我们的模型支持以下假设：突触起始尺寸越大，ln T的平均值显著越高。通过分析转换后的突触位于树突分支还是运动轴突起源的腹侧树突/轴突丘，我们发现两种突触类型均遵循相同的大小/恢复趋势（图3B），其中腹侧树突的突触尺寸通常更大、恢复动力学更慢（ln (tau=beta 1) *相对强度 + b2，- (beta 1=0.3866 ln h)，(SE=0.10)，(p<0.001)；若为轴突突触则取值为1，否则为0，(SE=0.23)，(p=0.09)）。

图3. 8天龄后体节期运动神经元中甘氨酸受体的更新动力学。(A)从17个8天受精后（8-dpf）运动神经元（PMNs）中采样的77个突触的估计恢复参数t的自然对数，相对于其归一化起始强度（相对强度）的绘图（每种颜色代表来自同一细胞的光转换突触，X标记该细胞的中位数）。(B) 上方图表中的相同数据经重新编码，以展示存在于树突分支上的突触（红色）或腹侧树突/轴突始段区域的突触（黑色）。

总之，我们对完整斑马鱼幼虫中运动神经元突触的甘氨酸受体更新速率进行了采样。我们发现运动神经元突触的半衰期范围为2小时至17小时以上。此外，我们的分析表明，强度更高、体积更大的突触具有更慢的更新动力学。与这一总体趋势一致，腹侧树突/轴突丘区域的突触——此处分布着功能尤为强大的甘氨酸能突触——其脱动力学速率慢于其他树突区域。

SMNs 的周转动力学比 PMNs 更快

PMNs 是参与强力运动的一类运动神经元。另一类 SMNs 则参与较慢的运动行为。我们试图探究动力学与所发挥的功能作用之间可能存在的关联每种运动神经元类型的动力学特性或许能反映突触大小或可塑性的差异。为了控制动物年龄差异，并探究动力学特性在发育过程中的变化，我们对不同日龄的幼虫进行了取样。在部分实验中，我们对同一细胞进行了长期追踪。运动神经元（PMNs）和梭形运动神经元（SMNs）可根据轴突形态、胞体大小以及在脊髓中的位置轻松区分（图4A）。我们对20个PMNs中的94个PMN突触和15个SMNs中的77个SMN突触的动力学特性进行测量后发现，尽管二者的分布存在重叠，但PMN突触的恢复时间分布显著向更长的时间值偏移（图4B，双样本柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫（KS）检验，(D=0.3349)，(p<0.0001)）。此外，我们观察到SMNs存在快速的周转速率，而这在我们最初8天 post-fertilization（dpf）的PMN数据集里并未发现。通过对标准化衰减的分析也得到了类似结果红色荧光（图S3A）与绿色荧光恢复的动力学显著相关（图S3B、(beta=0.7440)、(t(170)=31.3)、(p<0.001)）。尽管二者相关性良好，但在单个突触处，红色荧光分析得到的数值系统性地低于绿色荧光的数值，这可能是两种波长的归一化流程和穿透深度存在差异所致。我们推测，脊髓运动神经元（SMNs）更快的恢复动力学是否可由突触大小或位置的差异来解释，因此接下来旨在探究两种细胞类型在突触组织方面的差异。

图4. 从初级运动神经元和次级运动神经元测得的甘氨酸受体内吞周转动力学分布。(A)光转化实验前，9天胚胎期（dpf）dendra2-GlyR α1标记的运动神经元（PMN，左侧）和脊髓运动神经元（SMN，右侧）的图像。运动神经元的胞体比脊髓运动神经元更大，且在腹侧树突/轴突丘区域拥有大型特化的甘氨酸能突触（见腹侧簇箭头）。(B) 对94个运动神经元突触（灰色）和77个脊髓运动神经元突触（绿色）进行光转化实验后，得到的估计恢复时间T（对数坐标轴）叠加直方图。运动神经元突触更可能具有更长的恢复时间（自然对数t值更大），这一差异具有统计学意义（双样本柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验，(p<0.001)）。另见图S3。

红色荧光（图S3A）与绿色荧光恢复的动力学显著相关（图S3B、(beta=0.7440)、(t(170)=31.3)、(p<0.001)）。尽管二者相关性良好，但在单个突触处，红色荧光分析得到的数值系统性地低于绿色荧光的数值，这可能是两种波长的归一化流程和穿透深度存在差异所致。我们推测，脊髓运动神经元（SMNs）更快的恢复动力学是否可由突触大小或位置的差异来解释，因此接下来旨在探究两种细胞类型在突触组织方面的差异。

运动神经元的突触大于脊髓运动神经元

由于PMNs内较慢的动力学与更大的突触大小相关（见图3），我们在不同细胞类型中观察到的动力学差异，一个可能的解释是PMNs的平均突触大小大于SMNs。然而，我们之前的突触大小指标——相对强度无法用于比较不同样本，因为它是在每个样本内进行归一化的。此外，由于除受体数量外，强度还会随激发强度和样本透明度而变化，因此也无法使用原始强度测量值。为了规避这些问题，我们开发并验证了一种替代的突触体积估算方法（图S4）。简要来说，对多光子堆叠图像进行去卷积处理，然后以树突区域平均强度值以上6个标准差为阈值进行阈值化处理。随后，将包围每个特定突触的指定长方体中超过阈值的体素体积估算为突触体积（详见补充实验方法部分的详细解释）。

随后，我们针对不同细胞类型应用该技术，以确定运动神经元（PMNs）和脊髓运动神经元（SMNs）的突触体积是否存在差异。在8至9日龄斑马鱼（(n=14) 为运动神经元样本、11 个脊髓运动神经元样本）中，我们观察到脊髓运动神经元的平均突触体积小于运动神经元（图5A左图；脊髓运动神经元对应 (bar{x}=0.23 mu m^{3})，运动神经元对应 (0.45 mu m^{3})，(p<0.05)，双样本t检验）。与此一致，每个细胞中体积最大的10%突触的平均体积，运动神经元也显著高于脊髓运动神经元（图5A右图；脊髓运动神经元对应 (bar{x}=0.61 mu m^{3})，运动神经元对应 (1.45 mu m^{3})，(p<0.01)，双样本t检验）。然而，两种细胞类型中，突触平均体积均随其与细胞体距离的增加而减小，突触的平均频率也呈现相同趋势（图5B）。为控制这些因素，我们对体积（经对数变换以满足正态性，见图5C）构建了线性混合效应（LME）模型。在该模型中，每个b代表变换后体积的变化率，细胞类型对其存在显著影响。类型（((beta=-0.10 mu m^{3}) 适用于SMNs，(SE=0.05)、(p<0.05)）以及与胞体的突触距离（(beta=-0.003 mu m^{3}) 每毫米距离，(SE=0.0004)、(p<0.001)）。这些结果表明，在受精后8至9天，运动神经元中突触体积的分布平均值显著大于脊髓运动神经元，且两种细胞类型的突触体积均随与细胞胞体距离的增加而减小。结合我们之前关于更新率随突触大小变化的证据，运动神经元和脊髓运动神经元之间的差异可能是整体突触大小差异导致的结果。

图5. 在8至9日龄斑马鱼运动神经元中测得的突触体积与突触到胞体的距离。(A) 箱线图展示了8-9日龄斑马鱼中，每个神经元所有突触（左图）或最大10%突触（右图）的平均突触体积分布的中位数（红线）、四分位距（箱体）和全范围（须），以及自动识别的异常值（+符号），涉及14个运动神经元（1239个突触）和11个躯体运动神经元（665个突触）。双样本t检验证实整体分布存在统计学显著差异（中位数分别为(0.23 mu m^{3})、(0.45 mu m^{3})和(p 0.017)）；(B) 针对运动神经元和躯体运动神经元中10%的突触尾部，绘制了随树突到胞体距离增加的平均突触体积（柱状图，左纵坐标）和平均突触数量（折线图，右纵坐标），其中位数分别为0.6、(0.60 mu m^{3})、(1.45 mu m^{3})和(^{*} p=0.004)，数据来源于同一组运动神经元和躯体运动神经元。另见图S4。(C) 对同一批运动神经元和躯体运动神经元的突触体积进行四次方根变换以满足正态性后，得到的平均频率直方图。插图展示了每种细胞类型未变换的平均累积分布。

突触大小及突触与胞体的距离可解释甘氨酸受体更新动力学的变异

为探究突触大小相较于其他变量对周转动力学的潜在影响，我们首先对光转换样本进行了探索性统计分析，以观察两种细胞类型间参数的变化情况（参见补充实验方法与图S5），并选取具有显著预测性的变量纳入3至14天龄幼体运动神经元的线性混合效应（LME）模型中（自然对数转换的时间=突触体积+突触至胞体的距离+幼体日龄+细胞类型+幼体日龄×细胞类型）。尽管动力学变化总体上与运动神经元胞体的背腹侧位置相关，但由于该因素在每种细胞类型内的相关性不显著，因此未将其纳入模型（图S5D）。与此前一致，……之间不存在显著相关性。ln t 与光转化效率相关（图S5E）。Ln T 随突触体积显著增加，表明较大突触的周转动力学更慢（图6，左；(beta=0.38)、(per mu m^{3})、(SE=0.09)、(p<0.001)）。同样，突触到胞体的距离增加，动力学也会变慢（图6，右，(beta=0.03) 每微米距离、(SE=0.008)、(p<0.001)）。幼体年龄与运动神经元类型之间存在微弱的交互作用，即随着幼体年龄增长，SMN 突触的周转速率变慢，而 PMN 突触则无此变化（与相同体积和到胞体距离的 PMN 突触相比，SMN 的 ln t 随幼体年龄每增加1天受精后天数降低1.04，(tau=0.09 ln h cdot)、(SE=0.04)、(p<0.05)）。总体而言，该模型强调了突触体积和与胞体的距离在预测甘氨酸受体（GlyR）周转动力学中的重要性。在其他条件相同的情况下，较大的突触比较小的突触周转更慢，且对于特定大小的突触，位于胞体远端的突触动力学比近端突触更慢。此外，该结果表明，PMN 和 SMN 之间观察到的动力学分布差异，主要是由突触体积的差异导致的。

图6. T与突触体积或突触到胞体距离的关系。（A）光转化的PMN和SMN突触的t值与其体积的关系图。虚线框内的特别大的突触是PMN腹侧树突/轴突始段区域的特化突触。（B）所有光转化的PMN和SMN突触的t值与其沿树突到细胞体的距离的关系图。注意两个图中t值均采用对数坐标轴。另见图S5和图S7。

年轻突触比成熟突触体积更小且更新动力学更快

我们的数据表明，多极神经元（PMNs）和单极神经元（SMNs）之间甘氨酸受体（GlyR）更新动力学的差异，是由两种细胞类型间突触体积分布的不同所导致的。然而，目前尚不清楚这种差异是如何产生的。一种假设是多极神经元的发育时间长于单极神经元，因此拥有更大的突触。但对年龄匹配的运动神经元的分析并不支持这一观点（参见图S6B）。另一种可能性是多极神经元和单极神经元的突触年龄不同。为了探究我们之前的结果与突触年龄（而非运动神经元或幼虫年龄）之间的关系，我们对5、7、8和9天受精后（dpf）的神经元进行了成像，并确定了连续时间点之间抑制性突触的出现和消失情况（图7A）。我们首先试图通过比较8天受精后（dpf）（图7Bi）和9天受精后（dpf）（图7Bii）突触的大小，来探究突触年龄与体积之间的关系。这些突触在那之前的已知时间点形成。在两种发育阶段中，多极神经元（PMNs）内的成熟突触均大于年轻突触（体积1/4 = 突触年龄 + 类型 + 突触年龄×类型；每日 (beta Age_{8 d p t}=0.09 mu m^{3 / 4})、(SE=0.01)、(P_{8 d p t}<0.001)：每日 (beta Age _{9 d p t}=0.065 mu m^{3 / 4})、(SE=0.008)、(P_{9 d p t}<0.001)），其中突触年龄被建模为分类变量。然而，单极神经元（SMNs）的突触体积仅在9天pf（受精后天数）的数据集中随年龄显著增加（每日 ((beta Age _{8 d p t}=-0.004 mu m^{3 / 4})；(SE=0.02)、(P_{8 d p t}<0.001)；每日 (beta Age _{9 d p f}=0.065 mu m^{3 / 4})、(SE=0.008)、(P_{9 d p t}<0.001)）。这种差异可能是由于单极神经元（SMNs）突触的最终体积小于多极神经元（PMNs），因此其体积在约3天后不再呈线性增长（需注意9天pf的运动神经元在图7B中还有2-3天的额外分类）。

为验证年轻突触可能比成熟突触稳定性更低且更新动力学更快这一可能性，我们在受精后第8天（8 dpf）对新形成（出现于8 dpf）、1天龄（出现于7 dpf）或2天以上龄（5 dpf时已存在）的突触开展了光转化实验。新形成的突触其动力学显著快于成熟突触（图7Ci）。为更系统地探究突触年龄对动力学的影响，我们构建了线性混合效应（LME）模型（自然对数转换的T值 = 突触体积 + 突触到胞体的距离 + 突触年龄 + 细胞类型 + 突触体积×突触到胞体的距离），并将突触年龄设为分类变量。与此前结果一致，体积对自然对数转换的T值具有显著贡献，体积更大的突触其相关指标更长（efeal732-c63c-481b-b90f-605c25d3b296、(SE=0.82)、(p<0.005)）。同理，突触更新率随其到胞体距离的增加而降低（(beta=0.029) 每微米小时，(SE=0.014) (p=0.052)）。胞体距离与体积的交互项未表现出显著性（((p=0.08))）。我们的数据表明，无论突触位于运动神经元（PMN）还是次级运动神经元（SMN），只要体积和到胞体的距离相同，其自然对数转换的T值相近（((p=0.17))）。在PMN和SMN中，8 dpf新形成的突触其动力学均倾向于快于成熟突触（图7Cii，新形成突触与2天以上龄突触的自然对数转换小时值分别为(SE =) 0.24、(p=0.008)）。我们的模型显示，不考虑突触体积和到胞体的距离，新形成的新形成的突触的ln t值低于较成熟的突触。综合来看，这些结果得出的结论是，新形成的突触可能比已形成时间更久的突触更不稳定，并且甘氨酸受体的解结合速率更高。

图7. 突触的年龄与动力学。(A)对在受精后5、7、8和9天成像的示例PMN（左）和SMN（右）进行新突触形成情况的检测。对单个突触进行编号，以展示随时间追踪的示例。值得注意的是，由于从更腹侧的突起长出新分支，PMN（左，蓝色插图）在受精后8天出现了新的突触9和10，同时之前包含突触5、6和7的分支消失了。图像左下角的白色标尺为2毫米。(B) 按每个突触的形成时间排序的受精后8天（上图）和9天（下图）运动神经元的突触体积（共56beda-5b3b-4a18-8b77-353886ed0530和7个SMN，统计数据见正文；另见图S6）。误差棒代表均值标准误。(Ci和Cii) 新突触、1日龄突触和2日龄以上突触的t值累积频率直方图（Ci），以及光转化突触的t值（对数坐标轴）与其体积的关系图（Cii）。蓝色线表示线性混合效应模型对2日龄以上突触的拟合结果。另见图S7。

总之，我们首次量化了原代运动神经元（PMNs）和脊髓运动神经元（SMNs）体内甘氨酸受体（GlyR）更新的动力学过程，证实这两种神经元的t值分布范围从不足一小时到数十小时不等。原代运动神经元的突触动力学存在恢复时间较慢的尾部特征，而脊髓运动神经元则无此特征。我们的线性混合效应模型（LME）表明，突触体积以及突触到胞体的距离是两种细胞中甘氨酸受体动力学速率的关键决定因素。此外，对比两种细胞在受精后第8天（8 dpf）突触体积分布的整体差异，我们得出结论：原代运动神经元拥有脊髓运动神经元中不存在的大型突触，且原代运动神经元与脊髓运动神经元的动力学差异源于突触体积分布的不同。尽管突触体积会随年龄增长而增大，但脊髓运动神经元突触的平均体积可能小于原代运动神经元突触。最后，新形成的突触比已形成较久的突触具有更快的动力学特性，这表明动力学特性在一定程度上反映了突触的稳定性。

讨论

突触大小的分布和突触后受体的动态变化对神经元功能至关重要。二者相互关联，因为突触处受体结合与解离的平衡决定了受体的稳态数量和突触强度。我们可以根据神经元类别的功能角色，预测不同神经元类别之间突触大小分布及相关受体动态的差异，但此前尚未研究过这种关联。我们能够在活体中监测特定突触的更新速率，这使我们得以探究树突分支上不同位置、不同大小和不同年龄的甘氨酸能突触之间的更新动力学关系。我们针对两种功能不同的细胞类型——运动神经元（PMNs）和脊髓运动神经元（SMNs）开展了这项研究，以探究驱动快速运动输出与慢速运动输出的神经元之间，受体动态变化和突触大小分布存在何种差异。

多形核白细胞在体内的周转率（平均半衰期为11.8小时）与体外测定的膜结合型甘氨酸受体周转率处于同一数量级（平均半衰期为20.2小时），该数据来自对培养状态下被印防己毒素阻断的腹角神经元的研究。目前尚无针对单个中枢突触受体周转率的体内研究。不过，乙酰胆碱受体的周转率也已在体内的神经肌肉接头以及颌下腺神经节中得到研。在颌下腺神经节中观察到的乙酰胆碱受体周转率，与在皮质突触处测定的更快的PSD95周转率（33] ((tau=57.7 ~min))）相符，但与神经肌肉接头处观察到的长得多的周转率形成对比（((tau=484.7 hr))）。在这两种情况中，用于标记受体的毒素都可能使受体周转率偏离基础水平。

在我们研究的两类运动神经元中，GlyR 的关闭动力学均随突触体积的增大而降低。兴奋性皮质棘突中的突触支架蛋白 PSD-95 也存在类似关系。PSD-95 的更新速率远快于 GlyR，但在体积更大的棘突中，其更新速率也更慢。体积与更新速率之间的这种关系，部分可能源于大型突触的周长与面积比值更低。随着速率光转换后的恢复速率反映了结合动力学远慢于扩散时的解结合（关闭）速率，本研究的情况正是如此，数据表明受体水平的差异可能部分受解结合速率的调控。重要的是，针对PSD95和乙酰胆碱受体（AChRs）的研究发现，在剥夺突触输入或轴突切断后，其动力学发生了变化，这与活性依赖过程通过改变结合亲和力来调节突触强度的机制相符。

在8至9日龄斑马鱼幼鱼的PMNs和SMNs中，甘氨酸能突触的数量随与胞体距离的增加而减少，且伴随突触尺寸出现小幅但显著的下降。甘氨酸能突触数量的这种减少趋势与哺乳动物运动神经元中的情况相似。不过，甘氨酸能突触尺寸随树突分支距离增加而减小的规律，与成年哺乳动物脊髓中的情况存在差异——在成年哺乳动物脊髓中，运动神经元（MNs）和Ia型中间神经元上的甘氨酸能突触，其平均簇大小和形态复杂度均随距离增加而上升，这可能是为了增强远端突触的影响。伦肖细胞的突触组织则呈现出截然不同的特征：其胞体和近端树突上的突触远大于运动神经元或Ia型中间神经元，且在距离胞体500微米及更远的远端位置完全不存在甘氨酸能突触。但本研究的证据表明，尺寸相近的近端和远端突触，其更新速率在更远端的位置会更慢。我们推测，这可能是由于远端区域游离的膜结合受体丰度降低所致。

我们能够在数天内反复对同一神经元进行成像，这使我们得以观察突触的形成时间，并随时间追踪其大小以及受体更新动力学。在运动神经元（PMNs）和脊髓运动神经元（SMNs）中，突触均随突触龄的增长而变大（图7B）。尽管我们对新突触的样本量有限，但分析表明，在我们的数据集中，最新、最小的突触其更新动力学比基于大小与动力学之间整体关系所预测的更快（图7C）。然而，存在时间超过1天的突触在运动神经元和脊髓运动神经元中均表现出相同的大小-动力学关系，这说明两种细胞类型以相似的方式将结合亲和力与突触大小关联起来。

虽然不同细胞类型间突触大小与受体动力学的关系相似，但突触组织方式仍存在重要差异。运动神经元（PMNs）的甘氨酸能突触比脊髓运动神经元（SMNs）更大，与此相关的是，其受体整体更新速度也更慢。这一发现与此前对斑马鱼幼体运动神经元抑制电流的生理测量结果一致，该测量显示，输入电阻最低的神经元（极有可能是运动神经元）具有更大的抑制电流]。突触组织的细胞类型差异可能是运动神经元诞生更早、突触发育周期潜在更长的结果。然而，我们对比了不同年龄斑马鱼中两种细胞类型以匹配神经元的发育年龄，结果表明情况并非如此（图S6）。相反，运动神经元和脊髓运动神经元的突触体积均随突触发育时间增加而增大，但脊髓运动神经元的突触最终体积明显更小（图7B）。此前一项关于两种细胞类型树突丝状伪足动态的研究发现，脊髓运动神经元的动态性更低，而降低其活性可使这种动态性升高，这表明两种细胞类型的突触形成存在与其活性水平相关的差异。这些差异甘氨酸能突触的大小分布及其相关动力学，很可能反映的是其各自回路内细胞的功能作用与活动模式，而非发育时间本身。

可塑性可能在调节脊髓运动回路中的抑制性突触方面发挥重要作用。与这一观点一致，斑马鱼运动神经元上的甘氨酸能突触因突变导致细胞外甘氨酸增加而表现出代偿性稳态可塑性。活性依赖性可塑性和稳态突触缩放均与突触受体以及支架蛋白的动力学变化相关，且研究发现这些变化似乎先于突触强度的改变。在体内测量动力学的能力将有助于探究其在不同形式可塑性过程中的变化。

本研究提出了一个问题：突触体积和动力学的分布如何与神经环路的功能特性相关。本研究观察到的突触动力学分布可能代表了突触与运动前网络之间连接的特异性调控。对于运动神经元（PMNs）而言，其脱激活动力学的减弱可能有助于形成需要强效且精准抑制作用的高效突触。运动神经元中部分最大的突触位于轴突始段，逃逸环路中特化中间神经元形成的强效甘氨酸能突触在此处与运动神经元相连，而不与其他运动神经元连接。大型突触的维持表明其更新速率受到调控，因为若不对脱激活或激活动力学进行特异性控制，大型突触上的受体可能会出现净流失——这是由于受体外排速率与突触大小成正比（参见[7]中的类似论证），且此处的扩散速率快于受体的结合与解离速率[9]。同样，在小运动神经元（SMNs）中未观察到特化的大型抑制性突触，其动力学更快，突触体积也更小。运动神经元轴突始段以外区域的大型突触也可能代表来自不同突触前中间神经元群的输入。因此，突触动力学和体积的分布可能反映了每种运动神经元在运动网络中所扮演的不同角色。

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