题目：Sensorimotor Representations in Cerebellar Granule Cells in Larval Zebrafish Are Dense, Spatially Organized, and Non-temporally Patterned

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28434864/

期刊：Current Biology

研究亮点

l 我们对行为状态下幼体斑马鱼的小脑颗粒细胞进行成像与记录

l 感觉运动表征是密集且无时间模式的

l 我们还发现了运动相关的活动以及多模态的感觉运动表征

l 这些表征可归为少数几种在解剖学上成簇的反应类型

摘要

神经生物学中的一个基本问题是，动物如何整合来自环境的外部感觉信息与自身产生的运动和感觉信号，以指导运动行为和适应。小脑是脊椎动物的后脑区域，所有这些信号在此汇聚，且与运动活动的习得、协调和校准密切相关。小脑功能理论假设，颗粒细胞在小脑输入层中编码多种感觉运动信号。这些模型表明，其表征应具备高维、稀疏且具有时间模式的特征。然而，针对这些问题的在体生理记录研究十分有限，尤其无法测量群体水平活动的时空动态。本研究利用清醒幼体斑马鱼的钙成像和电生理技术，探究小脑颗粒细胞如何编码三种感觉刺激以及刺激诱发的运动行为。研究发现，大部分颗粒细胞均会对这些刺激产生反应，使得群体水平的表征并不具备稀疏性。相反，我们发现大多数反应仅属于少数几种不同的活动模式之一，这些模式具有时间上的一致性且在解剖学上呈聚集分布。此外，我们还识别出在游泳行为中活跃的颗粒细胞，以及对感觉和运动变量具有多模态反应的颗粒细胞。当我们通过药理学手段改变刺激诱发行为的阈值时，观察到这些表征发生了相关性变化。最后，电生理数据未发现不同刺激时长的编码存在时间模式的证据。

图形摘要

引言

大脑通过感官表征对外部世界进行编码。其编码方式使得这些活动模式能够传递，为了让有机体最大化生存几率，其必须执行的动作需要尽可能多的相关信息。脊椎动物的小脑被认为是这些感觉运动转换的关键参与者，且研究表明它参与运动协调的多个方面、反射的校准、精细运动技能的习得以及经典条件反射。小脑的输入层由小脑颗粒细胞构成，这是许多脊椎动物（包括人类）大脑中数量最多的神经元。受解剖学、生理学和理论论证启发的具有影响力的研究，对小脑功能模型产生了深远影响。

这些模型假设，颗粒细胞将其苔藓纤维输入进行扩展编码，转化为一种稀疏且高维的表征，这种表征可被下游浦肯野细胞识别并学习。这些表征不仅在可能刺激的空间中需保持稀疏，在时间维度上也需如此，从而能够从其活动中直接解码刺激开始后的时间信息。这种时间模式被认为是小脑依赖性条件反射的适时习得的基础。

通过电生理记录监测颗粒细胞的生理特性难度较大，且此类研究大多是在麻醉的啮齿类动物中开展的。结合将苔藓纤维输入映射至颗粒细胞层的解剖学研究，越来越多的证据表明，多模态输入会在单个颗粒细胞中进行整合，使其能够作为符合检测器来识别复杂刺激（但也有研究持不同观点）。此外，近期研究还在行为状态下的小鼠颗粒细胞中发现了运动信号，这为解答过去几十年在理论研究中被广泛探讨的传出副本信号与内部模型相关问题提供了新的思路。

斑马鱼幼鱼的小脑与所有硬骨鱼的小脑一样，具备与哺乳动物小脑相同的基本结构，但其细胞数量却比哺乳动物少好几个数量级。尽管如此，受精后仅5天（dpf），解剖学研究显示，大部分浦肯野细胞和颗粒细胞以约1:20的比例存在，并已形成经典的三层结构。浦肯野细胞从受精后4天开始活跃，这一发育时间点与斑马鱼幼鱼开始具备在水中保持平衡、完成觅食和逃避捕食等动作的能力相吻合。这与发育中的大鼠的时间线相吻合，其中出生后第9至18天，姿势和运动行为的出现与浦肯野细胞树突的快速生长相一致。在受精后第6或7天，浦肯野细胞通过颗粒细胞平行纤维接收苔藓纤维输入，表现出视觉诱发反应，且到该阶段，多条攀缘纤维输入已被消除。对斑马鱼幼体进行的成像、光遗传和损伤实验表明，小脑神经元在游泳、动眼追踪、运动适应以及联想学习过程中具有活性，且确实是必需的。因此，受精后6至8天斑马鱼小脑回路的解剖和功能成熟度，大致相当于2至3周龄啮齿动物的小脑。

斑马鱼小脑体积小巧、组织具有光学透明性，且可通过遗传驱动系靶向小脑神经元亚群，这为研究颗粒细胞如何编码感觉运动信息提供了独特机遇。本研究充分利用这些优势，在清醒且具备感知能力的动物接受感官刺激的同时，对经遗传鉴定的颗粒细胞活动进行光学监测，并同步记录其行为。实验使我们得以研究群体整体的反应特性，并解决这些神经元中感觉运动表征的维度与稀疏性等问题。我们揭示了功能反应的解剖学映射我们对不同感觉模态及同一感觉模态内的反应进行了研究。我们通过高时间分辨率电生理记录来补充钙成像实验，以此探究单细胞颗粒细胞活动中是否存在对时间信息的显性编码。

结果

斑马鱼小脑的解剖结构

斑马鱼幼鱼小脑的细胞类型和解剖结构与哺乳动物小脑同源，但由于细胞数量更少，其神经环路更易研究。在斑马鱼幼鱼体内，小脑位于大脑背侧200微米处，恰好在视顶盖后方（图1A），因此可用于成像和电生理实验。

我们利用了竹内等人构建的多种转基因gal4驱动系，正如之前的免疫组织化学和解剖学表征所证实的，这些驱动系在斑马鱼小脑中的表达模式仅局限于颗粒细胞及其平行纤维（图S1）。斑马鱼小脑分为三个叶：小脑瓣（Va；前叶）、小脑体（CCe）以及后外侧叶，该叶又进一步细分为颗粒隆起（EG）和小脑后叶（LCa）（图1B）。

这些不同的转基因品系具有重叠但不相同的表达模式，其标记密度和叶特异性存在差异，这使我们能够获得群体成像的最大覆盖范围，同时也能靶向单个颗粒细胞进行电生理记录（图S1D和S1E）。我们采用自动分割方法，对本研究中用于标记颗粒细胞的四种转基因品系的颗粒细胞胞体进行了识别和定量（图1 (n=16 fish)）。这些方法表明，斑马鱼幼鱼小脑中至少有6000个颗粒细胞，其数量约为浦肯野细胞的20倍。因此，该系统提供了一个数量庞大且易于研究的细胞群体，可用于探究稀疏性和维度特性。

图1. 幼体斑马鱼小脑及其颗粒细胞群的特征分析。(A)共聚焦复合堆叠图像显示，7天受精后（dpf）的转基因斑马鱼幼鱼头在明场下泛神经元表达GCaMP6f（红色），大量颗粒细胞表达mCherry（绿色）。比例尺为100微米。(B) 示意图展示斑马鱼小脑的解剖叶。CC：小脑嵴；CCe：小脑体；EG：颗粒隆起；LCa：小脑尾叶；Va：小脑瓣。比例尺为100微米。(C) 对本研究中使用的四种转基因斑马鱼品系标记的颗粒细胞数量进行定量分析（分别对应(=3,6,5)和2条鱼）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。(D) 小脑不同区域标记的颗粒细胞示例，这些细胞具有0、1、2、3或4个树突爪。空心箭头头指示树突爪，黑色箭头头指示无树突爪的树突分支，井号指示疑似生长锥，所有细胞的平行纤维轴突截断处以星号标记。比例尺为10微米。颗粒细胞的其他形态见补充图S1。(E) 直方图显示6或7天受精后（dpf）颗粒细胞的树突爪数量分布（范围为0-4个爪；86条鱼的(n=107)个颗粒细胞）。另见补充图S1。

斑马鱼颗粒细胞具有典型的树突爪和平行纤维投射

不同物种的颗粒细胞通常仅有3至7个树突，每个树突均从单个苔藓纤维终扣接受兴奋性输入。颗粒细胞的树突高度分支，呈爪状结构，每个爪状树突在名为肾小球的结构内与单条传入的苔藓纤维终扣形成数千个突触连接。建模研究强调，考虑到稀疏性与信息传递之间的权衡，这种数量有限的树突爪状结构（以及相应的突触连接方式）是基于颗粒细胞层构建的前馈网络的最佳配置。对斑马鱼小脑早期发育阶段的研究表明，颗粒细胞的分化与迁移在幼鱼早期（2至4天胚胎期）快速发生。从这些研究中我们得知，到6天胚胎期，斑马鱼小脑的三层结构中已形成大量颗粒细胞，且这些细胞的轴突已完全延伸；但这些细胞的详细解剖结构，尤其是其树突形态以及是否存在爪状结构，目前仍不明确。

我们获得了荧光报告构建体的镶嵌表达，以可视化小脑不同区域单个颗粒细胞的形态（参见补充实验程序）。这使我们能够研究平行纤维投射和树突形态在颗粒细胞层不同区域的颗粒细胞之间如何变化。

对单个颗粒细胞的高分辨率成像显示，位于CCe、Va和EG区域的颗粒细胞均有1至4个独立的爪状结构（图1D和图1E；平均值±标准差=(2.3 pm 1)；来自86条鱼的(n=107)个细胞；图S1A）。树突状爪的数量和形态在6或7日龄至11或12日龄期间保持稳定（14条鱼的16个细胞中有15个的爪状结构数量未发生变化；配对符号检验(p=0.32)），并持续至20至22日龄（图S1C；(n=2)）。6或7日龄幼虫的LCa区域标记颗粒细胞几乎无爪状结构（5个中有4个无爪状结构），但确实出现了类似轴突生长锥的突起，这可能与其相较于其他区域颗粒细胞的未成熟状态相关（图S1A）。尽管如此，大多数颗粒细胞具备哺乳动物颗粒细胞标志性的树突状爪状结构，因此可能在小脑回路的输入层接收并整合多个苔藓纤维输入。

与哺乳动物的小脑一样，平行纤维沿小脑的中外侧轴纵向延伸，并以片状结构排列（图S1A）。我们的研究结果揭示了五种不同的平行纤维投射类型（图S1A）与胞体位置相对应，从而完善了我们对以往研究中轴突投射图谱的认知。所有平行纤维均以纵向（中外侧）方向贯穿小脑，其覆盖的距离在很大程度上取决于小脑沿吻侧向尾侧轴延伸时的宽度。值得注意的是，仅有一小部分标记的颗粒细胞的平行纤维投射至背侧后脑的小脑嵴（CC）（图S1A；(n=9 / 26 cells)），这一结构与斑马鱼的前庭小脑相对应。这表明，投射至小脑嵴的颗粒细胞可能富集了对前庭运动整合至关重要的信息，例如运动副本信号。因此，不同的树突形态和平行纤维投射提示了区域特化，这可能与这些细胞在不同感觉运动过程中的功能作用相关。

颗粒细胞的群体表征具有高密度特征

颗粒细胞被认为会以稀疏的高维表征对传入小脑的苔藓纤维信号进行重新编码。然而，由于哺乳动物小脑体积较大，此前一直无法通过实验测量整个颗粒细胞群体的稀疏度。对清醒状态下、行为活动中的小鼠，从小脑已知运动区域的局部疑似颗粒细胞群体进行功能成像后发现，这些细胞中的大多数都存在与运动相关的活动，这为该小脑亚区域存在密集的颗粒细胞表征提供了证据。因此，我们利用体积小巧且光学可及的斑马鱼幼体小脑，来验证整个小脑层面上颗粒细胞表征在群体水平上具有稀疏性这一假设。

我们向表达了遗传编码钙指示剂的清醒斑马鱼幼鱼小脑颗粒细胞呈现了三种感觉刺激，并使用双光子显微镜对其反应进行了成像（图2A和图2B；视频S1）。我们对每条斑马鱼的整个小脑体积都进行了成像。感觉刺激包括以下三类：（1）六种不同持续时间的全视野红光闪光，（2）以三种速度（3、10和30毫米/秒）之一向前移动或反向以10毫米/秒移动的黑红光栅，以及（3）施加于饲养液中的温和电刺激（图2A）。对泛神经元表达钙指示剂的转基因品系进行的实验表明，这些刺激能特异性地激活视觉处理区域和小脑（视频S2）。在部分实验中，我们同步记录了尾部运动和神经元活动，以测定动物对刺激的行为反应性。全视野闪光和反向运动光栅均未引发任何行为反应（图4A）。然而，已知斑马鱼幼鱼会表现出光介导的转向行为和惊跳反应，这说明亮度的微小变化是该动物一种具有生态学意义的刺激。正向光栅会引发向前游动，这是一种被称为视动反应的行为，而电刺激的强度则经过校准，能在约一半的实验次数中引发短暂的运动反应。

这些对清醒斑马鱼进行的成像实验显示，在我们呈现的简单刺激下，整个颗粒细胞层出现了密集（非稀疏）激活（图2B）。在特定的成像平面中，解剖分割揭示了多个不同细胞具有不同的反应特征（图2C和补充图S2）。颗粒细胞跨越了多个成像平面，因此其活动可在多次实验中被追踪（图2C和2D）。作为研究显著刺激锁定活动的第一步，对单个平面上同时记录的所有信号进行互相关分析并聚类，揭示出界限清晰的功能群（图2E）。相关矩阵显示，同一功能群内的细胞活动高度相关，且大多数颗粒细胞在我们的实验范式中均有活动。

对多次实验中所有经解剖分割的颗粒细胞的活动进行量化后发现，超过50%的颗粒细胞相对于基线的最大荧光变化幅度超过150%（图2 (n=16 fish)）。这是对所有颗粒细胞的量化结果，不考虑其在实验流程中的活动情况，表明小脑中存在的大多数颗粒细胞至少对呈现的11种刺激中的一种产生了反应。在平均亮度与全视野闪光相同的自然水下场景影片刺激下，也观察到了颗粒细胞的密集激活。

颗粒细胞表达NMDA受体，其被突触输入激活也可能对钙信号产生贡献。为了确定我们实际监测的是否是颗粒细胞的放电，我们在每次实验中都对平行纤维进行了成像（图2G；视频S3）。平行纤维的活动表现出与胞体信号相同的反应动力学和特征（图2G）。此外，对颗粒细胞进行的26/26次电生理记录显示，其对至少一种呈现的刺激均能产生可靠反应，且放电模式与钙指示剂成像获得的反应经GCaMP核卷积后完全一致（图S3A和S3B）。这些数据使我们确信，钙指示剂所记录到的活动确实反映了颗粒细胞的放电过程。

图2. 颗粒细胞中的表征非稀疏。（A）呈现给幼虫的刺激范式。全视野闪光的持续时间分别为50、100、200、500、1000和3000毫秒。移动光栅以三种尾向-头向速度（3、10和30毫米/秒）和一种头向-尾向速度（10毫米/秒）呈现5秒。全视野光栅的平均亮度为红色闪光的一半，但高于背景亮度（此处显示为深灰色）。同时还施加了强度为2毫安、持续10-25毫秒的轻微电击。这些刺激在实验中以随机顺序呈现，但在后续面板中重新排列为此顺序。（B）上图：颗粒细胞层某一成像平面的解剖图像（比例尺，50毫米）。下图：该平面中所有经解剖分割的神经元的最大ΔF/F信号热图（以百分比表示），显示这些神经元被密集激活。解剖分割过程参见图S2。（C）从两个相邻成像平面（间距1毫米）中提取的所有颗粒细胞。在大多数情况下，同一颗粒细胞可在多个平面中被成像。（D）上图：示例颗粒细胞对所呈刺激的平均响应及标准差（阴影区域）。下图：同一细胞在多个平面中采集的Z评分活动轨迹。（E）将（C）中n+1平面出现的全部252个颗粒细胞响应通过K均值聚类分为7种响应类型，并展示了重组后的相关矩阵。相关矩阵中高度的结构特征表明，大多数颗粒细胞表现出一定的刺激锁定响应。（F）直方图显示16条斑马鱼中所有颗粒细胞（而非仅活跃细胞）的最大ΔF/F累积分布平均值。阴影区域代表标准误。平均而言，超过50%的颗粒细胞的最大ΔF/F高于150%。（G）左图：小脑右半球平行纤维单平面的伪彩色图像，显示特定刺激帧期间的荧光与平均荧光的差异。蓝色为快速正向移动光栅；红色为3秒闪光刺激；黄色为电击刺激。比例尺代表25毫米。插图为包含平行纤维疑似突触前小点的感兴趣区域（ROIs）的高倍放大图（左侧方框标注位置），这些小点对不同刺激具有响应性。比例尺代表5毫米。右图：左侧这些圈出的感兴趣区域的活动轨迹，其响应与颗粒细胞胞体的活动一致（例如，将下方蓝色轨迹与图D中的轨迹对比）。另见图S2及视频S1、S2、S3。

颗粒细胞层按功能反应类型进行解剖学组织，并呈现出视拓扑图谱

我们的群体成像结果表明，颗粒细胞对特定刺激具有高度刻板的反应，并指出以丰富小脑不同区域的这些反应特征。尽管已知斑马鱼小脑不同叶的颗粒细胞群具有不同的发育路径、遗传特征和平行纤维投射，但功能特化是否也以拓扑方式组织仍不清楚。

为了研究功能反应的解剖定位，我们将16条斑马鱼在三个维度上的实验结果配准到了参考脑区。我们根据参考解剖结构创建了一个掩模，以覆盖能稳定找到颗粒细胞胞体的区域。我们采用无偏功能分割算法并设置较高阈值，识别出近13000个具有显著活性的颗粒细胞。利用所有这些颗粒细胞的活性数据估算神经表征的本征维数，得到的数值约为7（详见补充实验方法）。

然后，我们对所有神经元的平均活动概况进行了k-means聚类，以从这些反应中识别出七个主要集群（图3A、S4A和S4B；参见补充实验程序）。这些集群对应于以下响应类型：亮度兴奋（该组包括两个集群；参见图S4）、亮度抑制、正向运动兴奋、反向运动兴奋、休克兴奋和非特异性。我们还通过使用该刺激集对颗粒细胞进行细胞附着electrophysiological记录，发现了其中几个相同的响应概况（图S3和S5）。来自我们成像实验的大约一半的所有颗粒细胞对亮度做出反应（分别有30%和23%的所有细胞对亮度兴奋和抑制）。所有运动兴奋的细胞都是方向选择性的，17%的颗粒细胞被正向运动兴奋，一半的颗粒细胞对反向运动做出反应。没有发现对运动反应表现出抑制的细胞。另有9%的细胞表现出休克兴奋，其余12%的细胞没有表现出刺激锁定反应。

为了观察这些功能组在小脑中的分布，我们使用所有实验的配准图，根据所有细胞最频繁的反应类型，对参考大脑中的每个体素进行颜色编码该体素。我们的图谱揭示了颗粒细胞的解剖位置与反应特征之间存在明确关联，这支持了小脑具有模块化、叶特异性特化的观点（图3B）。亮度激活细胞在小脑最背侧和内侧区域占据一个密集的双侧区域，其前端和外侧相邻区域同样是密度较高的亮度抑制细胞。背侧小脑内绝大多数对方向运动或电击产生反应的颗粒细胞都位于构成小脑叶（LCa）的最尾侧细胞带中。向腹侧和外侧移动时，颗粒细胞的反应特征转变为以正向和反向运动激活反应为主的混合类型（图3B）。位于小脑最外侧边缘的小脑 eminentia granulares（EG）富含运动和电击激活反应，同一深度的前端Va区域也是如此（图3B）。这些解剖簇的位置在单个小脑中具有可重复性，且在不同斑马鱼之间高度保守，与转基因驱动系无关（图3B和3C）。

鉴于许多颗粒细胞被鉴定为亮度兴奋性细胞，我们想知道这一群体是否可以根据视觉感受野的位置进一步细分。有证据表明哺乳动物小脑中存在碎裂的躯体代表区，但由于在清醒、非去脑的实验条件下难以探测视觉拓扑图谱，此前尚未在清醒动物的颗粒细胞层内完成视觉反应的全面定位。为了确定视觉反应是否按视网膜拓扑图谱进行组织，我们将视野划分为15个等大的垂直（头尾方向）和水平（左右方向）条形刺激，每种刺激持续闪烁1秒后恢复至黑暗状态（图3D；参见补充实验方法）。基于这一设计，我们可以假设简单的直接乘积结构，从而估算出活跃细胞的空间感受野。

我们发现，大多数受亮度刺激的颗粒细胞的感受野覆盖了视野的5%至25%。感受野在视野的左右两侧分布均匀，但大部分对应于吻侧半（图3E）。为了可视化是否存在任何地形图谱，我们根据每个颗粒细胞感受野质心的位置对其进行颜色编码（从左到右由品红色变为绿色，从吻侧到尾侧由橙色变为青色）。结果表明，一个对称的地形图谱确实存在（图3E）。虽然未观察到精细的视网膜拓扑图，但我们发现左侧小脑的大多数颗粒细胞其感受野位于视野右侧，反之亦然。此外，吻腹侧小脑（Va区）的大多数颗粒细胞的感受野位于视野尾侧半领域。这一结果表明，除了感觉模态外，斑马鱼幼鱼小脑中的颗粒细胞还能传递感觉刺激空间位置的相关信息。这些实验首次揭示了清醒、行为状态下动物颗粒细胞层中存在的视觉拓扑映射。

图3.小脑中的颗粒细胞在刺激反应谱和视觉感受野的地形上有组织。(A)左图：对全部 12283 个颗粒细胞（取自 16 条斑马鱼）的 Z标准化活性绘制热图，经 K均值聚类分为 7 个细胞簇。尽管 GCaMP6S 与 GCaMP6F 信号动力学特性存在差异，但响应模式相近的颗粒细胞仍归为同一簇。 右图：展示每个细胞簇的平均活性轨迹，依据刺激响应类型标注，并标明该簇颗粒细胞的占比。注意有两个细胞簇表现为亮度兴奋型，在后续图中将二者合并。单个细胞（钙成像与电生理）的活性轨迹示例，以及亮度兴奋亚簇的解剖排布，详见附图 S3。(B)取自大脑表层不同深度的单层成像图，整合全部实验（24 条斑马鱼）数据，展示颗粒细胞胞体层最可能出现的响应模式；同时给出泛神经元表达信号作为解剖参照。颜色编码规则同 (A)。灰色轮廓为小脑大致边界，标尺：100 μm。(C)同 (B)，展示来自不同转基因品系、单条斑马鱼的代表性单层成像图。(D)为研究视网膜拓扑映射，将视野划分为 15 组水平、垂直条带，条带闪光刺激时长 1 s（红色阴影标记）。据此可以估算每个神经元的感受野（右上角为示例神经元的感受野色彩编码，黑色曲线为该神经元的平均响应）；右下角标注该示例神经元的位置。 直方图展示全部感受野中心点的位置概率分布：品红紫色代表左右方位，橙青色代表吻尾方位（6 条斑马鱼，共 2603 个颗粒细胞取平均；阴影区域代表标准误 SE）。标尺与 (B) 一致。(E)颗粒细胞根据其视觉感受野中心点进行颜色编码，配色规则同 (D)。 上图：感受野的侧向分布；鸟瞰视角下绘出小脑轮廓作为参照。坐标轴标注：C尾侧，D背侧，L外侧，M内侧，Ro吻侧，V腹侧，同时标注额外的矢状位、冠状位视图。 下图：视图同上，展示感受野的吻尾方位分布。标尺与 (D) 一致。另见附图 S3、S4。

颗粒细胞可编码纯感觉或运动信息以及多模态感觉运动组合

除了处理亮度等感官背景信息外，小脑在协调运动和运动学习方面也发挥着重要作用。因此，我们预计会发现能编码视觉运动信息以及动物自身运动信息的颗粒细胞。为了区分诱发行为的刺激所引起的感官反应和与运动相关的反应（如向脊髓运动网络发出信号的副本），我们对清醒且头部固定的斑马鱼的颗粒细胞进行了钙成像（((n=5))），同时监测从琼脂糖凝胶中释放的尾巴的运动。

向前移动的光栅会引发被称为游动回合的时期，其潜伏期、持续时间和频率在不同实验中差异显著，对电击的行为反应亦是如此。对向前移动的光栅和电击刺激所做出的可变且非饱和的行为反应，使我们能够区分颗粒细胞群体中的感觉和运动表征（图4A）。我们将斑马鱼每次实验的运动输出信号与钙指示剂的动力学进行卷积，生成运动回归因子，用于识别与运动相关的颗粒细胞（图4B；参见补充实验方法）。我们还构建了针对其他刺激（如向前视觉运动）的回归因子，以识别在不同实验中保持一致的感觉反应。

在不同试次中，单个颗粒细胞的钙信号与运动回归量之间存在极高的相关性，以至于钙信号中的所有活动峰值都与游泳行为的发生时刻相吻合（图4B和4C）。因此，单个颗粒细胞能够编码动物的运动活动，而与引发该行为反应的感觉刺激（移动光栅或电击）无关。我们推测，这些颗粒细胞接收的是运动副本信号，从而对动物的运动活动进行编码，不过这些反应也可能由再传入的感觉输入介导，例如本体感觉或侧线信号。相比之下，我们还发现了另一类颗粒细胞，它们的活动与向前移动的光栅的相关性最高，而与鱼类对光栅的行为反应无关，这表明它们的反应纯粹是感觉性的（图4B和4C）。运用这种基于回归的方法我们根据运动和感觉变量设定了相关系数的阈值，从这些行为实验中筛选出颗粒细胞，这些细胞对行为相关刺激（正向光栅和电击）的反应可被归类为感觉相关或运动相关。

将颗粒细胞的位置映射到参考解剖结构上，发现这三组细胞占据了不同的区域（图4D）。对向前运动有感觉反应的颗粒细胞比其他组的颗粒细胞位置更背侧，位于LCa和内侧CCe区域，而对电击有感觉反应或具有运动反应的颗粒细胞则分布在CCe的更多腹侧区域，以及EG和Va区域（图4D）。这些结果表明，图3B中标定的一些腹侧区域若存在对向前运动或电击的兴奋反应，实际上可能对应着运动反应。

在本实验范式中，我们已明确识别出多个仅对单一感觉或运动变量产生反应的颗粒细胞实例，同时也希望探究来自多种感觉和/或运动信号的信息是否能在单个颗粒细胞中被编码。尽管大多数颗粒细胞似乎仅对一种感觉或运动变量产生反应，但我们的分析发现，存在少量颗粒细胞可同时对感觉相关和运动相关刺激作出反应（图4C和图4D；参见补充实验方法）。我们推测这些细胞可能是多模态颗粒细胞，能够对多种感觉运动信息流进行编码（和整合）。我们再次采用基于回归因子的方法，来确定推定的多模态颗粒细胞可能编码的信息类型。

不同平面中颗粒细胞活动信号与感觉刺激和运动活动回归因子的相关性分析显示，除了编码运动活动外，还有颗粒细胞仅编码单一感觉刺激（运动或电击）（图4E和4F）。我们的方法能够识别出这些颗粒细胞，因为它们似乎以相对线性的方式整合来自不同信息流的信息，使得感觉和运动回归因子均表现出较高的相关系数（图4F）。此外，不同回归因子对整体信号的贡献可归因于颗粒细胞活动轨迹中的单个峰值（图4F）。在所有可明确识别运动相关信号的行为学实验中，群体中仅观察到三种多模态反应组合，均为运动活动与另一种单一感觉刺激的组合：电击、正向运动或反向运动（图4E和4F）。即便是在这些多模态颗粒细胞中，单一刺激的呈现也足以引发其放电（图4F）。因此，这些细胞达到放电阈值并不需要不同模态的刺激同时出现，这与小鼠颗粒细胞感觉反应的相关研究结论一致。

令人意外的是，尽管我们已识别出数量众多的亮度响应颗粒细胞，但并未发现任何颗粒细胞能同时编码亮度和运动活动（图3A）。此外，在所有行为正常（(n=5) 号鱼）和麻痹状态的群体成像实验（((n = 21 fish))）中，我们均未发现任何颗粒细胞似乎能编码一种以上的感觉刺激类型。相反，我们鉴定出的所有多模式细胞均编码一种感觉变量和一种运动相关变量。尽管受实际条件限制，本实验仅探究了两种感觉模态以及有限的参数空间，

这些结果表明，斑马鱼幼体颗粒细胞的多模态特性可能专门用于感觉运动整合，而非多模态感觉信号的整合。

图4.颗粒细胞可以编码纯粹的感觉或运动信息以及多模态感觉运动组合。（A）我们的刺激在头部嵌入成像实验中诱发的典型行为，尾巴从琼脂糖中释放出来。只有向前移动的光栅和轻微的电击引发行为。(n=5)（B）绿色痕迹是运动活动的卷积回归，黑色痕迹是（A）中所示的两个颗粒细胞同时获得的z评分荧光痕迹，蓝色痕迹是向前移动刺激的卷积回归。显示了每个细胞的活动与其最佳回归之间的相关系数。（C）同时记录的颗粒细胞的两个示例活动概况，来自被向前移动光栅激发的行为鱼，这些光栅被区分为具有运动相关（上痕迹）或感觉相关（下痕迹）活动。(D) (i) 212个可归类为感觉（正向运动或电击）或来自行为鱼的运动颗粒细胞的最大投影（n = 5）。全神经元((n = 5))。全神经元参考解剖结构以及小脑大致边界的轮廓以灰色显示。(ii) 图像堆栈中不同深度的单张平面，显示了反应类型的背腹侧分布。比例尺代表100毫米。（E）三个示例细胞对以下情况的多模态反应：（i）感觉电击与运动活动，（ii）感觉向前运动与运动活动，以及（iii）感觉向后运动与运动活动。（F）（i）将（E）中颗粒细胞单个平面的活动进行拼接，并与最相关感觉刺激的回归变量以及鱼类经卷积处理的同步运动活动进行关联。黄色轨迹为电击刺激的卷积回归变量轨迹，黑色轨迹为该细胞的z评分荧光轨迹（i）跨越七个平面，灰色轨迹为这些平面中行为的卷积活力回归量。感觉回归量也出现在中间轨迹中，以阴影区域突出显示颗粒细胞活动与感觉刺激的相关性。空心箭头头标记出与运动活动相关但与感觉刺激无关的峰值。图中标注了颗粒细胞活动与各回归量的对应相关系数。（ii和iii）展示与（i）相同的内容，分别显示（Eii）和（Eiii）中细胞的活动。

颗粒细胞感觉与运动表征的变化与药物诱导的行为敏感性变化相关

为了研究我们观察到的颗粒细胞表征的行为相关性，我们开发了一种药理学方案，该方案可引发对先前中性亮度变化的游泳反应。单侧局部注射和双侧注射10毫摩尔的荷包牡丹碱（一种GABAA受体拮抗剂），均立即导致亮度诱发的游泳行为显著增加（图5A）。这种显著的行为表型在注射后迅速出现，随后在药物洗脱后行为恢复至基线水平（图5A）。在持续存在荷包牡丹碱（浴液中浓度为20–30毫摩尔）的情况下，也观察到并维持了相同的行为表型（(= 29)；数据未显示）

在建立了能够急剧改变感觉运动行为的范式后，我们接下来对单个小脑平面进行了双光子功能成像，以在此时间过程中监测颗粒细胞的活动。我们观察到，荷包牡丹碱处理后颗粒细胞出现广泛激活，这与鱼类对视觉刺激的行为反应性增强高度相关（图5B）。许多颗粒细胞获得了与运动活动相关的反应，而另一些则对亮度产生了新的反应（图5B-5D）。电生理记录还显示，在荷包牡丹碱处理后，先前对全视野闪光无反应的单个颗粒细胞开始对这些刺激产生强烈放电((n=3)；数据未显示）。尽管这些数据本质上仅为相关性研究，但它们表明，由小脑内GABA能信号的急性药理学阻断介导的行为变化，伴随着单细胞和群体水平上颗粒细胞表征的改变。

图5. 颗粒细胞表征的变化与感觉刺激敏感性的行为学改变相关。(A)左上轨迹：向小脑注射10毫摩尔比库库林（一种GABAA受体拮抗剂）后立即进行的十次试验中，对视觉刺激产生行为反应的概率，对应编号((n = 11))。平均行为以阴影标准误（SE）呈现。需注意，此部分实验未施加任何电刺激。左下轨迹：随着比库林逐渐洗脱，这些动物的行为反应逐渐恢复。右下轨迹：向小脑进行假手术注射并未引起亮度诱发的行为反应出现任何增强。右上为落射荧光显微照片示例，展示了比库林（含罗丹明）的注射范围。比例尺代表100毫米。行为轨迹中的阴影区域表示标准误。(B) 7天post-fertilization（dpf）的GR152:gal4；UAS:GCaMP6s斑马鱼中，通过颗粒细胞层同一成像平面的热图，显示了添加比库林后，像素与亮度（上图）和运动（下图）回归因子的相关性变化。比例尺代表50微米。彩色圆圈表示后续分析面板中涉及的示例颗粒细胞。(C) (i) 两个示例颗粒细胞的活动热图，这些细胞在添加比库林后反应发生改变。上方细胞gc1对亮度的反应性降低，对运动活动的反应性增强；而下方细胞gc2则新获得了对亮度和运动活动的反应性。颗粒细胞的位置如图(B)所示。(ii) 显示整个实验过程中行为反应的热图。(D) 两个示例颗粒细胞在各试验中回归因子的变化曲线，颜色编码与(Ci)中的两个示例细胞一致。灰色条表示施加30毫摩尔比库库林的阶段。

小脑颗粒细胞在编码不同刺激时长时未表现出时间模式形成的证据

小脑功能的经典理论预测，感觉刺激的表征在群体层面和时间维度上都应是稀疏的。在此背景下，颗粒细胞实际上充当着泄漏积分器，其时间常数参与了苔藓纤维输入的时间模式化输出。我们假设，通过呈现不同持续时间的简单视觉刺激（闪光），我们能够诱导颗粒细胞产生具有不同时间模式分布的视觉反应。钙成像实验显示，群体层面的反应并非稀疏的，但无法确定单个颗粒细胞以稀疏的时间模式化放电输出对刺激作出反应的程度。我们对清醒且麻痹的幼体颗粒细胞进行了细胞贴附记录和全细胞记录，以高时间分辨率解析视觉诱发的放电活动和突触输入。

与我们预期的会在不同刺激时长和不同颗粒细胞上观察到多样的时间模式相反，我们发现颗粒细胞对亮度以高度固定的模式发生变化，没有任何时间模式的证据。这一点对亮度兴奋型细胞（图6A和6B）和亮度抑制型细胞（图6C和6D）均成立。两种类型的亮度响应性颗粒细胞在移动光栅刺激下也会产生爆发性放电，其放电频率与亮度转换的频率固定一致，且无论是正向还是反向转换（图S5A–S5C），这表明运动并未改变它们对亮度的固定响应模式。

观察所有受亮度刺激的细胞的记录，我们可以看到其放电活动增加的平均时间特征在短暂的延迟 ((<100 ms)) 后开始，并在刺激出现后数百毫秒达到峰值（图6B，左图；(n=9) 图；n = 9）。放电率相对于基线保持升高，直至刺激结束，此时它们在数百毫秒内恢复到刺激前的水平（图6B，右图）。

相比之下，受亮度抑制的颗粒细胞在闪光刺激期间的放电率从原本较低的基础水平下降至几乎为零（图6C和6D，左图；(n=6)）；然而，由于地板效应，即难以从基础活动已较低的细胞中分辨出放电率的微小变化，这一细胞群的数量实际上可能被低估了。我们电生理记录揭示了亮度抑制性颗粒细胞一个有趣的额外特征，即存在刺激后放电反弹增加的现象（图6C和图6D）。在刺激结束后的数百毫秒内，放电速率出现强烈反弹，达到最大放电速率，该速率会随刺激时长决定的更长抑制期而变化（图6D）。

亮度兴奋型和抑制型细胞的放电率在500毫秒后分别不再进一步上升或下降，而后者的反弹放电达到了随刺激时长呈线性增长的放电率（图S4D）。需要对这些细胞进行进一步的全细胞电生理分析，以确定抑制后反弹是否由内在特性或突触特性导致，但这可能是刺激消失后刺激表征得以在时间上扩展，或是前期刺激时长被延长的一种机制。可以通过测量回弹的幅度来对闪光进行解码。

我们还从具有其他反应特征的颗粒细胞中获得了额外的细胞贴附记录，包括前向运动兴奋的((n=5))细胞和电击兴奋的((n=6))细胞（图S5）。在某一反应类型中，细胞对其偏好刺激的放电反应在时间模式、调谐偏好、首个尖峰的潜伏期以及偏好刺激下放电增益的变化方面均具有高度的 stereotyped 特征（图S5）。对于特定的颗粒细胞，这些反应的时间特征在重复试验中也保持一致（图S6）。

为了更详细地研究颗粒细胞输入的时间模式，我们对一个亮度兴奋型颗粒细胞进行了全细胞记录，同时呈现10种不同持续时间（从50毫秒到5秒）的全视野闪光刺激（图6E）。兴奋性突触输入的频率该细胞在基线水平活性较低，但在全视野闪光刺激下活性显著增强。刺激呈现过程中突触输入的时间模式与细胞贴附记录以及其他颗粒细胞记录中观察到的放电模式高度一致。这些数据支持了以往的研究结论，即在低强度感官激活过程中，颗粒细胞的去极化与放电输出之间的关系呈良好的线性关系。综上，我们的电生理数据表明，对亮度有反应的颗粒细胞可通过在相同时长内提高或降低放电率来编码视觉刺激（如全视野闪光）的存在，但不会产生进一步的时间模式化变化。

图6. 颗粒细胞不表现时间模式对亮度、运动和刺激敏感的细胞。(A) 上图：来自亮度兴奋性颗粒细胞的细胞贴附式电生理记录，展示了其在五次重复试验中对全视野闪光的反应。下图：所有试验的平均放电率（((n = 12 trials))）(B) 基于亮度兴奋性颗粒细胞的细胞贴附式记录（n = 9个细胞），六种持续时间红光闪光刺激的群体平均放电率，以刺激开始（左）和刺激结束（右）为基准对齐（((n = 9 cells))）。(C) 与(A)相同，但展示了一个亮度抑制性细胞的反应（((n = 21 trials))）(D) 与(B)相同，针对亮度抑制性颗粒细胞（((n=6 cells ))）；参见图S4，获取亮度相关的额外电生理记录和分析(E) 从保持在65 mV的亮度兴奋性颗粒细胞获得的全细胞膜片钳记录。上图迹展示了对不同持续时间红光闪光的反应概览。(i) 上图迹的放大视图显示基线活动。(ii) 上图迹的放大视图显示持续增加的 

讨论

行为动物的颗粒细胞群体记录

数十年的小脑研究使人们对小脑解剖结构有了深入了解，并对主要细胞类型的生理特性（包括突触可塑性）掌握了大量知识。与这些研究同步，学界提出了关于小脑回路如何实现运动控制与学习的精妙理论。其中，小脑理论的一个核心观点认为，颗粒细胞层的作用是对传入的苔藓纤维信号进行稀疏、高维且具有时间模式的重编码。而我们对清醒状态下行为斑马鱼小脑颗粒细胞群体开展的大规模功能成像研究却发现，感觉与运动信息呈现出密集的低维表征；结合电生理数据来看，并无证据表明存在时间模式编码。相反，许多颗粒细胞会在特定感觉或运动刺激的驱动下，以固定模式被强烈激活发放。

颗粒细胞的表征具有稀疏性且维度较低

颗粒细胞的表征应具有稀疏性这一观点贯穿于小脑功能的各类理论之中。在群体层面，稀疏分散编码指的是这样一种编码方式：众多神经元均处于可用状态，但在对特定刺激做出响应时，仅有一小部分神经元会被激活，且不同刺激会激活不同的神经元子集。然而，要确定群体稀疏性，需要对整个神经元群体的活动进行监测。我们的实验刺激除了探究运动相关输入外，仅在两种感觉模态内探索了有限的参数空间，但成像结果显示，在全部颗粒细胞群体中，有很大比例的细胞会对特定刺激产生响应。不过，与表征分散于整个群体的观点相符的是，我们确实发现，在实验中绝大多数颗粒细胞都会对单一刺激做出响应，因此显然属于群体中的某一功能“子集”。

考虑到小脑输入层存在稀疏编码的预期，以及幼体斑马鱼对我们呈现的全视野闪光没有行为反应，大量对亮度有反应的颗粒细胞这一发现出人意料。尽管如此，斑马鱼从幼体阶段起就确实表现出对明亮区域明显优于黑暗区域的偏好，并且在光照强度出现大幅突变时会产生惊跳反应。

这表明相对简单的视觉信息（如亮度水平）对斑马鱼幼体具有高度的行为学相关性。基于此，红光闪烁已被成功用作条件刺激，在斑马鱼幼体的联想学习中驱动其行为[30]。尽管斑马鱼小脑中神经表征的稀疏性可能在进一步发育过程中发生变化，但我们的研究结果为感觉和运动信息的密集表征提供了证据，该阶段正是斑马鱼小脑参与感觉运动适应和联想学习的关键时期。

另一种稀性概念适用于单个神经元的活动，即生命周期稀疏性。从这个意义上说，一个神经元要实现稀疏性，就需要在其偏好刺激存在时被强烈激活，而在其他情况下极少放电。已有研究表明，颗粒细胞的基础放电率极低，但仅通过单个突触前苔藓纤维的激活就能轻易放电，这使得颗粒细胞能够以高保真度将传入的感觉或运动信息传递到下游的浦肯野细胞。本实验发现，具有从低到中等基础放电率范围的颗粒细胞，在响应其偏好刺激时会切换至相对高频的放电状态，这表明这些反应特征确实体现了生命周期稀疏性。

颗粒细胞不表现时间模式

通过电生理和钙成像两种方法检测到颗粒细胞的反应具有极高的刻板性，这表明与其他一些系统中的研究结果不同，这些细胞在面对简单刺激时可能不会表现出多样的时间模式。相反，在本研究的低至中度感觉刺激条件下，颗粒细胞的放电活动可能如哺乳动物颗粒细胞对躯体感觉刺激的反应所示，忠实地遵循苔藓纤维兴奋的时间节律。为了理解传入信息如何在颗粒细胞中被转化或表征，还需要更多研究来阐明苔藓纤维向颗粒细胞输入的生理特性。

当然，如果所有对亮度有反应的颗粒细胞都以相同的固定模式编码亮度参数，那么感觉运动校准/适应将如何进行尚不明确。尽管如此，由于斑马鱼幼体能够完成视觉引导的运动适应以及小脑依赖的视觉刺激联想学习，这表明运动学习仍可在这一框架内发生。在其他实验范式中、发育后期阶段或当特定刺激获得行为相关性后，斑马鱼小脑中的颗粒细胞可能会产生具有时间模式的反应。我们已明确了未受刺激的斑马鱼幼体颗粒细胞对相对简单、低维刺激的反应特征，这为探索可能的高维编码表征奠定了基础，而这些表征可能参与清醒、行为状态下斑马鱼的运动适应与学习过程。

少数颗粒细胞表现出多模态反应，这些反应可能优先整合感觉和运动信息

在我们的研究中，大多数颗粒细胞在各次实验中的活动与我们实验范式中的单一感觉或运动变量高度相关，但很少与多种模态相关被测试的细胞确实如此。事实上，这些颗粒细胞的解剖结构显示其平均仅有两到三个爪状突起（而非哺乳动物物种中典型的四个），这表明这些细胞输入中实现多模态的可能性更为有限。尽管我们的电生理记录未能对整个小脑进行广泛采样，但群体成像实验发现，尽管覆盖范围较广，多模态颗粒细胞的数量依然很少。本研究未能探究所有感觉模态；然而值得注意的是，在我们观察到的大量对亮度变化产生反应的颗粒细胞中，没有一个同时对电击或运动活动有反应，尽管这些反应也存在于大量颗粒细胞中。此前已有研究表明，颗粒细胞的多个输入可传递来自同一感觉模态的信息，从而提高特定刺激的信噪比。这种符合检测与可靠信号处理之间的明显权衡，或许可以解释为何功能研究发现多模态颗粒细胞的比例会因所测试的特定小脑区域和感觉模态不同而出现巨大差异。

我们未发现对呈现的多种感觉刺激均有反应的颗粒细胞，但通过精心调整感觉刺激强度、从而能在反应中区分这些变量的方式，我们仍鉴定出一些颗粒细胞可同时编码感觉和运动相关信息。我们认为，本研究中观察到的运动相关活动类似于被传递至颗粒细胞层的运动传出副本，不过我们无法排除侧线或机械感觉输入的影响。我们才刚刚开始探究运动输出的哪些方面会被小脑神经元（包括颗粒细胞）的活动所编码；但我们的研究结果为颗粒细胞如何通过同时编码感觉和运动变量来完成感觉运动坐标变换提供了有趣的启示。此外，我们的药理学实验还发现，在药理学诱导的行为敏化过程中，颗粒细胞内的感觉运动表征发生了显著变化，这为阐明先天和新获得行为特有的感觉运动变量如何在小脑中编码迈出了第一步。这些发现为单个颗粒细胞中的感觉运动整合提供了证据，但总体而言表明，斑马鱼小脑在此情境下可能更适合可靠传递感觉或运动相关信号，而非进行符合检测。未来的研究可通过在幼鱼中测试更广泛的感觉刺激反应，或利用解剖学方法定位苔藓纤维向单个细胞的输入，从而帮助我们更明确地阐明多模态是否是斑马鱼小颗粒细胞的普遍特性。

图谱与拓扑结构

利用经典电生理学对颗粒细胞的本体感受和触觉感受野进行映射研究表明，小脑输入层中存在一种“碎片化”的躯体定位图谱，但目前尚不清楚这些图谱在生理条件下是否真实存在。由于在记录小脑在清醒状态的动物中，对于颗粒细胞层其他感觉模态（如视觉或听觉）的精细定位研究尚少。本文揭示了颗粒细胞层的激活图谱，其中不同模态的反应集中分布在输入层的亚区域内。松井等人此前已绘制出斑马鱼幼鱼小脑在视动反射（OMR）和视动反射（OKR）过程中的浦肯野细胞活动图谱，分别发现小脑独特的嘴内侧和尾侧区域存在活动位点。与这些研究结果一致，本研究表明颗粒细胞中对向前移动的刺激（可诱发视动反射）产生反应的平行纤维穿过小脑内侧。此外，我们的功能成像显示该区域存在大量活跃的疑似突触前平行纤维末梢，这些末梢可与浦肯野细胞树突形成连接。这些一致的研究结果支持斑马鱼幼鱼小脑存在模块化结构，即不同区域可能参与控制不同的感觉运动行为。

我们还发现，视觉响应亚区内存在明显的信息偏侧化现象，这表明传入的苔藓纤维传入神经是依据视觉世界进行有序排列的。然而，由于斑马鱼体内所有视网膜神经节细胞轴突都会跨越中线，且颗粒细胞的视觉感受野并非纯对侧分布，这说明小脑接收的视觉信息已完成了一定程度的空间处理。本研究绘制了颗粒细胞层接收视觉、电击和运动相关输入的功能图谱，并强调有必要探究不同突触前输入在单个颗粒细胞（以及潜在的多模态颗粒细胞）上的映射规律。

展望

总之，本研究借助斑马鱼幼体作为脊椎动物模式生物所具备的研究优势，得以在动物执行感觉运动行为的过程中，对其大部分小脑颗粒细胞的活动进行监测。通过在群体层面解析细胞反应，我们发现这些神经元会根据感觉刺激、视觉感受野以及刺激的行为相关性呈现高度有序的排布。研究结果表明，在斑马鱼幼体具备完成小脑依赖的感觉运动适应与学习能力的阶段，群体层面的神经表征具有密集性，而单个细胞层面的表征则几乎不存在时间模式。随着斑马鱼小脑逐渐成熟，我们推测这些神经环路会发生结构与功能的改变，随之而来的是表征稀疏性、多模态性及时间模式的变化。具体而言，颗粒细胞的编码特征可能会发生调整，以适应动物日益复杂的行为表现。尽管本研究提出了诸多待解问题，但我们认为其提供的宝贵见解，将助力我们解析颗粒细胞层乃至整个脊椎动物小脑中发生的感觉运动转换机制。 

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。