题目：MEK Inhibitors Reverse cAMP-Mediated Anxiety in Zebrafish

原文链接: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26388333/

期刊：：Chemistry & Biology

研究亮点

l PDE4阻断/AC激活会在斑马鱼中引发新的类焦虑行为

l 小分子筛选将MEK抑制剂鉴定为抑制cAMP焦虑的抑制剂

l 环磷酸腺苷水平升高会刺激与RAS-MAPK通路活性的串扰

l MEK抑制剂治疗环磷酸腺苷介导的焦虑的新治疗潜力

摘要

磷酸二酯酶（PDE）-环磷酸腺苷（cAMP）活性改变常与焦虑症相关，但现有疗法通过降低神经元兴奋性发挥作用，而非靶向PDE-cAMP介导的信号通路。本研究首次将抗癌MEK抑制剂重新定位为焦虑症治疗药物，应用于斑马鱼焦虑样行为模型。磷酸二酯酶抑制剂或腺苷酸环化酶激活剂会使斑马鱼幼体和成体表现出与焦虑相关的行为。小分子筛选发现，MEK抑制剂能有效抑制斑马鱼幼体和成体中cAMP诱导的焦虑行为，但其本身不产生抗焦虑行为。cAMP诱导焦虑的机制在于与RAS-MAPK信号通路激活的串扰。本研究表明，靶向串扰信号通路可成为治疗精神疾病的有效策略，并推动将MEK抑制剂重新定位为cAMP水平升高情况下的行为稳定剂。

图形摘要

引言

四分之一的成年人在一生中会受到心理健康问题的困扰，其中广泛性焦虑症是西方国家最常见的确诊心理健康障碍。目前迫切需要找到焦虑症的治疗靶点和治疗方法，并开发新的行为动物模型以应用于抗焦虑药物研究。

第二信使环腺苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）在信号传导过程中发挥着关键作用控制学习、记忆和情绪。细胞内环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的水平由组织特异性磷酸二酯酶（PDEs）严格调控，这些酶催化环核苷酸的水解。遗传和药理学证据表明，PDE4 基因在控制中枢神经系统（CNS）中的环磷酸腺苷水平和行为方面发挥重要作用。在哺乳动物中，PDE4 酶包含四个亚家族（PDE4A–D）。人类 PDE4B 的多态性与精神分裂症相关；我们此前曾报道，在两名独立的精神病患者中，PDE4B 基因被完全破坏，且 PDE4B 和 PDE4D 与精神分裂症候选基因 DISC1 动态相互作用，共同调控环磷酸腺苷。新型 PDE4 抑制剂是药物研发的重点方向，尤其是近期全基因组研究表明，PDE4 可能与中风、骨密度和哮喘的发病机制有关。值得强调 PDE4 抑制剂在疾病中的重要性，有研究表明，PDE4 抑制剂咯利普兰具有神经保护潜力，还能改善亨廷顿病、阿尔茨海默病、糖尿病模型或脑损伤后的认知能力，缓解记忆缺陷。

咯利普兰对PDE4具有高度特异性，且在哺乳动物体内有效；然而，它会导致人类患者出现严重的呕吐反应，因此不适合作为临床药物使用。在动物研究中，对PDE4进行药理学抑制可产生抗抑郁、镇静、抗焦虑、抗精神病以及改善认知的效果，还能促进神经发生；但在某些情况下，该药物也会引发焦虑样效应。咯利普兰引发的这些多样行为效应，很可能反映了特定PDE4亚型在调控不同行为中的重要作用：对小鼠开展的遗传学研究表明，焦虑情绪主要由PDE4A亚型调控PDE4B与精神病相关，PDE4D与抑郁症及认知功能相关。DISC1和PDE4B在慢性应激导致的抑郁症发生过程中也可能发挥重要作用。值得注意的是，咯利普兰的抗精神病作用及其对PDE4B的依赖性，与PDE4B基因破坏与精神分裂症的关联相一致。

尽管小鼠中的强有力遗传学证据表明PDE4A/B在焦虑症中具有重要作用，但PDE4-环磷酸腺苷（cAMP）导致焦虑症的机制仍不明确，而这一机制对于开发新的治疗方法和治疗靶点至关重要。在斑马鱼中，PDE4抑制剂会诱发类焦虑行为，包括降低幼鱼和成鱼对惊跳反应的习惯化程度、增加其活动量以及产生趋壁行为（紧贴缸壁）。本研究构建了一个用于研究PDE4-cAMP介导的类焦虑行为的斑马鱼模型，并通过该模型开展无偏倚的全动物表型小分子筛选，以发现焦虑症的化学抑制物。通过对80种激酶抑制剂进行筛选，我们发现丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制剂（MEKi）对幼鱼和成鱼斑马鱼中PDE4-cAMP介导的类焦虑行为具有高效的抗焦虑作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制剂作为靶向癌症治疗药物，一直是制药行业高度关注的焦点。本研究证实MEKi可有效治疗斑马鱼的类焦虑行为，并揭示了MEKi作为抗焦虑药物重新利用的新潜力。

结果

PDE阻断/腺苷酸环化酶激活在斑马鱼中诱导一种新型焦虑反应

我们此前在两名表亲中发现了PDE4B基因的破坏，其中一人被诊断为精神分裂症，另一人为精神病。为了深入探究PDE4在行为中的作用，我们构建了斑马鱼中PDE4抑制效应的模型，并开发了一种小分子表型筛选平台，用于研发与PDE4相关行为的新型治疗方法。斑马鱼是研究行为障碍的理想模型系统，因为它们与人类共享同源的分子和遗传机制，适用于遗传和化学筛选，且能表现出明确的行为特征，包括焦虑和恐惧的清晰指标。将斑马鱼胚胎置于开放区域（直径10厘米的培养皿中，加入30毫升E3鱼水），用PDE抑制剂咯利普兰、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）或腺苷酸环化酶（AC）激活剂福司柯林处理后，记录其位置（图1A-1D）。经咯利普兰、IBMX或福司柯林处理的胚胎表现出显著且强烈的趋边反应，即斑马鱼迅速游向培养皿边缘（图1A-1D；视频S1和S2；图S1）。与其他已报道的斑马鱼趋边实验不同，本开放区域实验中未设置任何实验触发条件。对培养皿边缘斑马鱼的细致观察发现，其身体处有一处阴影培养皿边缘（图1A）。我们发现趋触性行为取决于斑马鱼对光照条件差异的感知能力（图1C）。咖啡因是哺乳动物和斑马鱼中公认的致焦虑药物，同时也是一种非选择性PDE抑制剂，被用作阳性对照（图1E），这为开放场趋触反应是斑马鱼幼体类焦虑行为提供了佐证证据。

图1. 磷酸二酯酶抑制/腺苷酸环化酶激活可刺激斑马鱼幼体的趋触性和运动亢进。（A和B）PDE4阻断/腺苷酸环化酶激活后，开放区域中趋触性的图像及示意图。（C和D）10厘米培养皿中斑马鱼幼鱼（3天龄）的定量分析（C）及代表性图像（D）。表现出趋触性的幼鱼用橙色圆点标记，无趋触性的幼鱼用蓝色圆点标记。实验重复次数：(n=7)，每个处理条件下24-35条幼鱼。药物处理浓度：咯利普兰15微摩尔、福司柯林7.5微摩尔、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤30微摩尔。（E）咖啡因处理后的趋触性反应。实验重复次数：(n=3)（含光照和黑暗条件），每个处理条件下35-43条幼鱼。（F）96孔板孔内单个斑马鱼幼鱼的运动轨迹图像（追踪1小时）。（G）光照或黑暗条件下，经PDE4阻断剂/环磷酸腺苷激活剂处理的斑马鱼幼鱼（5天龄）的游泳活动（处理1小时，光照或黑暗条件下追踪30分钟）。实验重复次数：(n=4)，每个处理条件下24条幼鱼。药物处理浓度：咯利普兰15微摩尔、福司柯林7.5微摩尔、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤30微摩尔。（H）直方图显示二甲基亚砜处理组（幼鱼，(n=48)）和咯利普兰处理组（幼鱼，(n=48)）的总移动距离分布（归一化值），并对游泳活动进行了5小时的追踪。绘制了第1小时和第5小时的最后10分钟数据。虚线表示两个群体的大致分界。L，光照条件；D，黑暗条件。(p<0.05)。(^{*} p<0.01)、(^{++} p<0.001)（单因素方差分析；图基多重比较检验）。误差棒代表均值标准误。另参见视频S1和S2；图S1。

PDE抑制/腺苷酸环化酶激活引发过度活跃

我们假设，磷酸二酯酶（PDE）阻断/腺苷酸环化酶（AC）激活可能会刺激斑马鱼出现更多焦虑样行为，例如通过游泳活动增加来衡量的活动亢进。将斑马鱼幼虫单独放置在96孔板的孔中，用化合物处理1小时，随后追踪并记录其游泳活动长达1小时（图1F）。经PDE阻断/AC激活剂处理的斑马鱼在光照和黑暗条件下的活动均显著增强（图1F-1H）。值得注意的是，咯利普兰诱导的活动亢进持续了5小时以上（图1H）。对比图1H中二甲基亚砜（DMSO）处理组和咯利普兰处理组斑马鱼的数据分布直方图，可发现斑马鱼对咯利普兰存在复杂的应答反应。咯利普兰不仅使斑马鱼在黑暗中1小时内的平均活动水平相较于DMSO处理组显著升高，还将斑马鱼分为两个不同的群体（图1H中的虚线；另见实验方法部分）。

针对焦虑样行为化学抑制物的小分子筛选

在确定了对PDE4阻断/cAMP激活的强烈趋触反应后，我们希望鉴定出能够恢复正常行为的小分子化合物。我们从Screen-Well激酶抑制剂文库（EnzoLifeSciences公司）中选取80种激酶抑制剂进行筛选，以找出能够逆转咯利普兰诱导的趋触反应的化合物。首先，用15 mM咯利普兰处理斑马鱼幼体以诱发趋触反应。随后，向水中加入每种15 mM的激酶抑制剂，晃动培养板以确保抑制剂在水中均匀分布，1小时后记录斑马鱼的位置。经对照处理的胚胎会迅速重新聚集在培养皿边缘（图2B）。抑制趋触反应效果最显著的是MEKi PD98059，以及生长因子受体抑制剂Tyrphostin 25和Tyrphostin AG-370。

鉴于MEKi PD98059在我们的筛选中表现出强效作用，我们进一步测试了PD0325901——一种化学结构不同、具有临床活性且高度特异性的MEKi——对PDE4阻断/cAMP激活的影响（图2B和2C）。在30至40分钟内，添加1 μM PD0325901显著逆转了PDE4阻断/cAMP激活引发的趋触性效应。活性测定的结果也证实了这一点（图2D至2F）。与图1H中的结果一致，咯利普兰处理将斑马鱼分为两个明显的群体，分布直方图中的两个峰值清晰地体现了这一划分（图2E）。MEKi处理能够缓解咯利普兰诱导的活动亢进（图2D至2F），这表明MEKi在焦虑症治疗中可能发挥作用。

图2. MEKi逆转PDE4阻断/AC激活引发的行为异常。（A）用于筛选趋触行为抑制剂的小分子化合物筛选示意图概览。(B 和 C) 开放场地中斑马鱼幼鱼的行为图像(B) 及定量分析(C)。橙色圆点：趋触行为；蓝色圆点：非趋触行为。实验重复：(n=6 / 7)，每个处理条件下有25-35条幼鱼。(D) 96孔板中单个斑马鱼幼鱼轨迹的图像。斑马鱼先用咯利普兰处理1小时，随后在有或无MEKi的条件下再处理1小时，并追踪1小时。（E）显示经不同处理条件后移动总距离（标准化值）分布的直方图：二甲基亚砜（((n = 143 larvae))）、咯利普兰（((n = 185) 幼虫）、咯利普兰联合MEKi PD0325901（((n = 227) 幼虫）以及MEKi PD0325901（((n = 149 larvae))）（F）移动的总距离（图2E的标准化值）。图中展示了平均值和自举法计算的95%置信区间。虚线代表二甲基亚砜（DMSO）处理组斑马鱼的置信区间上下限，以便与该组进行比较。由于各组数据不符合正态分布且方差不齐，通过比较组间差值的自举法95%置信区间来分析平均值。药物处理浓度：咯利普兰 15 毫摩尔，福司可林 7.5 毫摩尔，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 30 毫摩尔，丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂 1.5 毫摩尔 (p<0.05) (^{*} p<0.01)。(cdots p<0.001)（单因素方差分析；图基多重比较检验）。误差线代表均值标准误。

焦虑中的cAMP-RAS-MAPK通路串扰

由于 PDE4 阻断/环磷酸腺苷激活的焦虑样表型对丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂（MEKi）敏感，我们推测其潜在的分子机制是通过激活MAPK信号通路实现的。首先，我们证实，咯利普兰和福司柯林处理可导致斑马鱼幼虫的环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，且在与MEK抑制剂共同处理的胚胎中，cAMP水平仍显著升高（图3A）。随后，我们收集咯利普兰处理1小时的斑马鱼胚胎，再分别用或不用MEK抑制剂处理1小时，通过蛋白质印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）和细胞外信号调节激酶（ERK）蛋白，以探究MAPK通路的活性。重要的是，如图3B所示，在受精后5天（5-dpf）的胚胎中，咯利普兰处理后可明显检测到p-ERK信号的显著增强（图3B、3C），这表明咯利普兰处理可激活斑马鱼幼虫的MAPK信号通路。而MEK抑制剂的共同处理则消除了MAPK通路的激活（图3B、3C），这与在磷酸二酯酶4（PDE4）阻断-MEK抑制剂联合处理方案中观察到的行为恢复相关。为了确认咯利普兰调控ERK信号的特异性并明确其分子机制，我们检测了5-dpf胚胎经咯利普兰处理后的RAS活性。与ERK1/2磷酸化结果相似，我们发现咯利普兰呈剂量依赖性处理后，活性RAS（RAS-GTP）水平显著升高（图3D、3E）。综上，我们的研究结果表明，递增剂量的咯利普兰可促进cAMP-RAS-MAPK通路的激活。

图3. 环磷酸腺苷与细胞外信号调节激酶信号通路的串扰用ERK1/2和磷酸化ERK1/2抗体进行检测。实验重复：(n=4)、(^{*} p<0.001)（单因素方差分析；图基多重比较检验）。(D和E) 用Raf-1结合琼脂糖珠进行免疫沉淀后，活性RAS（RAS-GTP）水平的蛋白质印迹法（D）和定量分析（E）。用RAS-GTP和RAS抗体进行检测。实验重复：(n=3)（30M对应(n=2)）、(^{* *} p<0.05) ***p<0.05（单因素方差分析；图基多重比较检验）。误差线代表均值标准误。(A) 斑马鱼幼鱼（5天龄）先用咯利普兰（15μM）或福司可林（7.5μM）处理1小时，再用或不用MEKi PD0325901（1.5μM）处理1小时后的总环磷酸腺苷浓度。实验重复：(n=3)、(p 0.05)、(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001)（单因素方差分析，图基多重比较检验）。(B和C) 斑马鱼提取物先用咯利普兰处理1小时和/或1.5μM MEKi PD0325901处理1小时后的蛋白质印迹法（B）和定量分析

MEKi 亚最大靶向活性用于治疗焦虑症

MEKi 是强效靶向疗法，旨在有效阻断 RAS 和 BRAF 激活突变癌症中的 MAPK 信号传导。我们希望测试完全抑制 MAPK 通路是否是治疗焦虑样行为的必要条件，或者部分靶向通路抑制是否也能诱导抗焦虑效果。用咯利普兰和 0.1 毫摩尔/升 MEKi 处理斑马鱼胚胎，与图 2 和图 3 所示的实验相比，剂量降低了 15 倍。斑马鱼裂解物的蛋白质印迹分析表明，0.1 毫摩尔/升 MEKi 可部分抑制磷酸化 ERK1/2（与二甲基亚砜处理组相比，磷酸化 ERK 水平降低 67%；图 4A）。在趋触性实验（受精后 3 天；图 4B）和幼体活性实验（受精后 5 天；图 4C）中，均观察到 0.1 毫摩尔/升 MEKi 对咯利普兰处理胚胎的抗焦虑作用。因此，MAPK 通路的部分抑制可有效改善焦虑样行为，尽管效果不如高剂量时显著，这也表明 MEKi 治疗有望根据疾病背景定制不同程度的通路抑制方案。

图4. 亚最大靶标浓度下的MEKi治疗可缓解焦虑症状(^{*} p<0.01)：(^{* *} p<0.001)（单因素方差分析；图基多重比较检验）。误差线代表96孔板中代表性孔的均值标准误（1小时）。实验重复次数：(n=2)，每个处理组24条幼体。(C) 咯利普兰（1小时）处理联合或不联合MEKi（1小时）对斑马鱼幼体（5天龄）游泳活性的影响。(B) 中单个斑马鱼幼体轨迹的图像；趋触性实验（3天龄），经15 μM咯利普兰和/或1.5 μM或0.1 μM MEKi处理。实验重复次数：(n=3) ERK1/2和磷酸化ERK1/2。实验重复次数：(n=3) (A) 咯利普兰（1小时）联合或不联合1.5 μM或0.1 μM MEKi PD0325901（1小时）处理的斑马鱼提取物的蛋白质印迹分析，并用ERK1/2和磷酸化ERK1/2抗体进行检测。

MEKi 治疗成年斑马鱼焦虑症

为了提高我们研究发现的转化影响力，我们测试了MEKi治疗是否能够缓解成年斑马鱼中因PDE4阻断引发的焦虑样行为，而非在神经元活跃发育阶段。我们从侧面追踪了五组成年同系斑马鱼，在装有1.0升水的鱼缸中观察它们的位置偏好（群体行为分析；(n=6) 实验重复）（图5A和5B）。咯利普兰处理的斑马鱼明显偏好容器底部，这与焦虑水平升高的表现一致（图5A和5B）。关键在于，与单独阻断PDE4相比，MEKi处理使咯利普兰处理的成年斑马鱼在鱼缸中的分布恢复正常（图5A和5B）。咯利普兰处理的斑马鱼皮质醇水平升高，这是应激水平上升的指标，而加入MEKi后皮质醇水平显著降低（图5C）。

图5. MEKi 改善成年斑马鱼的焦虑行为。（A）成年斑马鱼的群体行为测定：将斑马鱼在含指定处理液的1升系统水中孵育20分钟后，从侧面记录其行为并分析其在水箱中的分布情况。实验重复：(n=6)，每个处理条件设置25条成年斑马鱼。(^{* *} p<0.001)（双因素方差分析；Bonferroni事后检验）。(B) 从1升水箱侧面拍摄的5条成年斑马鱼群体运动轨迹的鸟巢式示意图，以及对应5分钟内斑马鱼在水箱各区域停留相对时长的活性热图。热图为基于动物坐标生成的二维核密度估计图，采用(C) 经处理的成年斑马鱼的皮质醇水平（(n=5)，单条斑马鱼数据）。(p <0.01)（单因素方差分析；Tukey多重比较检验）。自定义配色方案以提升可视化效果：白色（无/极少）、蓝色（低）至红色（高）。实验重复：(n=6)。误差线代表均值标准误（SEM）。参见图S2。

值得注意的是，与目前可用的抗焦虑药不同，但与图2、3和4中的幼虫研究结果一致，我们未发现MEKi单独对成年斑马鱼产生抗焦虑作用的证据。新水箱试验进一步证实了这一点：将单只成年斑马鱼放入新水箱（3升）中后追踪5分钟，并将其与抗焦虑药丁螺环酮（一种血清素受体(5-HT _{1 ~A})部分激动剂）和作为致焦虑剂的咯利普兰进行对比。接受抗焦虑药物丁螺环酮治疗的斑马鱼表现出抗焦虑作用，例如缩短了探索水箱上部区域的时间，而单独使用MEKi处理对斑马鱼的行为无影响（图S2）。因此，我们发现MEKi对患有环磷酸腺苷介导型焦虑的成年斑马鱼是强效抗焦虑药，但单独使用时并未表现出抗焦虑作用。

讨论

遗传和环境因素均会导致焦虑症和抑郁症的发生。人类遗传学和药理学研究表明，PDE4 在行为调节中发挥重要作用。然而，焦虑症的治疗以维持突触后神经元的信号传导为核心，这类治疗方法的效果各不相同，且往往伴随不良副作用。本研究提出了一种替代策略，用于筛选特定情境下的抗焦虑药物：首先构建斑马鱼PDE4阻断/环磷酸腺苷（cAMP）焦虑样行为模型，随后通过体内表型筛选抑制斑马鱼焦虑行为的物质。研究发现，最初作为抗癌药物开发的丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂（MEKi），在PDE4阻断/环磷酸腺苷（cAMP）活性的情境下具有显著的抗焦虑效果（图6）。咯利普兰诱导的焦虑样行为会使斑马鱼胚胎中GTP结合态（活性）RAS蛋白和磷酸化ERK蛋白的水平升高（图3C、图3D）；而MEKi处理则会降低磷酸化ERK蛋白的水平，同时缓解焦虑样行为（图2、图3、图4、图5）。值得注意的是，与丁螺环酮等临床有效的抗焦虑药物不同，本研究表明MEKi 单独使用时无抗焦虑作用（图2、图3、图4、图5及补充图2），这表明它们可能是现有焦虑症治疗方法的一种改进。

图6. 一种新型治疗策略：MEK抑制剂用于治疗环磷酸腺苷介导的焦虑症MEKi 作为 PDE4 阻断/腺苷酸环化酶激活类焦虑症新型治疗药物的重定位示意图。在对照组斑马鱼中，PDE4 是环磷酸腺苷（cAMP）活性的负向调节因子。PDE4 阻断/腺苷酸环化酶（AC）激活会导致 cAMP 活性增强并激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，同时引发焦虑反应。使用 MEKi 治疗可降低 MAPK 活性，发挥抗焦虑作用。

在小鼠中，焦虑的调节主要由PDE4A和PDE4B介导。基于以下原因，我们提出假设：咯利普兰在斑马鱼中引发的类焦虑行为是通过抑制Pde4A/B来介导的：(1) 小鼠和斑马鱼的PDE4A/B基因高度保守（Pde4a：73%同源性；Pde4ba：75%同源性；Pde4bb：72%同源性）；(2) 咯利普兰在斑马鱼中引发的类焦虑行为与Pde4a和Pde4b突变小鼠的焦虑表型一致；(3) 咯利普兰在斑马鱼中会导致皮质醇水平升高，这也与血浆皮质酮水平的升高相一致在小鼠PDE4A和PDE4B遗传突变体中的水平。有趣的是，与PDE4B不同，PDE4A缺乏ERK磷酸化位点，这表明PDE4B可能具有被MAPK信号通路直接调控的潜力。最后，与咯利普兰处理的效应相反，我们的遗传研究表明，与(pde4d d^{+/+})野生型同窝幼鱼相比，成年(pde4d d^{-1-})斑马鱼突变体表现出抗焦虑行为，包括鱼群规模增大和对鱼缸的探索行为增加（图S3B和S3C）。此外，(pde4d d^{-1-})突变体对咯利普兰的致焦虑效应有反应（图S3E），这表明咯利普兰在焦虑中的作用靶点是通过其他PDE4亚家族而非PDE4D实现的。

咯利普ram在小鼠体内也具有镇静作用，这可能与抑制PDE4D有关。我们在斑马鱼中未观察到镇静作用，原因可能是咯利普ram在斑马鱼中主要的PDE4靶点更可能是PDE4A或PDE4B；不过，我们确实发现pde4d突变体鱼的总游动距离较野生型同胞对照更短（图S3D）。有趣的是，在活性实验中，部分幼鱼对咯利普ram表现出高反应性（图1H和图2E）。目前，我们尚不清楚这是反映了斑马鱼中PDE4表达和焦虑调控存在差异的亚群，还是药物吸收和代谢存在个体差异。对PDE4亚家族进行进一步的时空表达研究，并结合遗传突变体，对于解析PDE4在焦虑中的功能具有重要意义。例如，小鼠体内PDE4B在与焦虑相关的脑区表达量最高。

药物研发的一个重要方面是将用于治疗某一种疾病的现有药物重新定位（重新利用）以治疗另一种疾病。MAPK 通路已被证实与 PDE4D 存在相互作用，但迄今为止尚未与其他 PDE4 亚家族及焦虑症相关联，这为焦虑症的治疗提供了新的机遇。高选择性 MEK 抑制剂目前正处于卵巢癌和甲状腺癌的临床试验阶段，也可单独使用或与 (BRAF ^{V 600 E}) 抑制剂联合用于黑色素瘤的治疗。我们及其他研究团队此前曾提出，MAPK 通路抑制剂有望用于治疗 RAS-MAPK 通路种系激活突变相关综合征（即 RAS 病）。值得注意的是，RAS 病的临床特征之一是焦虑症状加重，这与我们发现的 MAPK 信号增强具有致焦虑作用的结论相符。此外，咯利普兰可逆转 MEK 抑制剂 U0126 输注诱导的记忆缺陷，提示 PDE4-MEK 串扰可能也在记忆形成过程中发挥作用。基于动物模型研究，尽管癌症临床试验中尚未报道此类症状（曲美替尼说明书，美国食品药品监督管理局），但 MEK 抑制剂对记忆产生不良影响的可能性仍需开展临床研究。

将癌症背景下MEKi的有效浓度与行为障碍中的情况进行比较将十分重要。在我们的斑马鱼RAS病模型中，持续低剂量使用MEKi可恢复正常发育，且MAPK 通路抑制还会带来额外的不良发育效应。在癌症治疗中，需要更高浓度才能阻断 MAPK 通路，而较低剂量则可能有效恢复焦虑治疗中的正常 MAPK 信号传导。这对于最大限度减少 MAPK 通路抑制的不良效应具有重要意义。本研究发现，对 MAPK 信号的部分抑制足以降低斑马鱼的焦虑样行为，这表明亚最大的靶标活性可能对治疗焦虑样行为有效（图 4）。然而，我们观察到低剂量 MEKi 处理在活力测定中并未完全起效（图 5C），这提示除了 MAPK 信号的总水平外，异位激活导致的 MAPK 通路失调也与焦虑表型的形成相关。

综上所述，我们提出了一项概念性进展，即靶向MAPK串扰信号通路是治疗PDE4-cAMP介导的焦虑的一种新型治疗方法。我们认为PDE4-MEK串扰调控类焦虑行为，且这种高度特异性的MEKi最初是作为抗癌疗法设计的，在环磷酸腺苷水平升高的情况下，可能具有重新定位用作抗焦虑药的潜力（即使在低于最大有效剂量的靶向剂量下也是如此）。我们的研究凸显了在斑马鱼中开展无偏表型小分子筛选以及为精神健康疾病进行药物再利用在药物发现领域的重要价值。

意义

焦虑症是最常见的精神健康障碍之一，在西方成年人群中，有10%至20%的人在其一生中会受到该病的困扰。目前现有的药物治疗通过抑制神经元兴奋性发挥作用，但其疗效有限，且可能产生不良副作用。本文提出，最初为治疗癌症而研发的临床上有效的MEKi，或许可被重新用作治疗环磷酸氨苷（cAMP）水平过高引发焦虑的患者的抗焦虑药物。首先，我们通过处理[原文此处内容不完整]建立了一种焦虑样行为模型。使用PDE4抑制剂或cAMP激活剂处理的斑马鱼。该模型具有相关性，因为cAMP水平在行为中起关键作用，且我们此前已证实PDE4B的异常与精神健康疾病相关。接下来，我们针对能够在斑马鱼焦虑样模型中恢复正常行为的化合物开展了小分子筛选。表型药物筛选具有重要意义，因为它能让我们以无偏倚的方式确定先导药物，并在活体动物中发现新的作用靶点。我们发现MEKi在斑马鱼中是高效的抗焦虑药物，且PDE4阻断/cAMP激活引发焦虑的机制是通过刺激RAS-MAPK信号通路实现的。此前尚未有关于焦虑中cAMP-MAPK信号串扰的报道，而这一发现意义重大，因为它表明靶向该串扰的MAPK信号通路为焦虑症提供了一种强效的新型治疗策略。值得注意的是，我们的斑马鱼研究显示，与癌症治疗不同，MEKi在低治疗剂量下即可发挥作用，该剂量仅能促进部分靶标性MAPK抑制，从而有望最大程度减少药物诱导的副作用。综上，本研究的概念性进展在于，靶向MEK信号串通路是一种全新的抗焦虑靶点，且抗癌MEKi有望被重新开发为治疗cAMP介导型焦虑的抗焦虑药物。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。