题目：A Cellular-Resolution Atlas of the Larval Zebrafish Brain

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.04.034

期刊：Neuron

研究亮点

l 构建包含2000多个斑马鱼神经元的交互式数据库

l 发现顶盖和小脑的全新神经连接原理

l 基于相似性的层级聚类揭示了新型神经元形态型

l 首个在脊椎动物中实现全脑区域间单细胞分辨率的连接图谱

摘要

要理解全脑神经元动态，需要详细的底层环路结构图谱。我们基于2000多个单独绿色荧光蛋白（GFP）标记神经元的重建结果，构建了受精后6天斑马鱼脑的细胞分辨率交互式图谱。我们将数据集按“形态型”进行聚类，建立了一个独特的数据库，定量描述了神经元形态及其在体内的空间坐标。我们对100多种转基因表达模式分别进行成像，并与单神经元图谱进行共配准。通过标注72个不重叠的脑区，我们从数据集构建出幼鱼脑的区域间连接图谱，该图谱可作为突触级电子显微镜重建的基准。利用“虚拟示踪”方法解析我们的图谱，已揭示了顶盖和小脑中此前未知的连接原理。综上，本文介绍了一个持续更新的计算资源与可视化工具，这对阐明脊椎动物脑中功能与结构的对应关系至关重要。

图形摘要

引言

大脑感知感觉信息和协调运动的能力，基于相互连接的神经细胞的动态相互作用，这些神经细胞通常分布在多个脑区。由于神经元网络的复杂性，要确定单个细胞或细胞类型在这些过程中的作用颇具挑战。相关进展应来自成功将神经活动模式与其解剖基础联系起来的研究（Alivisatos 等人，2012；Bauer 等人，2018；Panzeri 等人，2017；Sporns 等人，2005）。为了让功能性神经解剖学具有参考价值，必须以系统、无偏倚的方式确定神经元之间的连接，并以图谱的形式进行可视化。解析大脑的完整连接图谱这需要对神经组织体积进行密集的电子显微镜重建，最好能达到单个突触的尺度（Denk 与 Horstmann，2004；Hildebrand 等人，2017；Ohyama 等人，2015；Varshney 等人，2011；Zheng 等人，2018）。然而，要理解大脑的基本组织特征，突触尺度的分辨率往往并非必需。相反，利用光学显微镜（LM）对大脑连接性进行介观描述，可为提出可验证的假设提供足够的框架（Bohland 等人，2009；Mitra，2014）。此外，构建电子显微镜（EM）连接组需要追踪数百乃至数千个切片中的神经纤维。一套可重复的细胞形态和区域间投射模式目录，可作为“真实基准”来剔除追踪延续和合并错误，从而加快电子显微镜相关研究的推进进程。

研究人员已基于单神经元重建结果，为黑腹果蝇绘制出全脑连线图谱（Chiang 等人，2011），该图谱揭示了果蝇大脑的整体网络结构，并可预测全脑信息流（Shih 等人，2015）。近期，研究人员也在小鼠身上开展了类似研究（Oh 等人，2014）。但由于小鼠大脑体积庞大、结构复杂，无法在单个细胞层面实施这一方法；因此，研究人员转而采用了基于网格的方法来绘制脑区之间的解剖学连接。该方法的弊端在于会标记多种细胞类型，同时丢失单个侧支分支模式的相关信息（Mitra，2014）。此外，目前尚无能够在细胞分辨率下检测小鼠全脑活动的方法。

斑马鱼幼鱼（斑马鱼）为全脑图谱研究项目提供了诸多优势。其身体透明、脑部体积小，再加上丰富的遗传工具库（贝尔与斯科特，2009；弗里德里希等，2013）以及定量行为检测手段（奥格与波拉维耶亚，2017），使得研究人员能够在斑马鱼幼鱼对感官刺激做出反应、出现眼部和尾部运动时，监测并操控其全脑神经活动（阿尔森等，2013；葡萄牙人等，2014；达尔·马西奥等，2017）。本研究通过构建数字化神经解剖学平台，丰富了斑马鱼幼鱼的研究工具库，该平台包含了一套无偏倚的细胞形态目录，以及细胞的空间坐标和长距离投射信息。

我们的方法采用了对不同但年龄匹配的大脑中单个神经元进行随机且无偏标记的方式，随后被变形至一个共同的坐标系（“标准大脑”）中（参见 Hawrylycz 等人，2011）。本文证明该格式具有可扩展性，能够轻松整合其他重建的神经元。重要的是，转基因表达模式（例如，来自不断增加的斑马鱼 Gal4、Cre 和 Q 品系库）可直接叠加，即时呈现神经环路组成的相关信息，并细化关于潜在连接性的假设。为了展示这一不断发展的资源的价值，我们提取出了顶盖和小脑中的新拓扑学原理。将该方法拓展至全脑层面，斑马鱼幼鱼脑连接组的首个版本已初步成型。目前，神经环路功能的计算模型仅基于慢速光学指示剂的成像技术构建，因此在很大程度上不受解剖学现实情况的限制（Naumann 等人，2016）。我们新资源的开放式交互式平台架构，使得将光学记录与被激活脑区的细胞分辨率解剖结构相整合成为可能。该图谱资源的这一应用已在 Kramer 等人（2019，本期《神经元》）的配套论文中得以实现。

结果

一种新型数字资源可实现独立神经元追踪与标准脑的共配准

为了对神经元的形态和位置进行数字化编目并在不同个体斑马鱼间进行比较，我们开发了一套流程，用于标记、扫描和数字化单个神经元，随后将其对齐至统一的坐标框架（图1A）。为了揭示神经元的形态，我们利用了荧光报告转基因系BGUG，该转基因编码一种高度斑驳的膜靶向绿色荧光蛋白（GFP），其表达由酵母转录因子Gal4的上游激活序列（UAS）驱动（Xiao和Baier，2007）。当与Gal4-VP16驱动系杂交时，该方法能在整体Gal4表达模式所覆盖的神经元中，于单个或极少数随机神经元中实现极稀疏的GFP表达。我们使用全神经元表达的Gal4系（elavl3: Gal4和Gal4s1101t），以无偏方式从所有脑区采样神经元。我们将研究重点放在可完整追踪的神经元上，排除网状脊髓投射神经元。为获得高信噪比，我们将被动透明技术（PACT）（Treweek等人，2015）适配至斑马鱼幼体。由于该透明处理方法会淬灭GFP荧光，我们通过针对GFP表位的抗体染色来可视化标记的神经元。每个脑还同时用突触蛋白（SYP）抗体染色，该抗体可勾勒出神经纤维网区域，并在不同个体间呈现高度定型的模式。

为了对单个BGUG标记的神经元进行共配准，我们首先通过对12条受精后6天（dpf）幼体斑马鱼的SYP模式进行平均，生成了一个标准脑（图1B和图1C）。为了消除我们标记方案引入的形变，我们使用了高级配准工具（ANT）套件提供的迭代对称组间标准化（SyGN）方法（Avants等人，2010年）。这一迭代过程不会偏向任何单个个体，而是代表了群体的无偏平均（图1C和图S1）。随后，包含BGUG标记细胞的单个斑马鱼脑使用 SYP 参考通道对齐至该模板，并通过计算方式对示踪神经元进行了转换（图1D）。通过这一流程，我们构建了包含1709个随机选取神经元的图谱，覆盖了整个大脑。

为证明我们的标记技术能无偏地对全脑进行采样，我们分析了36个脑区中被追踪神经元胞体的分布情况（见下文），并将其与胞体掩码进行了对比（图S2A）。对比相对分布时，我们发现胞体位置与胞体掩码的相关性良好，即胞体面积相对较大的脑区，同时也包含更多被追踪神经元的胞体（图S2B和S2C）。此外，由于我们的单细胞标记基于Gal4/UAS表达系统，我们还能通过更具限制性的驱动系来靶向特定细胞类型。为验证这一点，我们补充了使用特异性更高的驱动系（vglut2a:Gal4、Gal4s1171t、lhx9:Gal4、Gal4s1013t）获得的200余条追踪数据（图1E；视频S1）。对该数据集的标记偏倚分析显示，随着新增神经元数量的增加，相关性也随之提升（图S2D）。这种相关性的提升在视顶盖区域表现得最为显著（图S2E中的箭头）。综上，我们的实验流程能以明显无偏的方式标记全脑的神经元，这反映了所用Gal4驱动系的表达模式。

图1. 单神经元图谱的构建

单神经元形态可与转基因表达模式及其他数据模态对齐

为了为使用 SYP 以外的参考通道开展研究提供灵活性，我们为常用的免疫组织化学标记物和转基因报告基因生成了基于形状的平均值（图2A）。这些标记物和报告基因包括ERK1/2和HuC/D抗体，以及elavl3:lynTagRFP、bAct2B:GFP、vGlut2a:DsRed、elavl3:GCaMP5G、elavl3:nlsGCaMP6S和elavl3:H2BGCaMP6S转基因报告品系。借助这些桥接配准技术，我们将数据库与现有解剖学资源进行了关联，包括Z-Brain（Randlett等人，2015）和斑马鱼大脑浏览器（Marquart等人，2015）。重要的是，我们还能将不同实验室构建的Gal4品系的表达模式整合到本平台中（Asakawa等人，2008；Fo¨ rster等人，2017；Scott等人，2007）（图2B）。

研究人员通常更倾向于采用更具针对性的方法，而非对整个大脑进行成像，他们会聚焦于特定的大脑区域（例如，Kubo 等人，2014 年）。为了在我们的资源中纳入此类数据集，我们开发了一套计算流程，能够将子体积配准到标准大脑中。作为原理验证，我们对先前一项研究中绘制的 55 个僧帽细胞轨迹进行了对齐（Miyasaka 等人，2014 年）。僧帽细胞是一种投射神经元，负责将信息从嗅球传递到前脑的多个区域。在本案例中，研究人员仅采集了包含前脑和缰核的大脑子体积，并以突触前标志物 SV2 作为参考通道。基于 SV2 与 SYP 的标记模式应相似这一推断，我们裁剪了 SYP 参考染色图像，以匹配 Miyasaka 等人的成像区域，并以此为模板成功将他们的僧帽细胞轨迹对齐到我们的标准大脑中（图 2C）。最后，我们整合了一个大规模的顶盖数据集本实验室近期生成的投射神经元示踪数据 ((n=133))（Helmbrecht 等人，2018；图2B6）。这些工作的整体成功表明，本研究资源与以往的单细胞示踪研究具备向后兼容性，前提是能够建立与现有参考标记之一的桥接配准关系。

图2. 外部数据的整合

配准精度在单个大脑中具有亚细胞分辨率

为了评估配准的准确性，我们随后在SYP模式中确定了五个地标（纤维地标），并在多种共配准的Gal4模式中的致密细胞簇里确定了20个地标（细胞核地标），这些地标在单个脑区中易于识别（图3A；图S3A），并测量了它们与标准脑中对应地标之间的欧几里得距离（详见STAR方法）。该距离的范围在0.22至14.13微米之间，大多数数据点集中在2至7微米之间，中位数为4.38微米（图S3B和S3C），这与果蝇中已报道的结果相当（Jefferis等人，2007）。目前尚不清楚这种位置变异性在多大程度上是由生物学因素导致的，或是由配准误差引起的。无论如何，该数值占幼虫脑中典型细胞体直径（3-7微米）的一部分，证实了脑结构具有高度的 stereotypy（定型性），这种定型性似乎延伸至单个细胞核和轴突束的定位。这些数值来自经人工检查确认配准成功的样本。对于每个神经元，我们都人工检查了其下方图像堆栈的配准情况（详见STAR方法）。

作为配准准确性的测试案例，我们探究能否检测出视顶盖神经纤维网中视网膜神经节细胞（RGC）轴突末端已知的层状结构（Robles 等人，2014）。单个层的厚度约为4–10微米。当我们将数据库中的42条RGC轨迹同时显示时，能够分辨出单个视网膜顶盖层（图3B–3D）。我们数据集中的绝大多数RGC终止于顶盖神经纤维网的浅纤维灰质层（SFGS）（36/42），其中大部分仅终止于该层（26/42）。较少的RGC投射到顶盖的其他层（4/42），还有一小部分投射到顶盖外的视觉区域（2/42）。这一分布与先前一项追踪450个RGC的研究报道结果相似（Robles 等人，2014）。我们还能检测到一些较为罕见的RGC类型，包括在分支野7（AF7）和顶盖SO层均有侧支的类型（Semmelhack 等人，2014），以及一种多侧支RGC类型——它既投射到顶盖的中央白质层（SAC）/室管膜周层（SPV），也投射到丘脑和顶盖前区的多个分支野（Robles 等人，2014）。

为了验证我们的配准程序是否保留了视网膜神经节细胞（RGC）在顶盖终止区的已知视网膜拓扑特性，我们将RGC数据集按其起源于视网膜的鼻侧、颞侧、背侧和腹侧象限进行了划分，并检查了它们在顶盖中的投射位点。令人欣慰的是，我们发现它们的轴突主要终止于后部，分别对应顶盖神经纤维网的前侧、腹侧和背侧象限（图3E和图3F），这与早期研究结果一致（Baier等人，1996；Robles等人，2014；Springer与Mednick，1985；Stuermer，1988）。综上，在我们的标准大脑中对42个单独取样的视网膜神经节细胞进行数字共配准，能够清晰揭示视网膜-顶盖投射沿其视网膜拓扑和层状轴的结构。

图3. 配准准确性验证

一个交互式网页界面可实现预设亚体积内神经元的浏览与检索

为了让该图谱能被科研社区轻松获取，我们搭建了一个代码仓库（https://fishatlas.neuro.mpg.de/zebrafishatlas/ main_page#），并开发了具备以下核心功能的用户界面：

1)可视化：神经元最初在3D交互式浏览器中进行可视化（本研究以视网膜神经节细胞为例）（图S4A；视频S2）。用户可通过多种选项更改神经元的外观（如颜色、胞体大小和神经突粗细），还可选择将神经元镜像到大脑的任意一侧半球以用于展示（图S4B1）。每个神经元均配有元数据链接，例如来源实验室、Gal4驱动子、细胞类型（如有），以及描述该神经元的原始文献（图S4C1）。此外，还可显示特定神经元所支配的脑区，并且可选择仅针对神经元的特定部分进行检索（图S4C2）。用户找到感兴趣的神经元后，可通过NBLAST技术（Costa等人，2016）识别形态学相似的神经元（图S4C3）。当前的3D视图可通过截图导出为图像（图S4D），或下载追踪数据后借助外部可视化软件导出（图S4B2）。

2）基于位置的搜索：为了在我们的数据库中检索特定脑区的神经元，我们对斑马鱼幼体大脑进行了基础分割，得到79个脑区，覆盖全脑体积的81%。在示例中，我们选取视网膜和顶盖神经纤维网来检索视网膜神经节细胞（图S4E；视频S3）。用户选定一个或多个脑区后，可对单个脑区执行搜索，例如通过检索胞体位于该区域但轴突末梢延伸至区域外的神经元，来寻找投射神经元（图S4F）。对于涉及两个或多个脑区的更复杂搜索功能，我们提供了高级搜索功能（图S4G）。用户可执行逻辑“与/或”搜索，并指定神经元的哪一部分位于哪个脑区。在示例中，我们检索胞体位于视网膜、纤维末梢位于顶盖神经纤维网的神经元，以找到数据集中所有的视网膜神经节细胞。

3）基于表达模式的搜索：目前，斑马鱼幼体所有不同脑区尚未形成统一的注释。其中一个原因是缺乏明确的解剖学分界，导致脑区边界难以界定。基因表达模式常可用于标记脑区或其部分区域。为指导特定脑区的选择，我们将221个Gal4品系及其他标记物的独特表达模式与我们的标准脑进行了比对（见上文）。目前该数据集包含来自斑马鱼脑浏览器数据库（ZBB；https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/burgess/Brain+Browser）的Gal4表达模式，以及96个新的品系。在我们的具体示例中，我们使用了一种新构建的细菌人工染色体（BAC）转基因品系，该品系在胆碱能神经元中表达绿色荧光蛋白（GFP）（Förster等人，2017）。基于GFP的表达，我们选择性地标定了动眼神经核，并在该区域内寻找神经元（图S4H；视频S4）。通常，脑区并非由单一标记的表达定义，而是由多种标记的组合所界定。为适配这一特点，我们增加了同时可视化多个通道的功能（图S4I）。

“虚拟神经束示踪”揭示顶盖多模态输入的空间组织方式

我们接下来探究能否利用脑图谱来发现顶盖中新的连接原理。为此，我们重点关注视觉与非视觉神经支配的分离假说（Basso和May, 2017；Filosa等人, 2016；Li等人, 2018；Meek, 1983；Pe´ rez-Pe´ rez等人, 2003）。此前在成年硬骨鱼中的研究表明，非视网膜输入倾向于靶向顶盖神经纤维层中与视网膜神经节细胞（RGCs）不同的层次（Meek, 1983），但这种层状分离尚未在体型小得多的斑马鱼幼鱼脑中得到研究。我们将特征明确的视网膜接收层（Robles等人, 2013；Roeser和Baier, 2003；Xiao和Baier, 2007；Xiao等人, 2005）与数据集中其他传入神经所支配的层次进行了并列可视化（图4A和4B）。我们对靶向顶盖神经纤维层的视网膜神经节细胞（40/42）进行了可视化，并将其镜像至对侧半球，以比较同侧与对侧顶盖的神经支配情况（绿色和橙色，图4A和4B）。我们将体细胞位于左半球、向顶盖投射的非视网膜细胞((n=36))（n = 36）镜像至右半球（紫色，图4A和4B）。这些传入神经中的大多数（22/36）源自脑同侧的细胞，但我们也检测到了神经元该神经既支配了（9/36）对侧（5/36）的顶盖半球。对视网膜轴突和非视网膜轴突进行叠加分析发现，这两类神经元群体在顶盖神经纤维网中高度分离：正如之前所报道的，视网膜神经节细胞（RGC）轴突主要支配浅层的视顶盖浅层（SFGS），而非视网膜输入则主要靶向更深的层区，例如不存在RGC轴突的顶盖杏仁核层（SAC）（图4C）。

我们在单个神经元水平上分析了该数据集，以确定非视网膜输入的来源。我们根据胞体位置和投射模式，将36个非视网膜传入神经元手动划分为18个类别（图5D），并绘制出非视网膜顶盖输入的连接图谱（图S5）。大多数类别仅包含一个神经元，部分类别最多有9个（第6类；图4D）。大部分细胞起源于丘脑（10/37），且近期有研究描述这些丘脑神经元对 looming（逼近）刺激和亮度降低敏感（Heap等人，2018）。除丘脑外，其他主要输入来源包括峡核（NI，8/37，对应第2、17、18类）以及外侧线叶内侧核（MON，4/37，对应第1类）。后者接收来自侧线神经丘的输入，对水流敏感（Thompson等人，2016）。我们共鉴定出15个不同的向顶盖发出神经支配的区域（图S5），其中包括一些处理感觉信息（如MON和丘脑）或机体内部状态（如下丘脑中间部和网状结构）的区域。综上，从我们的脑图谱中提取的解剖学数据证实，顶盖在感觉信息与机体内部状态的多模态整合中发挥作用。

图4. 非视网膜顶盖传入神经的分析

脑图谱揭示了小脑投射的拓扑结构

脊椎动物的小脑参与协调的平稳运动和运动学习。小脑的一个组织学原理被提出为功能分区（Manni和Petrosini，2004）。在斑马鱼中，两种触发不同运动输出的相似视觉刺激（视动反应和视运动反应）已被证明能诱发浦肯野细胞的区域特异性活动（Matsui等人，2014）。此外，研究人员在颗粒细胞中发现了用于处理不同感觉模态的拓扑图谱（Knogler等人，2017）。为了寻找输出通路拓扑组织的证据，我们研究了从小脑发出投射的神经元。小脑的输出由两种细胞类型提供，即浦肯野细胞（PCs）和宽突细胞（ECs）。浦肯野细胞仅向内侧面神经核（MON）发出投射，而宽突细胞则为小脑提供更多样化的输出（Bae等人，2009）。我们共找到121个小脑输出细胞，其胞体分布于小脑体的内侧至外侧、头侧至尾侧范围内。其中大多数为兴奋性小脑核团细胞（91/121），其余为浦肯野细胞（30/121）。这些细胞的投射延伸至多个脑区，包括丘脑、下丘脑、被盖、内侧纵束核、动眼神经核与滑车神经核，以及网状结构和延髓（图S5A）。研究人员利用NBLAST算法（Costa等人，2016），根据细胞的形态相似性对单个细胞进行层级聚类（图5A）。在八个主要聚类中，有一个（聚类7）仅包含所有浦肯野细胞，其余兴奋性小脑核团细胞则分布于另外七个聚类中。为这些聚类赋予颜色编码（图5B、5C）后发现，不同兴奋性小脑核团细胞聚类的树突在颗粒细胞层呈镶嵌分布，提示存在输入的分区化。值得注意的是，不同聚类的细胞投射至不同的靶区（图S6A）。聚类1、2、3的树突在相同的头尾水平上沿内侧至外侧轴呈拓扑排列；其在被盖中的轴突投射虽发生翻转，但仍保留这一顺序（图S6B）。我们在兴奋性小脑核团细胞与丘脑的连接中观察到了不同的模式。在此区域，聚类1、3、5的树突在颗粒细胞层几乎形成完美的镶嵌分布，但其轴突在丘脑内相互交织（图S6C）。聚类4的兴奋性小脑核团细胞与其他聚类不同，它们是同侧中间下丘脑（Hi）唯一的输入来源，同时也是同侧被盖大部分输入的来源。这种拓扑关系为研究小脑的功能特化提供了切入点，因为它们可指导针对脑内特定位点的实验干预。

图5. 小脑输出的拓扑组织

神经元可根据位置和形态通过NBLAST算法进行分类

我们通过NBLAST技术根据形态学特征和神经支配模式对全部2143个神经元（包括僧帽细胞和顶盖投射神经元）进行了分类。研究人员计算了相似性分数以进行层次聚类（图6A、6B；视频S5）。观察树状图可以清晰地发现，神经元存在可分离的聚类簇。当我们将生成的树状图在高度为8的位置截断时，得到了22个不同的聚类簇。在这一切断阈值下，已能观察到与已知细胞类别一致的聚类簇（图6C），例如聚类13为动眼神经元、聚类14为视网膜神经节细胞（RGCs）。

然而，在该阈值下，许多聚类簇仍具有异质性。例如，聚类12包含了前脑中的多种神经元类型。当我们将截断阈值降至3时，聚类12中至少包含6种可区分的形态学类型（“形态型”；图6D），其中3种属于嗅觉通路。亚聚类12-2由嗅觉受体神经元（ORNs）组成，负责将嗅觉上皮的信息传递至嗅球（OB）；亚聚类12-4则为僧帽细胞（对比见图2C）。亚聚类12-1由嗅球的局部中间神经元构成，这些神经元可对嗅感受器神经元与僧帽细胞之间的信息传递。此外，我们还发现了三组大脑皮层和皮层下神经元（亚群12-3、12-5和12-6），它们与僧帽细胞的投射存在高度重叠，可能是其下游靶标。

聚类方法成功分离出了已知的细胞类型，并发现了明显的新型细胞。已知类型的三个例子包括：从腹侧内皮层核向缰核提供输入的神经元（Turner 等人，2016）（vENT-Hb；图 S7A1）、向脚间核（Nln）和上中缝核投射的缰核输出神经元（Amo 等人，2010）（Hb_PN；图 S7A2），以及从切线核向动眼神经核和中脑网状结构外侧部（nMLF）提供输入的切线神经元（Bianco 等人，2012）（图 S7A3）。新型细胞类型包括：投射到下丘脑和大脑皮层的被盖神经元（T-Hi/P，图 S7B1）、向丘脑、半环形 torus 和网状结构发出投射的 NI 神经元（NI-RF/TS/Th；图 S7B2），以及投射到下丘脑和网状结构内侧部的丘脑神经元（Th-Hr/mRF；图 S7B3）。

降低阈值还会导致不同的细胞类型进一步分裂为亚簇，而这些亚簇似乎并非真正的细胞类型。例如，视网膜神经节细胞（RGCs）可根据其树突形态和轴突投射模式进一步细分（Robles 等人，2014）；当我们降低树状图的切割高度时，视网膜神经节细胞被拆分为不同的簇（图 S7C）。然而，各簇之间的差异主要反映了细胞体和树突在视网膜内的位置，以及轴突在顶盖神经纤维层中的相应视网膜拓扑映射，而非侧支模式或层状分层。总之，我们的细胞形态目录可通过 NBLAST 自动整理，从而实现细胞类别的分类。但这类初步结果需谨慎解读，因为 NBLAST 对细胞体位置和神经突方向的权重往往高于形态学参数。

图6. 利用NBLAST技术对神经元进行组织与分类

结合单细胞示踪与脑区注释构建介尺度连接组

为生成全脑无向连接矩阵，我们将大脑划分为36个不重叠的区域，这些区域处于大致相近的本体论层级（图7）。这些区域覆盖了82%的脑容量。由于这些区域具有双侧对称性，我们将其分为左半球区域和右半球区域，共计72个脑区。尽管该标注并非详尽无遗，但我们可利用它生成介尺度连接组，该连接组将随着对解剖边界的进一步认知以及更多细胞的加入而不断完善。我们选择无向连接矩阵，是因为树突和轴突终末的区分并不总如图4、图5、图S5和图S6中先前示例所示那般清晰。

图7.图理论分析的大脑注释

从所有连接两个脑区的神经元中，对每一种可能的两个脑区组合，根据神经突总长度计算出单个脑区之间的连接强度（详见STAR方法）。为避免因脑区大小不同导致连接强度出现偏差，我们将连接强度除以两个脑区对的总体积进行归一化处理。该方法显示，全脑范围内的连接强度跨度超过(105)倍。观测到的连接强度符合对数正态分布（图8A），且随距离增加呈指数衰减（图8B；(R=-0.39)），这与其他动物的既往研究结果一致（Betzel和Bassett，2018；Ercsey-Ravasz等人，2013；Oh等人，2014），也与能使布线长度最小化的经济型网络组织特征相符（Bullmore和Sporns，2012）。

得到的连接矩阵使我们能够根据输入和输出的相似性对脑区进行层次聚类（图8C）。对于每个脑区，我们在标准大脑中标注了其三维质心（图8D；视频S6），颜色对应图8C中的聚类。我们还将连接矩阵绘制成三维连线图，节点大小代表节点度（与该脑区存在连接或接收其连接的神经元数量），连线粗细代表标准化后的连接强度（图8E；视频S7）。图中立刻显现出不同层级的组织结构，表明这并非随机排布。进一步观察可发现两个主要聚类。其中一个（聚类1，红色）由连接度高的节点构成，这些节点在整体网络结构中发挥重要作用，该聚类主要包含网状结构的亚区和中缝核。另一个聚类（白色矩形）则更具异质性。例如，聚类2（绿色）主要由位于外周的神经节构成，这些神经节向特定的脑中枢区域传递感觉信息，或向肌肉传递运动信息，但与网络其他部分的连接数量更少、强度也更弱（如嗅上皮或迷走运动神经元）。此外，我们还发现了存在强双向连接的脑区。例如，端脑的两个主要区域（背侧皮层和腹侧皮层）彼此之间存在强连接，同时也与对侧半球的对应区域、下丘脑的视前区以及后结节形成强连接（聚类3，青色）。

图8. 斑马鱼幼鱼全脑连接图谱

讨论

斑马鱼幼鱼正越来越多地被用于解答全脑层面神经系统组织和环路功能的基础问题（Vanwalleghem 等人，2018），但其神经解剖学仍相对未被充分研究。在此，我们介绍一种新的资源，这将有助于那些试图将神经元功能与底层结构联系起来的研究方法。我们构建了包含1955个神经元单条追踪数据的数据集，并将其配准至标准化的标准大脑。通过一组定型的解剖学标志，我们验证了配准精度达到亚细胞水平（4微米），且能忠实再现已知的神经连接原理，例如视网膜拓扑组织以及视网膜神经节细胞轴突终末分支的层特异性神经支配。为确保跨平台兼容性，并支持将外部数据提交至本平台，我们还将多种常用参考染色方法配准至标准大脑，包括常用的抗体染色和钙指示剂转基因表达图谱。亚体积成像实验获得的单细胞数据可轻松整合至本数据集，例如我们成功加入了由其他实验室此前重建的55个嗅球僧帽细胞（Miyasaka等人，2014），以及133个已发表的神经元单条追踪数据（Helmbrecht等人，2018）。我们还补充了Gal4和GFP转基因表达图谱数据集（Fo¨ rster等人，2017；Marquart等人，2015；Randlett等人，2015；Scott等人，2007）。早期研究采用了有髓轴突神经元的电子显微镜追踪数据（Hildebrand等人，2017），该数据集主要局限于外周和脊髓投射神经元，而本数据集则对其形成了补充。

我们持续增长的数据集可在线查看（https://fishatlas.neuro.mpg.de/zebrafishatlas/main_page#）。该网络门户支持交互式搜索神经元，并可视化其与其他神经元、常用标记染色及转基因表达模式的关联。社区可使用完整的搜索、浏览和查看功能工具箱，且该门户将进一步扩展以适配其他数据类型。例如，本文呈现的这一资源将对研究人员有所帮助，他们希望在全脑成像研究中寻找功能相关区域之间的解剖连接（Ahrens 等人，2013；Portugues 等人，2014）。我们的数据库已在一项配套研究中成功应用（Kramer 等人，2019），该研究补充了用于研究处理光流神经环路的 GCaMP6 成像研究。研究人员发现了连接顶盖前区与小脑及网状结构的长程投射神经元，这构成了一条被认为可驱动光流行为反应的感觉运动通路。

为了便于数据挖掘和发现新型神经元细胞类型，我们使用NBLAST算法分析了数据集，该算法是为果蝇的大型单细胞神经元数据集开发的（Costa等人，2016）。对整个数据集进行全对全比较，为我们生成了形态学相似性矩阵，并在此基础上执行了层次聚类。通过调整生成的系统发育树的切割高度，我们能够识别出多种已知的细胞类型，证实了NBLAST算法的稳健性。我们还通过观察发现了几种新型细胞类型。然而，此类初步结果需要谨慎解读，因为NBLAST算法往往会对细胞体和神经突赋予更高权重位置的影响远大于内在形态学参数。展望未来，我们设想该数据库将成为一个开放获取的资源库，类似于 http://neuromorpho.org/（Akram 等人，2018；Ascoli 等人，2007）。尽管全面的细胞类型普查更有可能来自基因表达谱分析，即单细胞 RNA 测序（McKenna 等人，2016；Pandey 等人，2018；Raj 等人，2018），但斑马鱼神经元的形态学分类——理想情况下结合其转录组特征和发育谱系——将对实验神经科学家和计算神经科学家都极具价值。

为深入了解斑马鱼幼鱼大脑的整体结构，我们构建了细胞分辨率的介观连接组。为此，我们将大脑划分为72个不重叠的脑区，并测定它们之间的两两连接强度，生成无向图以进行进一步分析。在当前数据库仅覆盖约2%全部神经元的阶段，若干组织原则已显现。脑区间的连接强度呈现对数正态分布，且随距离呈指数衰减。这与大脑网络组织的经济理论相符，该理论指出大脑以短程连接为主，以降低布线成本（Bullmore & Spons, 2012）。我们发现斑马鱼幼鱼大脑具有核心-外围结构：主要与感觉或运动功能相关的脑区归为一个模块，而参与高阶整合的更中枢区域则归属于另一模块。例如，我们发现前脑与视前区及后 tuberculum 共同构成一个解剖上与中脑和后脑分离的独特模块，而中脑与后脑之间的连接似乎更为紧密。这与全脑成像实验结果一致，该实验报道中脑与后脑间的自发活动相关性强于前脑（Ahrens et al., 2013）。我们提醒切勿过度解读本研究结果，因为仍有大量形态型有待描述。不过，鉴于我们的研究流程简便，且其他实验室的数据可轻松整合到我们的标准大脑模型中（僧帽细胞的研究即为例证），未来几年内有望完成对神经元的全面统计。此外，随着数据集的不断扩充，有望应用机器学习算法区分轴突与树突（Lee et al., 2014）。

为了证明我们数据集的即时实用性，我们对支配顶盖的传入纤维进行了虚拟束路追踪。首先，我们研究了模态特异性输入的层状组织，发现视网膜神经节细胞（RGC）与非视网膜轴突存在分离，视网膜神经节细胞以内侧至浅层为靶区以及主要以深层为靶标的非视网膜纤维。这与成年金鱼的情况一致（Meek, 1983）。当我们进一步研究提供非视网膜输入的单个细胞时，确定了18种不同的细胞类型。向顶盖提供的最主要非视网膜输入来自丘脑。此类丘脑-顶盖神经元近期被报道可对视野变暗产生反应（Heap et al., 2018）。另一项重要输入来自对侧MON，该区域接收来自侧线和内耳的感觉输入（Liao and Haehnel, 2012; McCormick, 1989）。与这一解剖结构一致，功能成像检测到顶盖深层对侧施加的水流和听觉刺激产生了反应（Thompson et al., 2016）。我们还证实，这些轴突大部分也在半规管 torus 中形成分支（Fame et al., 2006），这是此前研究未发现的特征。从网络角度来看，顶盖的位置十分理想，可直接连接感觉区和运动区。同时，它也与大脑其他区域实现了充分的整合，使得其他脑区的信息能够对顶盖内发生的感觉运动转换产生调控作用。这种外源调控的“专用通路”原则已在基于视觉物体大小的趋近或回避决策中得到证实。斑马鱼幼体会追逐小型类猎物斑点，并对大型斑点做出逃避反应（Barker and Baier, 2015）。引导动物向物体靠近或远离的顶盖输出通路在解剖学上是相互分离的（Helmbrecht et al., 2018）。趋近与回避的决策由顶盖介导，而来自5-羟色胺能系统的饥饿刺激可改变动物的行为倾向，使其对通常会引发逃避反应的更大刺激产生趋近行为（Filosa et al., 2016）。我们的数据集还揭示了来自脑中枢区域（PO、PT、T）的额外输入，这些输入可能对这一决策过程起到调控作用。

我们的数据集首次让我们能够描述小脑投射神经元的拓扑组织。硬骨鱼类缺乏哺乳动物的小脑深核，取而代之的是一类特殊的细胞类型——EC细胞，这类细胞接收来自浦肯野细胞的直接输入，并向其他脑区广泛投射（Bae等人，2009）。我们数据库中收集的91个EC细胞支配了中脑和后脑的大部分区域。通过NBLAST技术（Costa等人，2016），我们将EC细胞分为七个不同的类别。对其投射模式的进一步观察揭示了一种拓扑组织。它们的树突在颗粒细胞层的解剖学紧凑区域呈平铺分布，轴突则投射到不同但部分重叠的脑区。这种拓扑输出为相关机制提供了解剖学基础分区化的小脑后核（PC）活动会转化为特定的运动模式，这一点在视动反射和视动反射的相关研究中已得到证实（松井等人，2014年）。综上，本研究资源的高保真共配准功能，为开展虚拟束路追踪研究、在计算机模拟环境中验证相关假设以及发现新的神经环路构建原理提供了可能。

另一项将从这一新资源中极大获益的研究方向是对神经环路结构的高密度电子显微镜（EM）重建（登克与霍斯特曼，2004；希尔德布兰德等人，2017；小山等人，2015；瓦尔什尼等人，2011；郑等人，2018）。在数百乃至数千张超薄切片上追踪神经纤维需要高空间分辨率和图像对比度，且极易出现神经纤维延续与融合错误，针对长距离投射的此类错误尤为突出。若能将电子显微镜绘制的神经连接图谱与真实细胞形态和投射模式的目录进行比对，这类错误将能被更准确地识别。因此，我们的细胞分辨率图谱提供了解剖学上的“真实基准”，这对于构建斑马鱼幼鱼大脑完整的突触水平连接组至关重要，也将助力我们对全脑神经元动态的理解。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。