题目：Genetic Control of Collective Behavior in Zebrafish

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100942

期刊：iScience

摘要

包括人类在内的许多动物都进化出了群居生活和活动的方式。在人类身上，社交互动受到干扰是多种精神疾病的基本特征。然而，我们对基因如何调控社交行为的了解还很有限。斑马鱼或许是探索这一问题的理想模型。通过对比野生型斑马鱼与90个突变品系的行为，我们发现与人类精神疾病相关的基因突变能够改变成年斑马鱼的群体行为。我们将突变体的行为变异分为三类：“分散型”，即斑马鱼表现出群体凝聚力降低；“协调型”，即斑马鱼以更整齐的鱼群形态游动；以及“簇拥型”，即斑马鱼形成密集但杂乱的群体。个体互动规则的改变可以解释这些差异。这项研究揭示了动物群体的涌现模式如何因个体的基因变化而改变，并为理解社交信息处理的基本原理奠定了框架。

图文摘要

引言

在众多物种中，生存依赖于群体中个体的协同配合，比如鱼群、鸟群或蚁群。群体动态机制可提升觅食能力并迷惑捕食者（克劳斯等人，2010）。社交互动对人类同样至关重要，自闭症和精神分裂症等精神疾病患者因社交处理缺陷而出现的严重功能障碍就印证了这一点（亨利等人，2016；托罗相与博塔，2017；格尔夫妇，2016）。多项针对不同物种的研究表明，动物群体中个体形成的运动模式，可由相对局部的互动自发产生（库津等人，2002；滕斯特伦等人，2013；卡洛维等人，2018）。尽管已有研究证实刺鱼的群游行为受遗传调控（佩歇尔·凯瑟琳与马克斯·戴维，2017），但目前仍不清楚集体行为的哪些特征可能受到遗传调控，以及具体由哪些基因调控。为斑马鱼开发的遗传、神经和行为学研究技术，使其成为解答这些问题的理想模式生物（诺顿与巴利-屈夫，2010；斯图尔特等人，2014）。斑马鱼是高度社会化的动物，展现出一系列复杂的行为特征（耿与彼得森，2019）。近期有多项研究对比了单一突变株与野生型斑马鱼，证实单个基因可改变斑马鱼的社交互动与集体行为（黄等人，2019；刘等人，2018；古铁雷斯等人，2019；金等人，2017）。

结果

突变体斑马鱼群体在游泳行为上存在差异

我们利用CRISPR-Cas9技术在90个与精神疾病相关的基因中引入突变（数据S1），并开展实验探究这些突变如何自由游动斑马鱼的集体行为产生影响。我们在成年斑马鱼（各类社交行为发育成熟后）对突变体进行评估（Buske和Gerlai，2011），对比它们在开放圆形竞技场中游泳时的集体行为（图1A、视频S1）。除scn1lab和slc18a2基因外，所有突变体均以纯合成年个体的形式进行测试；这两个基因的纯合个体无法发育至成年，因此以杂合鱼的形式开展测试。我们对每个品系进行了多次试验，每次试验均使用不同的斑马鱼（表S1）。

斑马鱼倾向于成群游动，有时会与其他鱼对齐并一起移动（图1B），有时则以紧密且无序的姿态游动（图1C）。我们发现突变鱼的游动速度、群体间距和极化程度存在差异。尽管使用同一品系进行的不同实验之间存在较大差异，但许多品系都表现出一致的趋势（图1D–1F）。此前针对多种鱼类的研究表明，个体速度直接影响运动动态，速度越快，个体间的间距越宽、同步性也越强（库岑等人，2002；滕斯特伦等人，2013；约勒斯等人，2017）。与该研究结果一致，大多数游泳速度更快的突变品系，其个体间间距更大、群体极化程度更高（图1D–1F、图2A及图S2）。线性回归和指数回归分析显示，速度可解释个体间间距、群体极化程度、速度四分位距（IQR）、运动时间、最近邻距离以及群体质心速度总变异的约30%（图S2；详见透明方法）。然而，在剔除速度的影响并考虑实验批次的变异性后，仍有多个品系与野生型（WT）存在差异（图2B）。

图1. 不同突变品系的群体行为模式存在差异(A)在每次实验中，从上方拍摄六条成鱼，观察它们在圆形竞技场中的游动情况。(B和C) 野生型（WT）鱼群的典型游动轨迹，分别呈现出排列整齐（B）和无序（C）的群体形态。每条轨迹均展示了1秒的游动过程。(D–F) 所有品系鱼的游动速度中位数(D)、群体间距(E)和群体极化度(F)的箱线图。每个点代表一次实验的数据。线条按速度从低到高排列。彩色点突出显示了在某些行为特征上与野生型鱼存在差异的品系示例。图S1展示了其他行为指标的类似图表。另见图S1、表S1、视频S1和数据S1。

图2.速度仅部分解释了跨行更改的组行为。在纠正速度差异之前（A）和之后（B）的七个行为指标的中值中，突变系和WT之间的差异。行按增加速度的顺序列出。五个突出显示的行的颜色具有与图1相同的约定。粗体轮廓表示与WT的统计显著差异，通过考虑给定行的试验中每个数量的可变性来确定（Dunnett检验，(p<0.05)）。单位是指跨行中值的均方差。另见图S2。

三种模式揭示显著的行为差异

我们发现，分散型、协同型和聚集型这三种总体模式构成了突变斑马鱼运动行为最显著的差异。分散型表型的鱼群个体间间距大、极化程度低，以突变系scn1lab+/(编码Nav1.1蛋白[Schoonheim等人，2010])和ctnnd2b/(编码δ-连环蛋白[Turner等人，2015])为代表。这些突变体的个体间间距较大，尽管偶尔会形成群体，但彼此分离的频率更高，且集体协调性更差。协同型表型的鱼群个体表现出更强的行进方向趋同倾向，能作为一个整体协同移动，以chrna2a/(编码α2-烟碱型乙酰胆碱受体[Demontis等人，2019])为代表。聚集型表型的鱼群则以低极化和紧密间距为特征，这类群体通常密度高但排列无序，斑马鱼会在相对局部的区域内停留更长时间游动，以disc1/(编码精神分裂症相关蛋白[Blackwood等人，2001])和immp2l/(编码线粒体内膜肽酶2样蛋白[Casey等人，2012])为代表。

我们在控制速度后，对每个品系行为指标的中位数进行主成分分析（PCA）（图2B），以描述并量化群体行为的不同模式（图3）。我们发现前两个主成分能揭示品系间大部分相对行为差异，体现出分散、协同或聚集表型之间的区别。需注意，尽管图3突出显示了五个在PCA维度上表现出明显差异的突变品系，但其他品系也与野生型（WT）存在差异（图3C和图S3）。通过自助法（bootstrap procedure）考虑实验变异性和有限采样的影响后，结果显示部分品系在前两个PCA成分中的一个或两个上与野生型分离，而其他品系则与野生型存在重叠（图S3）。虽然前两个成分体现了最大比例的变异，但部分品系在第三个PCA成分中也表现出明显差异。例如，尽管两者均表现出聚集表型，但与disc1/斑马鱼不同，immp2l/斑马鱼会花费时间静止不动，即处于“冻结”状态。正因如此，这两个品系的PC3得分符号相反（图3B），且通过改进的PCA分析方法，它们在“冻结成分”上实现了分离（图S4；详见透明方法部分）。

图3：主成分分析揭示基因突变中行为变异性的类别针对与野生型（WT）相比的五条重点品系的输入指标，组间距发生了变化。第二个和第三个主成分反映了极化与移动时间占比的组合情况：主成分2（PC2）的正值（A）左图：在考虑速度因素后，各品系间剩余变异的90.8%可由三个正交成分来描述。第一个成分对应高极化且移动时间增加，而PC3的高值则对应高极化且频繁静止。右图：数值（B）中心图：所有遗传品系的数据在头两个主成分上的投影；在第三个主成分上的投影单独展示于右侧。边缘图：野生型（WT）和五条重点品系的典型运动轨迹（1000帧，约17秒）。“分散型”表型由主成分1（PC1）的正值和主成分2（PC2）的负值共同表征；“协调型”表型由PC2的正值表征；“扎堆型”表型由PC1和PC2的负值共同表征。表S2按各主成分上的位置顺序列出了各品系。另参见图S3、图S4及表S2。

模型拟合将群体行为与个人交互规则联系起来

有证据表明，集体运动动力学可以用个体之间相对简单的相互作用规则来解释，例如一条鱼如何根据其位置改变其轨迹邻居（Couzin et al.，2002； Calovi et al.，2018；Heras et al.，2018；Harpaz et al.，2017；Katz et al.，2011；Zienkiewicz et al.，2018）。我们使用一个模型来询问在集体运动中观察到的显著差异（即分散的、挤在一起的和连贯的集体运动模式）是否可以通过个体如何转向以响应相邻鱼类的差异来解释。该模型使用邻居位置和速度来确定有效的吸引力和对齐力，这些力最好地预测鱼在指定的时间延迟后是向左还是向右转弯（有关详细信息，请参阅透明方法）。我们审查了吸引力的距离依赖性（((G_{att }(r_{j})))）、对齐的距离依赖性（((G_{ali}(r_{j})))）和相对整体强度的吸引力对齐（a）为WT鱼和突变行举例说明三个独特的组模式的差异：分散（scn1lab+/-）、协调（chrna2a/）和挤在一起（disc1/）。对于野生型（WT）斑马鱼，对邻近个体的有效“吸引力”随距离增加而增强，而趋同性则随距离增加而减弱（图4C）。这些趋势与以往关于斑马鱼的研究结果一致（Calovi等人，2018年）。与野生型相比，scn1lab+/-斑马鱼的吸引力距离依赖性更弱，且趋同性随距离的下降速度更快（图4C）。这表明scn1lab+/-斑马鱼主要与近距离的邻近个体互动，往往会忽略远距离的个体，这也导致了我们在这些品系中观察到的鱼群不稳定性和分散行为。对ctnnd2b突变体的模型拟合也显示出类似趋势（图S5B）。值得注意的是，该模型对scn1lab+/-斑马鱼转向决策的预测准确率低于野生型斑马鱼，这说明scn1lab+/-斑马鱼的运动决策受邻近斑马鱼的影响一致性更低（图4B）。相比之下，chrna2a突变体的运动行为比野生型更可预测，且对远距离的邻近个体表现出较强的吸引力（图4C），这也解释了这些品系形成的鱼群具有凝聚力的特性。disc1突变体的相互作用函数整体上与野生型相似，但吸引力与趋同性的比值更高（图4C）；对immp2l突变体的拟合也显示出类似趋势（图S5B）。这种社交反应性的变化使得个体之间保持近距离，却无法作为一个整体群体协同移动。总体而言，我们的研究结果表明，个体斑马鱼对邻近个体的反应方式存在差异，可能会导致观察到的不同群体层面的模式。

图4 一个简单模型揭示不同品系在个体层面相互作用规则的差异另见图S5：对远距离同类的吸引力。disc1/突变体的相互作用函数总体上与野生型（WT）相似，但在吸引力上表现出更高的吸引力与对齐的比率依赖性，且对齐度随距离变化的下降速度更快。相比之下，chrna2a/突变体则表现出相对较强的试验结果。为便于对比，图中以黑色实线展示了与野生型整体拟合的结果。与野生型相比，scn1lab+/-斑马鱼表现出更弱的距离吸引力(G_{att }(r_{i}))，且对齐的距离依赖性(G_{a k}(r_{i}))也有所不同。粗线代表所有试验的整体拟合结果，细线则为各试验的单独拟合结果。（C）野生型及scn1lab (+/-)、disc1/和chrna2a/突变体的拟合结果。图中展示了吸引力/对齐比率a，以及能最佳预测试验中所有斑马鱼运动决策的有效吸引力和对齐力的距离依赖性。（B）模型的预测能力，箱线图展示了不同品系斑马鱼各试验中正确预测转向比例的分布情况。野生型的时间延迟为1秒（延迟时间根据突变体的不同速度进行了调整——详见透明方法）。该拟合得出了群体中斑马鱼的相互作用函数，模型以相邻同类的相对位置和朝向为输入，预测个体在指定时间后向左或向右转向的概率。（A）某一时刻一条目标斑马鱼（黑色）的示意图，其周围有五条不同位置的相邻同类（红色），箭头指示其朝向。

讨论

本研究采用量化行为学指标，揭示了基因如何调控群体行为模式。群体中形成的模式——包括其结构、凝聚力、领导力及动态变化——关乎物种的适应度与对环境变化的适应能力，进而影响其进化过程。本研究为理解基因、社会互动与感觉运动转换之间的关系奠定了基础。已有研究表明，仅靠游动速度就能推动鱼群结构和动态的变化（库岑等人，2002；滕斯特伦等人，2013；约勒斯等人，2017），而本研究发现，改变游动速度的突变确实通常会以可预测的方式改变群体行为。不过，本研究还发现了一些突变，其对群体模式和动态的影响与速度影响相互独立。这些突变可分为三类模式，即协调型、分散型和聚集型，每类模式均对应若干突变斑马鱼品系的行为特征，且可能源于个体间互动规则的差异。

在我们的结果中，我们重点标注了与野生型（WT）行为差异显著的五个品系：scn1lab+/-、ctnnd2b-/-、chrna2a-/-、immp2l-/-和disc1-/-。不过我们注意到，除此之外，其他突变品系也与野生型存在明显差异（图2、图3及补充图S3）。我们还注意到存在这种可能性部分基因未表现出行为表型，原因可能是旁系同源基因的活性（Hoffman 等人，2016），或是CRISPR-Cas9 触发了旁系同源基因或其他基因的转录上调（El-Brolosy 等人，2019）。

这些突变对单个斑马鱼的影响可能体现在感觉、运动或整合过程中，我们不能断言受影响的基因在功能上具有专门的“社会性”，而是这类对个体的影响会表现为群体行为的改变。例如，已知纯合缺陷型scn1lab突变体斑马鱼幼鱼（与本研究中研究的杂合型斑马鱼不同）在与视动反射相关的眼跳之后，部分丧失了维持眼球位置的能力（斯库恩海姆等人，2010年），且作为单个幼鱼其游动活跃度有所升高（巴拉班等人，2013年）。在后续研究中，明确构成集体和社会行为基础的感觉运动转换机制及相应的神经活动特征至关重要。借助透明的斑马鱼幼鱼，全脑成像技术可检测从刺激开始到后续运动输出过程中的神经活动（陈等人，2018年）。包括固定斑马鱼结合虚拟现实技术在内的新工具，或许能实现对成年斑马鱼集体行为相关的类似评估（黄等人，2019年；斯托尔斯等人，2017年）。

多种能产生独特集体行为模式的突变存在于与人类精神疾病相关的基因中。例如，CTNND2的变异与自闭症相关（特纳等人，2015）；DISC1与精神分裂症、双相情感障碍和重度抑郁症相关（布莱克伍德等人，2001）；CHRNA2与尼古丁和大麻滥用相关（德蒙蒂斯等人，2019）；SCN1A与自闭症和癫痫（德拉韦综合征）相关（卡特拉尔等人，2010）；且在部分研究中，IMMP2L与自闭症相关（凯西等人，2012）。尽管我们在将鱼类的集体行为与人类的任何特定社会表型关联时持谨慎态度，但需指出，“社会大脑”的相关成分已被证实从鱼类到人类都具有保守性（奥康奈尔和霍夫曼，2012；耿和彼得森，2019）。此外，社会相互作用实验或许能为评估药物对基因明确的动物行为缺陷的作用提供灵敏的方法。针对鱼类其他行为表型逆转的药物筛选研究，已发现了成功用于治疗人类精神疾病的药物（巴拉班等人，2013；王等人，2019；霍夫曼等人，2016）。

研究的局限性

本研究中，我们鉴定出斑马鱼数个基因的突变会导致其群体游动行为发生改变。尽管我们发现游动速度的变化并非所有行为变异的成因，但本研究并未探究感觉处理或情感反应的其他变化是否与社交动机相互作用，进而引发这些行为改变。此外，尽管我们总结出了描述不同品系行为差异的三种普遍模式，但本研究未验证类似的行为变异是否反映了相同神经解剖和细胞通路的变化。未来需通过对特定突变品系的解剖变化和神经活动展开实验，才能解决这一问题。虽然我们分析了每个品系不同试验间的变异性，但由于追踪过程中难以标记个体身份，我们未研究个体间的差异。最后，尽管我们构建了能解释群体层面行为差异的个体水平模型，但本研究未直接验证模型中的有效作用力是否反映了斑马鱼内在的决策过程。后续研究需验证模型中相互作用函数的具体形式，并探究突变斑马鱼的行为差异是源于社交反应，还是感觉、运动或整合过程的不同。

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