题目：Zebrafish Model for Functional Screening of Flow-Responsive Genes

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27834691/

期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology（ATVB）

摘要

目的——动脉粥样硬化起始于动脉分支和弯曲处，这些部位存在紊乱的血流，会产生低切应力。这种机械环境通过诱导内皮细胞凋亡和功能障碍来促进病变形成，但其相关机制尚未完全明确。尽管基于转录组的研究已发现了多个剪切力响应基因，但它们中的大多数功能仍未知。为解决这一问题，我们探究了斑马鱼胚胎是否可用于功能性筛选调控哺乳动物动脉内皮细胞凋亡的机械敏感基因。

研究方法与结果——首先，我们证实了血流可调控斑马鱼血管发育过程中内皮细胞的凋亡。具体而言，与暴露于血流的对照组相比，抑制斑马鱼胚胎的血流（通过靶向心肌肌钙蛋白实现）会使内皮细胞凋亡率提升(≈10 %)(≈1%) 1%。通过对猪主动脉高、低切应力区域的内皮细胞进行转录组测序，我们筛选出了一批凋亡候选调控因子。针对那些差异表达最显著且拥有1-2个斑马鱼直向同源物的基因，我们采用敲除方法，探究其在斑马鱼血管暴露于血流或无血流条件下对凋亡的调控作用。结果在4个基因中观察到了表型变化：p53相关蛋白（PERP）和程序性细胞死亡2样蛋白作为凋亡的正向调控因子发挥作用，而血管生成素样4和钙粘蛋白13则为负向调控因子。通过对培养的内皮细胞施加血流进行研究，我们进一步验证了切应力对perp、cdh13、angptl4和pdcd2l的调控作用，以及perp和cdh13对内皮细胞凋亡的影响。

结论——本研究得出结论，将血流操控的斑马鱼模型与基因敲低相结合，可用于血管内皮细胞机械敏感基因的功能筛选，从而为预防或治疗动脉粥样硬化易感部位的内皮损伤提供潜在治疗靶点。

内皮细胞（EC）对壁面切应力（WSS）的反应在血管稳态中发挥关键作用，同时也与动脉疾病的发生相关。壁面切应力是流动血液作用于内皮的一种力。在血流紊乱区域，斑块会形成，这些区域会出现血液动力学停滞位点，且壁面切应力强度低、方向多变（呈振荡状态）。这些血液动力学条件会诱导内皮细胞凋亡和功能障碍，从而促进动脉粥样硬化的发生。这与动脉粥样硬化的病理生理学密切相关，因为内皮细胞凋亡会在低壁面切应力位点启动病变发展，并推动斑块侵蚀，其相关机制目前仅部分明确。相比之下，暴露于均匀血流的动脉区域具有保护作用，因为这些部位的高壁切应力（WSS）使内皮细胞（EC）维持在静息状态。以往对内皮细胞转录组的研究表明，血流会改变数百个基因的表达，但其中大多数基因的功能尚不明确。因此，迫切需要开发新策略来鉴定血流调控基因的功能及其在血管生理学中的作用。基因功能筛选是一种广泛用于研究细胞对生物化学信号反应的高效且无偏倚的方法。然而，据我们所知，针对受机械力作用的细胞进行功能筛选的研究尚未见报道。

斑马鱼是一种独特的脊椎动物模型，它兼具无脊椎动物模型的优势（体型小、遗传操作能力强、繁殖率高、易于饲养且成本相对较低），同时与哺乳动物在进化上高度保守。因此，斑马鱼不仅是研究脊椎动物发育和生理学的宝贵模型，也是构建人类疾病模型的重要工具。尽管斑马鱼胚胎已被广泛用于研究血流对血管生成及其他发育过程的影响， 但在研究成年血管系统方面的应用却相对较少。

本研究验证了这一假设：血流对血管内皮细胞（EC）生理功能的调控机制，至少在成年哺乳动物动脉与发育中的斑马鱼血管系统之间存在部分保守性。若该假设成立，那么斑马鱼胚胎将为研究在成年哺乳动物动脉中共表达基因的功能提供有价值的模型。本研究通过探究斑马鱼胚胎是否可用于鉴定不同血流动力学条件下调控成年哺乳动物动脉细胞凋亡的基因，对该假设进行了验证。

研究发现，在发育中的斑马鱼血管系统中，血流是调控血管内皮细胞凋亡的关键因素。研究人员通过对猪主动脉高壁面切应力（WSS）和低壁面切应力区域血管内皮细胞进行转录组分析，筛选出了一组在哺乳动物动脉中表达的血流敏感输入基因。在斑马鱼胚胎中对这组基因进行基因沉默后，鉴定出4个调控凋亡的基因：perp（p53相关蛋白）和pdcd2l（程序性细胞死亡2样蛋白）在血流停止条件下作为凋亡的正向调控因子发挥作用，而cdh13（钙黏蛋白13）和angptl4（血管生成素样蛋白4）则具有抗凋亡功能。通过对鼠类内皮细胞进行原位染色以及利用经血流处理的血管内皮细胞实验，证实了切应力对PERP、PDCD2L、CDH13和ANGPTL4的调控作用。通过对培养的人血管内皮细胞进行基因沉默研究，进一步验证了PERP和CDH13调控血管内皮细胞凋亡的能力。

综上，调控血管内皮细胞凋亡的机械敏感通路在斑马鱼胚胎与哺乳动物系统之间存在部分保守性。因此，斑马鱼胚胎有望成为机械敏感通路功能筛选的实用模型。

结果

用于研究血流动力学调控内皮细胞凋亡的斑马鱼模型

我们希望了解血流是否调控斑马鱼胚胎血管系统中的内皮细胞凋亡。我们通过以下方式对此进行了研究，操控通常在受精后约24小时（hpf）由心脏收缩启动的血流。为研究胚胎中的血流动力学反应，通过两种方式阻断血流：一是使用靶向心肌肌钙蛋白T2的沉默心脏（sih）反义吗啉代寡核苷酸（MO），可导致心脏无法跳动；二是用麻醉剂三卡因处理胚胎以终止心脏收缩。值得注意的是，由于扩散能提供充足的氧气和营养，无血流的胚胎最多可存活5天。与此一致的是，我们利用缺氧报告基因系phd3:GFP观察到，发育过程中sih胚胎未出现缺氧反应（见在线补充数据中的图I），且无血流的斑马鱼胚胎不会上调缺氧相关基因。

通过活性半胱天冬酶-3免疫组织化学法（图1A至1C）或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测法（在线补充资料图II），对转基因flk1:EGFP-NLS胚胎（绿色荧光蛋白阳性的内皮细胞核）中的内皮细胞凋亡进行了评估。在缺乏血流的胚胎中，于受精后30至32小时，主动脉和尾静脉丛的内皮细胞凋亡增加（图1A至1D；在线补充资料图II），而内皮细胞总数与对照组相当（图1E）。在受精后48小时，无血流胚胎的细胞凋亡几乎完全缓解，但此时内皮细胞数量减少，尾静脉形态较对照组更简单（在线补充资料图III）。我们得出结论，血流抑制会触发内皮细胞凋亡的短暂波动，伴随内皮细胞丢失和血管重塑改变。相反，在斑马鱼发育过程中，血流促进内皮细胞存活。

图1. 血流停止诱导斑马鱼胚胎内皮细胞（EC）凋亡。A，在有（对照组）或无血流（sih 吗啉代寡核苷酸[MO]、三卡因）条件下，受精后30小时（hpf）的 flk1:EGFP-NLS 斑马鱼胚胎的整体活性半胱天冬酶-3（红色）染色（绿色为内皮细胞核）。白色方框勾勒出的区域在B中以高倍镜展示；白色箭头指示凋亡的内皮细胞（黄色）。C，30 hpf 的斑马鱼胚胎。蓝色方框勾勒出的区域为A的研究区域。定量分析了注射 sih MO 和经三卡因处理的胚胎与对照组相比的内皮细胞凋亡百分比（D）和内皮细胞数量（E），结果以均值±标准差（SD）表示；来自3次独立实验，n≥15，* (**P<0.01) 采用单因素方差分析（1-way ANOVA）。A-C为侧视图，左侧为前方，上方为背侧。比例尺：A为50微米，B为15微米，C为500微米。

通过猪主动脉转录组分析鉴定凋亡的潜在剪切响应调控因子

鉴于在静态条件下暴露的斑马鱼胚胎血管中观察到内皮细胞凋亡增强（图1），以及在低壁面切应力暴露的成年哺乳动物动脉中也出现这一现象， 我们推测斑马鱼胚胎可用于筛选调控成年动脉凋亡的机械敏感基因。为验证这一假设，我们通过对猪主动脉低、高壁面切应力区域内皮细胞进行转录组分析，构建了一组凋亡候选调控因子。选用6月龄健康猪，旨在识别出使低壁面切应力位点易患疾病的基因。尽管猪已被广泛用于局灶性动脉粥样硬化形成研究，但此前尚未明确猪主动脉的壁面切应力分布。因此，我们采用磁共振成像和计算流体动力学建模，对猪主动脉弓的血流及壁面切应力特征进行表征（图2；在线补充资料中的图IV和图V）。稳态模拟显示，速度分布偏向外壁并朝前壁旋转，使得外壁壁面切应力高于内壁（图2；在线补充资料中的图IV）。我们采用单一几何模型，在多个心动周期中进行非稳态模拟，并在第四个周期达到周期性稳定（在线补充资料中的图V）。我们在主动脉弓的多个位置、四个代表性节点处计算了速度分布心动周期的时间点（见仅在线提供的数据补充材料中的图V）。弓部的曲率导致了速度分布的旋转，这在减速期和舒张期清晰可见。在收缩峰值时，分支的存在使流入的高速血流发生反射，该血流朝向弓部内壁。同样值得注意的是，如以往人体研究中所观察到的，逆行血流（见仅在线提供的数据补充材料中的图VB，箭头）从收缩晚期开始出现，并在舒张峰值时达到最大值27,28。时间平均壁面切应力（WSS）与稳态模拟结果相似，弓部内侧曲率处的壁面切应力幅值较低且振荡切变指数较高（见仅在线提供的数据补充材料中的图V）。

心动周期的时间点（见仅在线提供的数据补充材料中的图V）。弓部的曲率导致了速度分布的旋转，这在减速期和舒张期清晰可见。在收缩峰值时，分支的存在使流入的高速血流发生反射，该血流朝向弓部内壁。同样值得注意的是，如以往人体研究中所观察到的，逆行血流（见仅在线提供的数据补充材料中的图VB，箭头）从收缩晚期开始出现，并在舒张峰值时达到最大值。时间平均壁面切应力（WSS）与稳态模拟结果相似，弓部内侧曲率处的壁面切应力幅值较低且振荡切变指数较高（见仅在线提供的数据补充材料中的图V）。

基于我们的计算流体动力学模型，使用胶原酶从猪主动脉的高、低时间平均壁面切应力区域分离内皮细胞（图2D），随后提取RNA。RNA样本的完整性已得到验证（详见仅在线发布的数据补充材料中的图VI），定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示，CD31（内皮细胞标志物）呈高表达，而平滑肌细胞或巨噬细胞（CD14）标志物的表达量极低（详见仅在线发布的数据补充材料中的图VI）。将RNA样本进行标记后，与Affymetrix公司的猪基因芯片（GeneChip Porcine Genome Arrays）进行杂交，结果发现867个基因对剪切力有响应（详见仅在线发布的数据补充材料中的表I）。功能注释分析显示，其中494个基因具有已知或推定的功能，而在细胞凋亡调控中具有推定或已知作用的分子呈现出最高的富集度（详见仅在线发布的数据补充材料中的表II）。利用热图可视化了高和低壁面切应力（WSS）位点处推定凋亡调控因子的表达情况（图3A），我们选取了20个差异表达程度最高的基因进行进一步分析。在这些基因中，我们通过qRT-PCR在另一组独立的猪样本中验证了其中14个基因的差异表达（图3B），而差异表达的有6个基因的表达结果不一致。因此，我们选取了14个经验证存在差异表达的基因作为斑马鱼凋亡的候选调控因子，用于功能筛选。

图 2 稳态流体动力学。本研究利用磁共振（MR）成像与计算流体力学分析猪主动脉的稳态流体动力学。实验共检测 5 头猪，本图展示其中 1 例代表性结果。 A：基于磁共振影像重建主动脉弓表面，经低通滤波器平滑处理，并在各出口设置圆柱形流动延伸段。 B：选取 6 个典型截面，呈现三维速度等值线。 C：计算得到时间平均壁面剪切应力（WSS）分布图，并映射到主动脉几何模型上；红色代表高壁面剪切应力，蓝色代表低壁面剪切应力。 D：对主动脉外壁做虚拟切割，将时间平均壁面剪切应力分布图展开；左侧为二维壁面剪切应力分布图，内皮面朝上。沿主动脉外曲率剪开血管以暴露管腔，对照剪切应力分布图定位高、低壁面剪切应力区域（方框标记）。 

图3、猪主动脉的转录组分析。使用微阵列在猪主动脉的低和高壁切应力（WSS）区域研究内皮细胞（EC）转录组。研究了五头猪。沿外曲率切割主动脉以暴露管腔，并从低和高WSS区域分离出ECs。A、具有已知或推定凋亡作用的基因被呈现为代表低和高WSS位点表达模式的热图。红色表示基因表达富集，而绿色表示抑制。B、通过定量逆转录酶-PCR（qRT-PCR）验证微阵列数据。选择20个最差异调节的凋亡基因用于独立队列猪的验证。转录水平通过使用基因特异性引物的qRT-PCR进行定量。平均值用SD显示；(n=5)，(*P<0.05)(^{*} P<0.01)，(****P<0.001)使用不成对的2尾测试。

斑马鱼凋亡调控因子的功能筛选

我们进一步根据斑马鱼中存在1至2个直向同源物来筛选用于功能筛选的基因。在14个候选凋亡调节因子中，有2个基因（CCL2和CSF2）被排除，因为它们在斑马鱼中没有直向同源物。相比之下，LGALS1有3个斑马鱼直向同源物（见在线补充数据中的表III），由于这3个旁系同源物之间可能存在冗余，会给功能分析带来困难，因此该基因被排除在进一步分析之外。候选基因CD74有2个斑马鱼直向同源物cd74a和cd74b，这两个同源物均被纳入功能筛选研究。最终，共筛选出12个斑马鱼基因用于功能验证（见在线补充数据中的表III）。为检测候选基因是否在斑马鱼内皮细胞中表达，我们通过荧光激活细胞分选技术从26小时受精阶段（hpf）的flk1:EGFP-NLS胚胎中分离出内皮细胞（EC）（见在线补充数据中的图VII）。该通过内皮细胞标志物钙粘蛋白5（血管内皮钙粘蛋白）的高表达，证实了纯化的绿色荧光蛋白阳性细胞的血管身份；而分选得到的绿色荧光蛋白阴性细胞则作为对照（仅在线数据补充材料图VIIB，上图）。我们检测到所有12个候选基因均在内皮细胞中表达，其中部分基因表达量尤其丰富（即血管生成素样蛋白4、PERP凋亡相关蛋白、TNIP1互作蛋白1；仅在线数据补充材料图VIIB，中图和下图）。

本研究使用反义吗啉代寡核苷酸（MOs）瞬时敲低候选基因的表达，以评估其在斑马鱼胚胎中的功能。研究人员首先进行剂量反应实验，以确定每种MO用于基因敲低的最佳剂量，并评估其对胚胎发育的总体影响。3个基因（fadd、igf1和tnfsf10）的敲低即使在相对较低的MO剂量下也导致了胚胎异常（图4K、4M和4W）。由于难以区分这些胚胎中基因敲低的直接和间接效应，fadd、igf1和tnfsf10被排除在进一步分析之外。对于其余9个基因，敲低胚胎的形态正常，与对照组胚胎相当（图4）。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了剪接阻断型MOs的效率（见在线补充资料图VIII）。选择性剪接MO注射样品中的转录本在RT-PCR产物的凝胶电泳后观察到带移（仅在线数据补充中的图VIII），这些转录本通过测序确认包含导致过早终止密码子的移码。对于angptl4、fadd、perp和tnip1，在MO注射样品中观察到野生型转录本水平降低，因此使用qRTPCR来评估击倒的效率（仅在线数据补充中的图VIII）。

在使用MOs敲除特定基因后，通过在存在（对照MO）或没有流动（图5）的情况下染色活性caspase-3来评估胚胎中的EC凋亡。5个基因（cd74a、cd74b、Jun、ptgis和tnip1）的敲除在存在或没有血流的情况下都没有修改EC凋亡（图5）或EC编号（仅在线数据补充中的图IXB、IXC、IXE、IXH和IXI）。

cdh13的敲除导致在没有流动的情况下EC细胞凋亡增加，而在有流体存在的情况下，ANGPTL4 的耗竭会增加细胞凋亡（图 5；仅在线发布的数据补充材料中的图 IXA）。这些数据表明尽管CDH13和ANGPTL4发挥抗凋亡作用，但它们在不同的机械条件下发挥功能。相比之下，在无流动状态下，PERP或PDCD2L的缺失导致内皮细胞凋亡显著降低(>30%)（>30%）（图5；仅在线数据补充材料中的图IXF和IXG），表明这些基因具有促凋亡作用。

为验证观察到的表型，我们针对每个基因使用了另一种不重叠的吗啉代寡核苷酸（称为MO2；详见仅在线发布的数据补充材料中的图XA）。通过RT-PCR（针对angptl4、cdh13和pdcd2l；详见仅在线发布的数据补充材料中的图XB）、qRT-PCR（针对angptl4；详见仅在线发布的数据补充材料图XC）或表型分析（针对perp；详见仅在线发布的数据补充材料图XD），证实了MO2介导的敲低效率。注射第二种不重叠的angptl4 MO2，会使有血流存在时内皮细胞的凋亡率增加2.8倍（图6A）；而注射cdh13 MO2，则会使无血流存在时内皮细胞的凋亡率出现(≈50 %)的升高（图6B）。相反，注射pdcd2l MO2或perp MO2，会使无血流存在时内皮细胞的凋亡率降低约40%（图6C和6D）。由此可见，对于所研究的这4个基因，第二种MO均重现了初始MO的作用效果。综上，这些结果表明cdh13和angptl4在内皮细胞中发挥保护作用，而perp和pdcd2l则在静态条件下促进内皮细胞的凋亡。

图4. 吗啉代寡核苷酸（MO）注射胚胎的形态。A-Z：斑马鱼胚胎注射了3纳克（左侧）或6纳克（右侧）的基因特异性或非靶向对照吗啉代寡核苷酸（左侧标注）。在胚胎发育过程中观察其形态，图中展示的是受精后30小时的状态。侧视图，前方朝左，背部朝上。比例尺：500微米。

图5. 斑马鱼潜在凋亡调控因子的功能筛选。A，向斑马鱼胚胎（flk1:EGFP-NLS 胚胎；绿色内皮细胞[EC]细胞核）中注射靶向候选基因的吗啉代寡核苷酸（MOs）或非靶向对照MO（每行左侧标注）。通过整体活性染色，在有流动（对照MO）或无流动（sih MO）的条件下研究内皮细胞凋亡caspase-3 染色（红色）。在受精后30小时（hpf）监测凋亡内皮细胞（黄色）。侧视图，左侧为前方，上方为背侧。比例尺：50微米。B，计算相对于sih吗啉代寡核苷酸注射胚胎的凋亡内皮细胞比例（凋亡内皮细胞数量除以内皮细胞总数），并以均值±标准误（SEM）展示。3次独立实验，n≥15。(*P<0.05)、(**P<0.01)、(****P<0.001) 采用单因素方差分析（1-way ANOVA）。 

体内机制研究

为阐明血流动力学力驱动内皮细胞（EC）凋亡的机制，我们聚焦于筛选中发现的该过程的2个正向调节因子perp和pdcd2l。为确定它们促进内皮细胞凋亡的机制，我们回到猪模型，利用Ingenuity通路分析，通过内皮细胞转录组谱分析鉴定凋亡调节因子之间的相互关系。该评估显示p53是潜在的核心调节因子（见在线补充数据中的图XI）。因此，我们检测了p53通路是否参与斑马鱼胚胎中血流调节的内皮细胞凋亡。在无血流的情况下，敲低p53导致内皮细胞凋亡率降低，这与敲低perp或pdcd2l的效果相当（图6E；对比3、4、5）。为解析p53、perp和pdcd2l之间潜在的串扰，我们进行了联合敲低实验。perp与pdcd2l、p53与perp、或p53与pdcd2l的联合敲低所产生的凋亡率与单个基因敲低相似（图6E；对比6-8与3-5），这表明这些分子属于同一信号通路。

通过注射图6来验证表型：敲低表型的验证以及促凋亡调节因子的机制研究。使用第二种不重叠的吗啉代寡核苷酸（称为MO2）或非靶向对照吗啉代寡核苷酸，对血管生成素样蛋白4（A）、钙粘蛋白13（斑马鱼胚胎（flk1:EGFP-NLS））进行处理。E部分，通过使用靶向perp、pdcd2l和p53的吗啉代寡核苷酸，分别单独注射（第3-5列）、双重敲低（第6-8列），或使用非靶向对照吗啉代寡核苷酸处理斑马鱼胚胎（flk1:EGFP-NLS胚胎），研究了perp、pdcd2l和p53之间潜在的串扰。A-E部分，在30小时胚胎期（hpf）通过全胚活性半胱天冬酶-3染色，研究了在有血流（对照吗啉代寡核苷酸）或无血流（sih吗啉代寡核苷酸）情况下的内皮细胞（EC）凋亡。计算了以sih吗啉代寡核苷酸注射的胚胎为基准归一化的凋亡内皮细胞比例（凋亡内皮细胞数量除以内皮细胞总数），并以均值±标准误（SEM）展示。3次独立实验中，每组样本量n≥15。ns表示无显著差异。通过单因素方差分析（1-way ANOVA）分析了(*P<0.05)、(****P<0.001)相关数据。（B）为pdcd2l（C）和perp（D）的敲低实验 

哺乳动物内皮细胞中的表达与功能研究

由于筛选模型可能产生假阳性结果，我们尝试通过体外培养的内皮细胞暴露于流体环境来验证CDH13、PERP、ANGPTL4、PDCD2L的表达与功能，同时在有合适抗体的情况下，利用小鼠对主动脉进行正面染色分析。

钙粘蛋白13

使用抗 Cdh13 抗体对小鼠主动脉进行正面染色发现，Cdh13 在高剪切力区域（外弯曲处）的表达水平高于低剪切力区域剪切（内曲率）区域（图7）。Cdh13池的主要部分定位于质膜（图7B），表明其在暴露于高剪切力的内皮细胞中以活性形式表达。相比之下，对照IgG未从鼠动脉中检测到信号（仅在线数据补充材料中的图XII）。此外，我们使用两种互补的流动系统，比较了暴露于模拟体内情况（高均匀壁面剪切应力和低振荡壁面剪切应力）流动模式的猪主动脉内皮细胞中的基因表达，一台轨道摇床和一套 ibidi 泵系统。在轨道振荡平台中，研究人员使用6孔组织培养板对细胞施加流体流动，通过振荡培养板在孔的边缘产生高单向剪切应力，而在孔中心则形成剪切力较低且方向变化更大的环境。 相反，ibidi 泵系统的操作方式是将细胞接种在专用μ载玻片上，通过计算机控制的注射泵产生特定流速和频率的流动，以此生成壁面剪切应力（WSS）。CDH13 基因表达使用 ibidi 系统在高剪切力作用下的内皮细胞中，该指标得到了增强，但在暴露于轨道流的细胞中则未出现此情况（仅在线数据补充材料中的图十三），这可能反映了这两种系统产生的机械条件存在差异。

我们接下来想探究 CDH13 是否会影响流体培养下内皮细胞的凋亡情况。体外实验中，暴露于低振荡剪切应力的内皮细胞，其活性半胱天冬酶-3染色（图8）和TUNEL检测（仅在线补充数据中的图XIV）结果均显示内皮细胞凋亡水平升高。值得注意的是，利用小干扰RNA对培养的人脐静脉内皮细胞进行基因沉默实验发现，敲低CDH13（经实时荧光定量PCR验证；仅在线补充数据中的图XV）会使暴露于高或低剪切应力的内皮细胞凋亡率显著升高（图8）。有趣的是，尽管斑马鱼体内的CDH13敲低会在血流停止条件下促进细胞凋亡，但这一操作并未影响暴露于流体中的内皮细胞，这可能是因为发育中的斑马鱼体内存在补偿机制来保护受剪切应力作用的内皮细胞。尽管如此，体外实验数据与通过研究斑马鱼胚胎获得的结果基本一致，均表明CDH13在内皮细胞中发挥抗凋亡作用。

图7中Cdh13在内皮细胞（ECs）中的表达情况通过小鼠主动脉的正面染色进行评估。A，Cdh13的表达水平在C57BL/6小鼠主动脉弓的高剪切应力区域富集。B、C为更高放大倍数下的图像；白色方框勾勒出的区域通过To-Pro-3（DNA，蓝色）进行鉴定。内皮细胞（ECs）通过与偶联Alexa Fluor 489（绿色）的抗CD31抗体共染色来识别（红色）。图表显示了Cdh13表达的定量分析结果（平均荧光强度，附带标准误）。数据汇总自5次独立实验。*表示通过未配对双尾t检验检测到显著差异。低振荡壁面切应力（WSS；内曲率）或高壁面切应力（外曲率）区域的Cdh13表达情况。

图8. CDH13保护暴露于血流的培养内皮细胞（ECs）免于凋亡。A和B部分：将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）转染乱序序列、CDH13小干扰RNA（siRNA）或不进行转染，孵育24小时。使用轨道系统将细胞暴露于低振荡性（中心）或高均匀性（外周）壁面切应力（WSS）72小时。通过免疫荧光染色检测凋亡细胞，使用识别裂解半胱天冬酶-3的抗体（绿色），并用To-Pro-3对细胞核进行复染（紫色；DNA）。凋亡的内皮细胞以白色箭头标记。汇总至少3次独立实验的数据，凋亡细胞比例以均值±标准误（SEM）表示（B部分：通过双因素方差分析（2-way ANOVA）得到(** P<0.01)、(**P<0.001)结果）。 

p53 相关蛋白

小鼠主动脉的正面染色显示，与高剪切力区域（外曲率）相比，Perp 在低剪切力区域（内曲率）的表达水平更高（图9）。Perp 主要定位于质膜，这与其在其他组织中的定位一致（图9B）。 同样，无论是使用 ibidi 平行板系统还是轨道平台，与暴露于高剪切力的细胞相比，暴露于低剪切力的培养猪主动脉内皮细胞中 PERP 的表达均升高（见仅在线提供的数据补充材料中的图XIII）。敲低 PERP（经实时荧光定量PCR验证；图XV（详见仅在线发布的补充数据）显著减少了内皮细胞的凋亡（图10）。这些数据与在斑马鱼胚胎中进行基因筛选获得的结果一致，表明PERP在低剪切应力条件下表达，且在体外和体内系统中均能促进内皮细胞凋亡。

图10：PERP 促进暴露于低壁面切应力（WSS）的培养内皮细胞（EC）的凋亡。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）转染乱序序列、PERP 小干扰RNA（siRNA）或不进行转染，孵育24小时。通过轨道系统使细胞暴露于低振荡壁面切应力（中心）或高均匀壁面切应力（外围）72小时。使用可检测裂解半胱天冬酶-3（绿色）的抗体通过免疫荧光染色测定凋亡细胞，并用 To-Pro-3（紫色；DNA）对细胞核进行复染。凋亡的内皮细胞以白色箭头标注。汇总至少3次独立实验的数据，凋亡细胞比例以均值±标准误（SEM）表示。(*P<0.05)，采用双因素方差分析（2-way ANOVA）分析。

血管生成素样蛋白4与程序性细胞死亡2样蛋白

对培养的猪主动脉内皮细胞的研究显示，使用轨道系统时，暴露于低剪切应力的细胞中ANGPTL4和PDCD2L的表达水平高于高剪切应力组（见仅在线提供的数据补充材料中的图XIII），这与它们在动脉低剪切应力区域的富集情况一致（图3）。然而，使用ibidi平台时，ANGPTL4并未在低剪切应力下富集，这可能反映了轨道系统和平行板系统产生的机械环境存在差异。通过小干扰RNA沉默ANGPTL4或PDCD2L（经实时荧光定量PCR验证；见仅在线提供的数据补充材料中的图XV），并未影响暴露于高或低壁面剪切应力的培养内皮细胞的凋亡（见仅在线提供的数据补充材料中的图XVI）。因此，尽管这两种分子均能调控斑马鱼胚胎内皮细胞在流体作用下的凋亡，但它们并不影响培养的哺乳动物内皮细胞的活力，这可能反映了所研究的发育阶段、机械环境或物种之间存在差异。

综合来看，我们对小鼠动脉以及暴露于不同剪切应力的培养内皮细胞的研究，证实了利用斑马鱼胚胎得出的观察结果，即 PERP 和 CDH13 可作为内皮细胞凋亡的剪切反应性调节因子。相比之下，在斑马鱼胚胎中观察到的 ANGPTL4 和 PDCD2L 对内皮细胞凋亡的影响，在体外实验中并未得到重现。该研究证明了我们的斑马鱼平台在剪切反应性功能筛选方面的实用性基因，同时也强调了部分基因在体内和体外系统中潜在的不同功能。

讨论

壁面剪切应力对内皮细胞生理特性和动脉粥样硬化影响的分子机制尚未完全阐明，但已知其涉及转录变化。尽管在体外或体内条件下对暴露于不同流体参数的内皮细胞进行转录组分析，已鉴定出多个机械响应基因，但其中大多数尚未在功能水平上开展研究。为应对这一挑战，我们建立了一个斑马鱼平台，用于对流体响应基因进行功能筛选。据我们所知，这是首个用于筛选机械敏感基因的体内系统。

我们所使用的斑马鱼胚胎模型在多个重要方面与哺乳动物动脉对血流的血管反应存在差异，包括物种、尺度和血流动力学特征。然而，一方面，斑马鱼中处于静态环境下的内皮细胞，与另一方面哺乳动物中暴露于紊乱血流和低振荡壁面切应力（WSS）环境下的内皮细胞，二者之间存在诸多相似之处。例如，抗动脉粥样硬化转录因子 KLF2/klf2a 在胚胎的静态环境下以及成年脊椎动物的低壁面切应力环境下均会被抑制³³。此外，内皮细胞纤毛主要出现在哺乳动物动脉的低壁面切应力区域以及斑马鱼胚胎的静态环境中，且在这两种系统中，内皮细胞纤毛均会在暴露于层流切应力时发生解聚。最后，近期一项研究发现，处于低切应力或静态环境下的内皮细胞，其转录组存在大量重叠。基于这些研究发现，我们提出假设：对发育中的斑马鱼血管内的基因进行调控，或许能为揭示调控哺乳动物动脉生理的通路提供线索。与这一观点相符的是，本研究发现血流对内皮细胞凋亡的调控机制，至少在胚胎和成年动脉之间存在部分保守性。

我们通过聚焦受血流调控的凋亡调控因子，评估了斑马鱼模型识别控制内皮细胞（EC）功能的机械敏感基因的能力。为了获得一组推定的血流敏感性凋亡基因，我们对猪主动脉的高剪切应力和低剪切应力区域进行了微array转录组分析。功能注释显示，凋亡调控因子是富集程度最高的基因群，这与多基因在血流扰动区域调控内皮细胞凋亡的假说一致。我们的研究基于Peter Davies团队的开创性研究，该团队发现猪主动脉内侧曲率处促炎分子和应激反应分子高度富集。值得注意的是，我们的研究发现了多个此前未被鉴定为差异表达的壁面剪切应力（WSS）相关基因。这种差异可能与技术差异有关，因为本研究中使用的商业猪基因芯片比此前使用的定制芯片多包含了>10000个基因，且对本研究数据的分析得益于猪基因组的测序和注释（http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index）。更根本的是，Davies团队研究的解剖部位与本研究的解剖部位仅存在部分重叠。例如，我们将主动脉弓外侧曲率作为暴露于抗动脉粥样硬化血流的内皮细胞来源，而此前的研究则聚焦于胸降主动脉、颈动脉和肾动脉。需要指出的是，尽管在本研究和此前的猪动脉研究中，仅发现部分基因持续差异表达，但大多数基因表现出相似的表达模式。低剪切区和高剪切区中表达的变化（详见仅在线发布的补充资料表IV）。将本研究与揭示小鼠颈动脉内壁面切应力（WSS）与内皮细胞（EC）转录组之间存在因果关系的精妙实验进行对比也颇具意义。在该研究中，研究人员先通过部分结扎改变小鼠左颈动脉的壁面切应力，随后检测内皮细胞的基因表达情况。这一方法证实壁面切应力可调控小鼠内皮细胞中的多种基因，包括与炎症和免疫相关的基因。值得注意的是，尽管本研究在猪主动脉中鉴定出的部分基因在小鼠颈动脉中同样受壁面切应力调控，但不同模型中壁面切应力与基因的关联关系并不保守（详见仅在线发布的补充资料表IV）。多种重要的生物学差异或许能解释这一差异，包括血管床的不同、流体动力学特征的差异、物种差异以及内皮细胞暴露于紊乱流场的时间长短不同。我们还将微阵列数据与通过荟萃分析已发表的体外人脐静脉内皮细胞微阵列研究获得的>1600剪切反应性基因列表进行了对比（详见仅在线发布的补充资料表V）。我们发现，在这两组数据中被证实受机械力调控的基因里，仅有不到50%的基因与壁面切应力呈现相同的关联关系。这一发现进一步表明，内皮细胞对体外和体内系统中存在差异的生理及机械刺激具有高度敏感性。

在完成我们的内皮细胞转录组分析后，我们挑选了差异表达最显著的潜在凋亡调控因子，用于斑马鱼的功能筛选。人类与斑马鱼参考基因组的对比显示，约70%的人类基因至少有1个明确的斑马鱼直向同源物。因此，并非所有人类基因都能在斑马鱼中进行研究，CCL2和CSF2基因便属于这种情况。此外，由于在进化早期发生了一次全基因组复制事件辐鳍鱼类中，许多人类基因在斑马鱼基因组中存在超过1个直向同源物。由于斑马鱼旁系同源物之间的功能冗余在研究斑马鱼生理过程时可能构成挑战，我们在研究中排除了直向同源物数量超过2个的基因。研究斑马鱼基因功能的方法包括吗啉代寡核苷酸（MOs）介导的瞬时敲低，以及靶向基因敲除和突变体构建。对于大量基因的功能筛选，构建突变体成本高、耗时长且工作量大（斑马鱼与小鼠的世代时间相近）。因此，我们采用吗啉代寡核苷酸（MOs）进行功能筛选。使用吗啉代寡核苷酸（MOs）的一个缺点是缺乏时空特异性，因为它们需在1细胞期注入胚胎，会导致所有胚胎细胞中的基因表达均降低。正因如此，早期胚胎发育相关的基因无法通过该模型进行研究。本研究中的3个基因（fadd、igf1和tnfsf10）就属于这种情况，其敲低会导致明显的形态学缺陷。不过，在胚胎形态正常的75%基因敲低实验中，我们仍能研究血管对血流的反应。总体而言，在研究的12个基因中，我们发现了2个抗凋亡分子（angptl4和cdh13）和2个促凋亡分子（pdcd2l和perp），它们在主动脉机械特性不同的区域富集。为验证吗啉代寡核苷酸（MOs）介导敲低表型的特异性，我们针对每个目标基因使用了两种独立且无重叠的吗啉代寡核苷酸（MOs）。

为了验证我们在斑马鱼胚胎功能筛选中的观察结果，我们使用暴露于流体的培养内皮细胞进行了一系列实验。首先，为了探究其差异表达的机制，我们检测了CDH13、PERP、PDCD2L和ANGPTL4在培养的内皮细胞中是否对壁面切应力（WSS）产生响应。我们采用了两种互补的实验平台，分别是轨道振荡器和ibidi泵系统。在轨道振荡器系统中，培养孔中心的细胞会受到壁面切应力（WSS）的作用，其强度随恒定的低平均壁面切应力大小和快速的方向变化，而在井的外围区域，壁面切应力大小相对较高且流向相对均匀。这与使用注射泵产生高均匀性、低振荡性（1赫兹双向）壁面切应力的ibidi平行板系统形成对比。在两种体外系统中，暴露于低壁面切应力条件的内皮细胞中，PERP和PDCD2L这两个基因的表达水平均更高，这表明它们在体内的局域表达由局部血流动力学维持。另一方面，CDH13的表达仅在ibidi系统中因高壁面切应力而富集，而ANGPTL4在低壁面切应力下的上调仅在轨道系统中观察到。这些观察结果可能反映了轨道系统与ibidi系统机械环境的差异，例如轨道平台独有的二次流存在，同时也强调了使用多种实验模型研究机械敏感基因功能的重要性。其次，我们评估了在暴露于流体的培养内皮细胞中沉默目标基因的影响。

本研究证实，PERP是低壁面切应力条件下内皮细胞凋亡的正向调节因子，而CDH13具有保护作用。值得注意的是，尽管 CDH13 可降低暴露于低或高壁面切应力（WSS）的培养内皮细胞（EC）的凋亡率，但其在斑马鱼胚胎中的保护作用仅在处于静态环境中的内皮细胞中被观察到。这种差异可能源于胚胎中存在的代偿机制，而在受血流影响的成年血管中则不存在。因此，需开展进一步研究（包括在小鼠中特异性敲除 Cdh13 基因），以明确 CDH13 是否在成年哺乳动物动脉的低、高壁面切应力条件下发挥保护作用。本研究还发现，尽管 angptl4 和 pdcd2l 可调控斑马鱼内皮细胞的凋亡，但它们对暴露于低或高壁面切应力的培养人内皮细胞的活性无影响。因此，这些分子可能特异性调控发育过程中内皮细胞的凋亡，或其功能发挥依赖于体内存在的解剖学或生理学特征（而非培养细胞），也可能存在物种间的差异。需进一步研究以明确上述可能性。本研究首次证实 perp、cdh13、angptl4 和 pdcd2l 参与凋亡的血流动力学调控，而此前已有研究表明这些分子在其他系统中与凋亡相关。PERP 最初通过对小鼠胚胎成纤维细胞进行减法克隆被鉴定为 p53 靶基因，且研究显示其仅在凋亡细胞中表达。有趣的是，PERP 可反馈作用于 p53 以增强其活性，这与我们观察到的 PERP 与 p53 协同促进内皮细胞凋亡的结果一致。我们的研究结果也与既往研究相呼应，这些研究揭示 p53 的翻译后修饰参与紊乱血流介导的内皮细胞凋亡，并促进动脉粥样硬化斑块的形成。已有研究表明 CDH13 可保护内皮细胞免受氧化应激诱导的凋亡，而 ANGPTL4 在内皮细胞中发挥存活因子的作用。最后，尽管对 PDCD2L 的功能知之甚少，但其同源物 PDCD2 可在多种人类及哺乳动物细胞系和组织中促进凋亡。

尽管斑马鱼胚胎重现了成年动脉中受血流调控的部分通路，但该模型也存在局限性。一个显著的例子是缺氧诱导因子1α通路，该通路在猪主动脉的内侧曲率处富集（图3），但在静态条件下的斑马鱼胚胎中并未被激活（仅在线数据补充材料中的图I）。这种差异可能归因于这两种系统在氧气运输和炎症反应方面的不同。在猪主动脉中，向腔面内皮细胞的氧气供应依赖于红细胞通过血管腔的运输。计算建模和实验测量表明，这一过程会受到次生流的影响，次生流会将氧气从血管壁带走，从而形成氧含量降低的区域。相比之下，斑马鱼胚胎（至72小时胚胎期）的氧气供应不依赖血液循环，因为其体型较小，单纯的扩散作用就足以满足氧气需求。因此，尽管主动脉中血流紊乱区域的氧张力可能较低，会导致缺氧诱导因子1α的激活增强，但斑马鱼中该通路并不会因血流停止而被激活，因为扩散作用会阻止缺氧环境的形成。此外，缺氧诱导因子1α也可由炎症反应诱导产生信号通路已知在主动脉弓内曲率处组成性激活，但在斑马鱼胚胎对血流的反应中其作用尚不明确。因此，我们得出结论，尽管斑马鱼胚胎是评估血管对壁切应力（WSS）反应的有用体内模型，但仍需借助其他系统来研究氧转运改变对血管系统的影响。

总之，我们建立了一个基于斑马鱼的血流敏感基因功能筛选模型，并利用该系统鉴定出了内皮细胞在血流紊乱刺激下凋亡的新型调控因子。本研究为解释动脉内皮细胞损伤和功能障碍的局灶性分布提供了新的机制，表明这一过程涉及动脉易损区域由p53-PERP介导的内皮细胞凋亡，以及动脉保护区域由CDH13介导的内皮细胞存活。

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