Hsin-Hung Lin、Ming-Wei Kuo、Tan-Chi Fan、Alice L. Yu、John Yu

中央研究院化学生物学与分子生物物理学学程 · 林口长庚纪念医院干细胞与转译癌症研究中心 · 加州大学圣迭戈分校 · 中央研究院细胞与器官生物学研究所

Biological Research (2023) 56:7　doi:10.1186/s40659-023-00415-8　|　开放获取（CC BY 4.0）

摘要

血管形成的关键一步是动脉与静脉的分化。这篇论文发现，YULINK 这个蛋白专门管静脉一侧：把它敲掉后，斑马鱼胚胎的后部主静脉（PCV）直接消失，只剩动脉。进一步实验显示，YULINK 与三个内体相关蛋白（EPS15、RAB33B、TICAM2）结合定位到内体上，并参与 VEGF/VEGFR2 的内化与运输；用内吞抑制剂氯丙嗪处理，斑马鱼同样出现静脉发育缺陷——「YULINK 缺失」与「内吞被抑制」表型高度一致，指向内吞作用是静脉形成的关键环节。

核心要点

1. 斑马鱼表型（强证据）：用吗啡啉（MO）敲低 YULINK 后，胚胎血流无法流到尾端、提前折返；躯干部后部主静脉 PCV 完全缺失，而背主动脉 DA 正常；尾部则出现红细胞异常堆积与仅剩一条粗大尾静脉（正常应为 2–3 条）。

2. 分子标志物印证：efnb2a（动脉标志）在敲低胚胎中仍有表达，而静脉标志 dab2 在躯干部完全不表达——从分子层面确证「静脉身份」丢失。

3. 人源细胞验证：HUVEC 中敲低 YULINK 后，迁移能力下降约 33%、毛细血管样管腔形成节点数下降约 81.6%（总长度、分叉点、总分支长度分别下降约 42.8%、81.8%、71.7%）；静脉标志物 EPHB4 磷酸化水平下降，而总蛋白量不变——说明是信号通路被切断，而非表达量变化。

4. 三重互作证据链：酵母双杂交筛出 6 个候选；FLIM-FRET（YULINK–RAB33B 效率 E=8.1%，TICAM2 E=9.2%，EPS15 E=11.4%）、免疫共沉淀、超分辨显微镜共定位（Pearson r = 0.51/0.56/0.75）相互印证YULINK 与 EPS15、RAB33B、TICAM2 形成复合物。

5. 功能落点：内吞：YULINK 与内体标志物 Clathrin（r=0.60）、RHOB（r=0.73）高度共定位；过表达 EPS15 或 RAB33B可部分救援 YULINK 敲低的迁移缺陷。

6. 内吞抑制剂 phenocopy：氯丙嗪（60 nM）处理斑马鱼胚胎，同样导致 PCV 与尾静脉完全缺失；HUVEC 中呈剂量依赖性抑制管腔形成，100 nM 时毛细网络完全崩溃。「敲基因」与「加药物」两条独立路径得到同一结论。

一、引言：动静脉分化是血管发育的第一个岔路口

血管形成过程中，从混合的异质细胞群体中分离出动脉与静脉前体细胞，是建立动脉与静脉的重要前提。脊椎动物血管发育早期，动脉与静脉前体细胞会被协调地分选与分离，最终形成背主动脉与后部主静脉两套独立网络。斑马鱼胚胎中第一条轴向动脉与静脉的形成，因此为研究血管分化机制提供了优良系统。

斑马鱼胚胎发育早期，内皮前体开始表达内皮细胞特异基因并汇聚成位于背主动脉未来的单一血管索；随后，位于背主动脉原基的侧向内皮前体向腹侧芽出，形成第一条胚胎静脉。Notch 与 Erk 信号被激活的内皮前体注定走向背主动脉命运。但驱动这一命运决定的分子机制仍有待阐明——本研究聚焦的 YULINK，正是这样一类「动静脉分化开关」候选分子。

二、结果

1. 斑马鱼：敲低 YULINK 后静脉消失、动脉保留

为探究 YULINK 基因的生物学功能，我们用吗啡啉反义寡核苷酸（MO）敲低斑马鱼胚胎中 YULINK 的表达。动态成像显示：野生型 24 hpf 胚胎的血液从背主动脉（DA）流向尾端，再经后部主静脉（PCV）回流；而 YULINK 敲低胚胎中，血液无法流至尾端，提前折返进入 PCV；受影响更严重的个体甚至出现血流完全中断。

躯干部侧视与横切面显示：野生型胚胎 36 hpf 时 DA 与 PCV 均发育完全并有血流通过；而在受严重影响 YULINK 敲低胚胎中，仅能看到 DA，PCV 完全观察不到。尾部区域方面，野生型有 1 条尾动脉（CA）与 2–3 条尾静脉（CV）构成复杂的尾静脉血管丛；而 YULINK 敲低胚胎尾部 CA 正常，却出现红细胞异常堆积（红色）与一条异常粗大的单条尾静脉。

图 1　YULINK 敲低对斑马鱼胚胎血管的影响。A 双转基因斑马鱼 Tg(fli1:EGFP; gata1:DsRed)：由 fli1 启动子驱动的绿色荧光标记内皮细胞，gata1 启动子驱动的红色荧光标记红细胞。箭头指示胚胎肛门。黄色比例尺表示 200 μm。B 36 hpf 时躯干部与尾部血管的共聚焦图像，含侧视图与横切面视图。白色虚线标示横切面的取材位置。DA，背主动脉；PCV，后部主静脉；CA，尾动脉；CV，尾静脉。白色比例尺表示 50 μm。hpf，受精后小时数；GFP，绿色荧光蛋白；DsRed，红色荧光蛋白；MO，吗啡啉反义寡核苷酸；KD，敲低。

为从分子层面区分动静脉，我们采用整体原位杂交，用动脉标志 efnb2a 与静脉标志 dab2 区分斑马鱼的动脉与静脉血管网。结果显示：野生型与 YULINK 敲低胚胎均表达动脉内皮标志 efnb2a；但与 2 dpf 野生型胚胎相比，YULINK 敲低胚胎躯干部完全不表达静脉标志 dab2，提示该区域 PCV 未能正常发育。为进一步分析，我们又使用了另一对双转基因品系——Tg(fli1:EGFP)^y1（绿色标记全部内皮）与 Tg(flt1enh:RFP)（红色标记动脉内皮）——其杂交胚胎中动脉呈黄色（红+绿）、静脉呈绿色。野生型 2 dpf 胚胎中 DA 与动脉间充血管（aISV）呈黄色，PCV 与静脉间充血管（vISV）呈绿色；而敲低胚胎中只能观察到粗大的 DA 与纤细的 aISV（红或黄色），却完全看不到绿色的 PCV 与 vISV。这些结果共同表明：敲低 YULINK 导致静脉血管网丧失。

小结：这是「静脉特异性」而非「泛血管」表型

敲低 YULINK 后，动脉系统（DA、aISV、CA）完好保留，而静脉系统（PCV、vISV、尾静脉丛）特异性消失。这种干净的「一侧缺失」表型，强烈提示 YULINK 参与的是动静脉命运决定这一具体环节，而非泛泛影响血管生长。

2. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）：迁移与管腔形成受损

我们继而在人源 HUVEC 中检验 YULINK 的作用。HUVEC 分别转染 GFP（野生型）、空载体对照（CTRL）或 YULINK shRNA（shYULINK）质粒 1 天。Western blot 确认 shRNA 有效抑制 YULINK，敲低细胞中 YULINK 蛋白水平保留 37%；定量 PCR 亦确认 mRNA 水平保留 39%。

迁移能力用 CIM-Plate 16 与 xCELLigence DP 系统实时监测（测量细胞透过膜的阻抗变化）。结果显示，敲低 YULINK 使细胞迁移能力显著下降约 33.0%（9 h 时细胞指数，n = 3，*p < 0.05），而 WT、GFP 与 CTRL 之间无显著差异。管腔形成用 Matrigel 嵌入成管实验评估 16 h 的结果：敲低 YULINK 显著抑制毛细血管样管腔形成，节点数较对照下降约 81.6%；以总长度、连接点数与总分支长度衡量，网络形成分别显著下降约 42.8%、81.8% 与 71.7%。这些实验表明 YULINK 调控 HUVEC 的细胞迁移与分支状毛细血管样管腔网络形成。

图 2　YULINK 敲低对 HUVEC 毛细血管样管腔形成、迁移与 EPHB4 磷酸化水平的影响。HUVEC 分别转染含 GFP、载体对照（CTRL）或 YULINK shRNA（shYULINK）的质粒 1 天。A Western blot 分析转染 1 天后 YULINK shRNA 的敲低效率，使用抗 YULINK 抗体，以 GAPDH 为上样内参。YULINK 条带强度经定量后归一化至 GAPDH。敲低后蛋白水平保留 37%。B 用 CIM板与 xCELLigence DP 系统实时测量转染细胞的迁移，该系统检测细胞透过膜的阻抗变化。所有细胞按 1.6 × 10⁴ 细胞/孔接种并迁移 20 小时（左图）。9 小时后测定细胞迁移活性，以细胞指数表示（右图，mean ± SD，n = 3，*p < 0.05）。WT，野生型未处理细胞。C Matrigel 嵌入成管实验中测定的节点数（mean ± SD，n = 3，**p < 0.001）。敲低后节点数较对照下降约 81.6%。D 总细胞裂解液中静脉标志物 EPHB4 的表达用 Western blot 检测并作为内对照（左图）；EPHB4 磷酸化水平用 ELISA 检测（右图）。ELISA 光学密度（O.D.）在可见光波长 450 nm 处测定（mean ± SD，n = 6，**p < 0.001）。敲低后磷酸化 EPHB4 下降，而 EPHB4 总表达量不变。HUVEC，人脐静脉内皮细胞；shRNA，短发夹 RNA；ELISA，酶联免疫吸附测定；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

3. 静脉标志 EPHB4：表达没变，但磷酸化掉了

B4 ephrin 受体（EPHB4）已被鉴定为静脉标志物。为确定 YULINK 是否影响 EPHB4 信号，我们在 YULINK 敲低的 HUVEC 中检测了 EPHB4 的表达与磷酸化水平。结果发现：YULINK 敲低细胞中磷酸化的 EPHB4 较对照下降，而 EPHB4 的总表达水平与对照相同。这一区分很关键——它说明 YULINK 的作用位于信号转导层面（磷酸化修饰），而非影响 EPHB4 的蛋白量，进一步支持 YULINK 在血管生成（vasculogenesis）中的关键作用。

4. 酵母双杂交筛出六个候选互作蛋白

我们采用酵母双杂交筛选与 YULINK 互作的蛋白，酵母双杂交文库购自商业化人 cDNA 文库（其中已去除高拷贝数 cDNA 以利于发现新的蛋白—蛋白互作）。筛选后，挑取蓝色菌落进行 PCR 与测序，共获得6 个 YULINK 互作蛋白：EPS15、RAB33B、TICAM2、ANKRD44、DENND4C 与 LCA5L。其中我们选择 EPS15、RAB33B、TICAM2 做进一步表征，因为既往研究提示这三个蛋白参与内吞作用。

5. FLIM-FRET：在活细胞里量出「有多近」

为在活细胞中确认这些互作，我们把 YULINK 与 AcGFP 偶联（AcGFP-YULINK），候选互作蛋白与 DsRed 偶联，再在 HEK-293T 细胞中共表达，用多光子荧光寿命成像显微镜（FLIM）测量 AcGFP 的 FRET（Förster 共振能量转移）。能量从激发的供体（AcGFP）转移至受体（DsRed）时会降低供体荧光并升高受体荧光；能量转移只能在两蛋白极为接近（约 1–10 nm）时发生，故 FRET 效率（E）与互作蛋白间距离成正比。由于这种距离依赖性，测量供体荧光团的「平均荧光寿命（τ）」是 FRET 互作最定量的读出。

既往研究表明 YULINK 蛋白含4 个保守 WD40 重复与 3 个候选 WD40 重复；我们同时构建了 N 端截短型（YULINKΔN）与 C 端截短型（YULINKΔC）。结果显示：仅表达 AcGFP-YULINK 的细胞 τ 约 2.71 ns（与单独 AcGFP 相近，作 FLIM-FRET 对照）；共表达 AcGFP-YULINK 与 DsRed-EPS15 后 τ 变为 2.40 ns（E = 11.4%）；与 DsRed-RAB33B 或 DsRed-TICAM2 共表达则分别变为 2.49 ns（E = 8.1%）与 2.46 ns（E = 9.2%）。这些结果支持 EPS15、RAB33B 与 TICAM2 在人细胞中与 YULINK 互作。

截短体实验进一步定位了互作区域：YULINKΔN 与三者共表达时 τ 降至 2.39 ns（E=11.8%）、1.72 ns（E=36.5%）、2.18 ns（E=19.6%）——与全长相比，YULINKΔN 与 RAB33B 的 FRET 效率从 8.1% 升至 36.5%、与 TICAM2 从 9.2% 升至 19.6%，说明 N 端截短后与 RAB33B、TICAM2 更接近。而 YULINKΔC 与三者共表达时 τ 为 2.40 ns（E=11.4%）、2.53 ns（E=6.6%）、2.23 ns（E=17.7%），其中仅与 TICAM2 的 FRET 效率升高（9.2% → 17.7%），与 RAB33B 反而下降（8.1% → 6.6%）。这提示RAB33B、TICAM2 主要经 YULINK 的 N 端区域结合，而 EPS15 的结合区域还需进一步优化构建体才能明确。

图 3　与 YULINK 互作蛋白的 FLIM-FRET 分析。A 全长 YULINK 蛋白的质粒构建：含 4 个保守 WD40 重复（蓝色）与 3 个潜在 WD40 候选（紫色）。图中亦示 N 端或 C 端截短形式（YULINKΔN 或 YULINKΔC）的其他质粒构建体。B–D 为验证这些互作，将 YULINK（全长或截短形式）与 AcGFP 偶联，候选互作蛋白 EPS15、RAB33B 或 TICAM2 分别与 DsRed 偶联，二者在 HEK-293T 细胞中共表达，用多光子荧光寿命成像显微镜（FLIM）测量 AcGFP 的 FRET。平均荧光寿命（τ）与 FRET 效率 E（%）在共转染 48 小时后测定。τ 越短、E 越高，表明 AcGFP 与 DsRed 之间的互作越强、距离越近。仅表达 AcGFP-YULINK 的细胞荧光寿命作为 FLIM-FRET 对照。FRET，Förster 共振能量转移；FLIM，荧光寿命成像；WD40，WD40 重复序列；ns，无显著差异；E，FRET 效率；τ，平均荧光寿命。

6. 免疫共沉淀与超分辨成像：两路独立验证

我们用免疫共沉淀（co-IP）进一步确认这些候选蛋白是否与 YULINK 形成特定复合物：YULINK 用 AcGFP 标记并在 HUVEC 中过表达，随后用抗 GFP 抗体免疫沉淀细胞裂解液。免疫印迹分析显示，外源表达的 YULINK 与内源性互作蛋白 EPS15、RAB33B 或 TICAM2 共纯化，提示这些蛋白在体内确实与 YULINK 互作。

随后用 Leica SR-GSD 超分辨显微镜与共聚焦显微镜验证这些蛋白是否与 YULINK 物理共定位。超分辨分析以 Pearson相关系数（r）表示共定位比例：以 P53 与 SV40 大 T 抗原的结合作阳性对照（r = 0.76），以 YULINK 与 OCT4 之间无互作作阴性对照（r ≈ 0.03）。结果显示：AcGFP-YULINK 与 DsRed-EPS15、DsRed-RAB33B、DsRed-TICAM2 三对的 Pearson r 分别为 0.56、0.51 与 0.75，强烈提示 YULINK 与三者共定位。在 HUVEC 中用共聚焦显微镜测得的三者共定位率分别为 43.2%、89.6% 与 58.9%。

由于 EPS15 参与内吞、RAB33B 与 TICAM2 可能也参与其中，我们推测 YULINK 可能参与调控内吞。为检验这一假设，我们检测 YULINK 是否与内体标志物 Clathrin 与 RHOB 共定位。结果：超分辨显微镜下 YULINK–Clathrin 与 YULINK–RHOB 的共定位相关系数分别为 0.60 与 0.73；共聚焦显微镜下 YULINK 与 Clathrin 的共定位率达 71.3%（r = 0.83）。在 HUVEC 中用免疫染色进一步显示，Clathrin 与 EPS15、RAB33B、TICAM2 三者的共定位率分别为 86.6%、95.7% 与 87.3%。这些实验提示YULINK 及其互作蛋白 EPS15、RAB33B、TICAM2 可能都参与内吞作用。

我们还在 YULINK 敲低的 HUVEC 中做过表达 DsRed-EPS15、DsRed-RAB33B 或 DsRed-TICAM2 的救援实验：过表达 EPS15（p < 0.01，**）与 RAB33B（p < 0.05，*）能显著恢复迁移能力，而过表达另一内体相关蛋白 TICAM2 则无统计学显著差异。提示部分内体相关蛋白的过表达可救援YULINK 敲低细胞的表型。

图 4　用超分辨显微镜分析共定位。A, B 共表达 AcGFP-YULINK（绿）与目标蛋白 DsRed 偶联物（红）的 HEK-293T 细胞，在共转染 2 天后用超分辨显微镜分析共定位比例。合并图像（黄色）显示 AcGFP（绿）与 DsRed（红）的共定位。共定位的投影图像（灰色）取自合并图像，显示于每行最右列。内嵌散点图标示投影图像中的共定位程度。Pearson 相关系数（r）越高，表示共定位比例越高（A 图中 P53 与 SV40 大 T 抗原为阳性对照，r = 0.76；YULINK 与 OCT4 为阴性对照，r ≈ 0.03）。C YULINK 与内体标志物（Clathrin 或 RHOB）的共定位。HEK-293T 细胞共表达 AcGFP-YULINK 与 mKate-Clathrin，或 AcGFP-YULINK 与 DsRed-RHOB。YULINK–Clathrin 与 YULINK–RHOB 的共定位相关系数分别为 0.60 与 0.73。比例尺表示 4 μm。r，Pearson 相关系数；HEK-293T，人胚肾 293T 细胞；SV40，猿猴病毒 40。

7. 关键验证：内吞抑制剂 phenocopy 静脉缺失

为进一步确定抑制内吞是否影响静脉形成，我们考察了内吞抑制剂对斑马鱼血管形成与 HUVEC 管腔形成的影响。氯丙嗪（chlorpromazine）是已知的内吞抑制剂，它通过阻止网格蛋白衔接蛋白-2（AP-2）的装配来抑制网格蛋白包被小窝介导的内吞。实验中，双转基因胚胎在 16 hpf 接受 60 nM 氯丙嗪处理，22 hpf 洗去。

野生型胚胎躯干部（头后、尾前，含 DA 与 PCV）与尾部（肛门后，含臀鳍与尾鳍）在 24 hpf 时 DA、PCV、CA、CV 均发育完全；而氯丙嗪处理导致躯干部 PCV 与尾部 CV 完全无法形成。这说明抑制内吞确实干扰了动静脉分化，导致异常的血管丛形成。

在体外，HUVEC 经不同浓度氯丙嗪预处理后接种于 Matrigel 包被的板中，结果显示氯丙嗪以剂量依赖方式显著抑制毛细血管样网络形成，100 nM 时毛细网络完全崩溃。因此，内吞作用既是体外内皮细胞成管所必需，也是体内静脉形成所必需。

图 5　内吞抑制剂对体内静脉形态发生与体外毛细血管管腔形成的影响。A 双转基因 Tg(fli1:EGFP; gata1:DsRed) 胚胎在 16 hpf 接受内吞抑制剂氯丙嗪（60 nM）处理，22 hpf 洗去。图中展示 24 hpf 时胚胎躯干部与尾部血管的侧视与横切面视图。白色虚线标示横切面取材位置。上方各图为 WT 组。DA，背主动脉；PCV，后部主静脉；CA，尾动脉；CV，尾静脉。比例尺表示 50 μm。B 氯丙嗪在体外对毛细血管管腔形成的抑制。HUVEC 用不同浓度氯丙嗪预处理 1 小时后，接种于 Matrigel 包被的 12 孔板中。代表性区域以 10 倍放大拍摄。氯丙嗪以剂量依赖方式显著抑制毛细血管样网络形成，100 nM 时网络完全破坏。黑色比例尺表示 400 μm。数据点为 2 次重复实验、每处理 4 次测量的 mean ± SD。hpf，受精后小时数；WT，野生型；SD，标准差。

8. 分子落点：YULINK 参与 VEGF/VEGFR2 的内化与运输

为明确 YULINK 是否参与 VEGF/VEGFR 信号，我们检测了 VEGF 刺激下敲低 YULINK 是否影响 VEGFR2 的内化。CTRL 与 YULINK 敲低的 HUVEC 与 VEGF-biotin 孵育（并用抗 VEGF 阻断抗体预处理作对照），固定后用 Alexa-Fluor-594 偶联链霉亲和素染色作共聚焦分析。结果显示：CTRL 细胞中大多数可见 VEGF 被摄取，而 YULINK 敲低细胞在 0–30 分钟内摄取量下降。此外，YULINK 与 VEGFR2 在 HUVEC 中共定位（69.1%，r = 0.7），且共定位率随 VEGFR2 内化从 38.1% 升至 73.2%，提示 YULINK 参与 VEGF/VEGFR2 的内化。

两个定量数据进一步支持这一结论：YULINK 被 shRNA 敲低后，VEGF 与细胞表面结合量增加 1.69 倍（提示 CTRL 细胞的摄取更多），同时细胞膜组分中的 VEGFR2 量增加至 2.06 倍——两者均与「敲低细胞内化减少」的观察一致。这表明 VEGF/VEGFR2 的运输在功能上与 YULINK 相连。

图 6　YULINK 介导 HUVEC 中 VEGF 的内化与 VEGFR2 的运输。A, B CTRL 与 YULINK 敲低的 HUVEC 与 VEGF-biotin孵育指定时间（5、15、30 分钟），部分样本以抗 VEGF 阻断抗体预处理 VEGF-biotin。细胞固定后用 Alexa-Fluor-594 偶联链霉亲和素染色，作共聚焦显微镜分析。A 不同时间点细胞内 VEGF 强度的定量，每组至少统计 20 个细胞。●，CTRL；○，shYULINK；▲，CTRL + 抗 VEGF 阻断抗体；△，shYULINK + 抗 VEGF 阻断抗体。B 30 分钟时 CTRL（上排）与 YULINK 敲低细胞（下排）中内化 VEGF 的共聚焦荧光图像，Hoechst 染细胞核。C HUVEC 中 YULINK（绿）或 VEGFR2（红）染色。合并图像显示绿与红染料分子因向黄色偏移而共定位（Leica 共聚焦系统）。最右列显示共定位像素百分比。数据表明 YULINK/VEGFR2 具有较高的共定位像素比例（69.1%，r = 0.7）。D 血清饥饿的 HUVEC 经 VEGF 处理指定时间后固定、透化，用抗 YULINK（绿）与抗 VEGFR2（红）抗体标记后以荧光显微镜观察。E D 图中各时间点 VEGFR2/YULINK 共定位比例的定量（mean ± SD）。数据点为 2 次重复实验、每时间点 25 次测量的 mean ± SD，共定位率随时间由 38.1% 升至 73.2%。F 经 shRNA（针对 YULINK）或载体对照（CTRL）处理的 HUVEC 与 VEGF-biotin 孵育 30 分钟，加入 HRP 偶联链霉亲和素与 TMB，测定 OD450 值。敲低 YULINK 后 VEGF 与细胞表面结合量增加 1.69 倍。G 经 shRNA 针对 YULINK 或载体对照（CTRL）处理的 HUVEC 裂解液中，膜组分所含 VEGFR2 的量以 Western blot 显示，敲低后膜组分 VEGFR2 增加至 2.06 倍；Na+/K+-ATPase α1 用作内对照。VEGF，血管内皮生长因子；VEGFR2，血管内皮生长因子受体 2；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；CTRL，载体对照；TMB，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。

9. 下游：PI3K/AKT 信号被削弱

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路位于 VEGFR2 信号下游，且与静脉身份的指定有关——PI3K 通过阻断动脉型 p42/44 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK；即细胞外信号调节激酶 Erk）的活化来促进静脉细胞命运。为确定 YULINK 是否影响 PI3K 信号，我们用 Western blot 与流式细胞术检测了 PI3K 及其下游 AKT 的活化情况。

结果显示：与 CTRL 细胞相比，YULINK 敲低细胞中 YULINK、P-VEGFR2 与 P-P85 的蛋白水平分别为 46%、70% 与 23%。这些结果表明这些蛋白的活化程度下降，提示 YULINK 可能参与 VEGF/VEGFR 信号通路。

图 7　YULINK 敲低削弱 VEGFR2 下游的 PI3K 信号通路。A YULINK 敲低与载体对照 HUVEC 的总细胞裂解液 Western blot。检测 VEGFR2 与 PI3K 亚基 P85 的磷酸化（表示活化），分别以 VEGFR2 与 PI3K 亚基 P85 为内对照，GAPDH 为上样内参。条带强度用 ImageQuant TL（GE Healthcare）定量，归一化至各自对照并以百分比表示。B YULINK 敲低（红）与载体对照（蓝）HUVEC 中磷酸化 AKT（Ser473）水平的 Phosflow 分析。在 Canto 流式细胞仪上采集平均 3000 个门控事件，数据用 DIVA 软件分析。虚线轮廓为对照 IgG 单抗的背景染色，总 AKT 作为内对照。PI3K，磷脂酰肌醇-3激酶；AKT，蛋白激酶 B；VEGFR2，血管内皮生长因子受体 2；P-，磷酸化形式；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

三、讨论

本研究在斑马鱼与人 HUVEC 两个体系中揭示了 YULINK 通过内吞作用调控血管形成、尤以静脉形成为主。证据链相当完整：表型层面（斑马鱼 PCV 缺失）→ 功能层面（HUVEC 迁移与成管受损、EPHB4 磷酸化下降）→ 分子层面（与三个内体蛋白互作、共定位）→ 药物层面（内吞抑制剂 phenocopy）→ 通路层面（VEGFR2 与 PI3K 活化下降）。

其中氯丙嗪的 phenocopy 实验是最具说服力的一环：药物抑制内吞与基因敲除 YULINK 产生几乎相同的表型（PCV 与 CV 缺失），从两条独立路径 converging 到同一结论——静脉形成依赖内吞。而 VEGF/VEGFR2 数据的呼应也很巧妙：敲低 YULINK 后 VEGF 表面结合增加 1.69 倍、膜上 VEGFR2 增加 2.06 倍，恰好从「供体/受体」两端印证内化过程被阻断。

PI3K 信号的削弱也提示了一条与既有文献一致的通路：PI3K 可通过抑制动脉型 Erk 活化来促进静脉命运。因此 YULINK→内吞→VEGFR2 内化→PI3K/AKT 这条链条，很可能正是它偏向静脉命运的原因。当然，本研究仍有局限：YULINK 作为 WD40 重复蛋白为何偏向静脉而非动脉的分子细节尚不清晰，其在斑马鱼体内直接作用的靶蛋白也未在遗传学层面获得验证（本研究主要依赖药理学与细胞学证据）。

本文核心信息

1. YULINK 是一个「静脉专用」分子：敲低后动脉系统完全正常、静脉系统却整体消失——这种干净的表型在动静脉分化研究中并不常见，提示其作用点很可能就在命运决定的关键分岔处。

2. 「内吞」是静脉发育的隐藏开关：以往内吞多被理解为「细胞把物质搬进」的营养过程，本研究显示它还决定了血管的动静脉身份——这为理解血管发育调控提供了全新维度。

3. 药物与基因两条路互相验证：氯丙嗪（内吞抑制剂）phenocopy YULINK 敲低表型，YULINK 过表达/RAB33B 救援反向印证——这为「以内吞通路为靶点干预血管疾病」提供了可行性与现成工具。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。