Jingli Cao、Kenneth D. Poss

美国杜克大学医学中心细胞生物学系

Nature Protocols 11, 872 (2016)　doi:10.1038/nprot.2016.049
在线发表 2016-04-07

摘要

研究心脏再生，一个长期难题是「无法在活体里长时间观察心肌与心外膜细胞」——斑马鱼世代周期要3 个月，成体又缺乏可随时调控的遗传工具，心脏还是深藏在体内的器官。这篇 protocol 给出的解法是：把成年心脏取出来体外培养，在保持形态与搏动的前提下维持数周。其中的关键改良只有一条却极为重要：全程 150 rpm 摇床振荡——正是它让心脏不再贴壁、心室不再变形，从而能连续 30 天拍摄心外膜细胞的实时动态。

核心要点

1. 问题所在：组织再生本质上是体内（in vivo）现象，但成年斑马鱼研究受限于「世代长（约 3 个月）+ 缺乏时空可控的分子遗传工具 + 心脏内部器官难以活体成像」三重限制。

2. 为什么是心外膜？：心外膜是覆盖所有脊椎动物心脏表面的间皮层，在斑马鱼心肌损伤后的正常再生中必需；此外它还可作为「直接重编程」的细胞靶点——但它紧贴心脏表面，必须在保留心脏三维结构的条件下研究，这正是离体培养的用武之地。

3. 四项关键改良（相对原始方法）：L-15 → 碳酸氢盐缓冲 DMEM；加入 1% NEAA + 50 µM 2-巯基乙醇维持活力；用 Primocin抗生素鸡尾酒（青霉素-链霉素 + 两性霉素 B 不足）；全程 150 rpm 振荡培养（最关键的改良）。

4. 实验设计要点：因心脏尺寸与手术范围存在个体差异，每处理至少 10 个外植体，每次设5 个假处理对照，至少 2 次独立重复才能得出结论；同批同窝胚胎（clutchmates）必须一起使用。

5. 预期结果：心脏可搏动超过 1 个月；肌小节结构在前 2 周基本保持；心外膜细胞会自发增殖（无需任何处理），且增殖的心内膜细胞极为罕见。去除心外膜后约 2 周完成从基部到心尖的再生覆盖。

6. 方法的扩展应用：①心腔移植（流出道 → 心室基部移植可救援已丧失再生能力的心外膜）；②珠子移植（装载 Shh 蛋白的琼脂糖珠）；③原位杂交检测；④化合物筛选——可在心脏表面同时测试数百至数千种化合物对心外膜细胞的影响。

一、引言：为什么需要「把心脏取出来养」？

斑马鱼是研究心脏组织再生（因各种损伤而丢失或受损）的宝贵模型系统——受损的心脏可以通过存活心肌细胞的增殖再生出新的肌肉。心外膜、心内膜、血管、神经与炎症细胞等非肌肉支持细胞在心脏再生中也扮演关键角色。值得注意的是，心外膜是覆盖所有脊椎动物心脏表面的间皮层，在斑马鱼心肌损伤后心肌的正常再生中是必需的。斑马鱼与哺乳动物研究已为心外膜提出多种功能角色：为新生肌肉血管化、作为有丝分裂原的来源、参与肌肉存活，以及作为直接重编程策略的细胞靶点。

然而，组织再生按定义就是一个体内现象。成年斑马鱼的再生研究却一直受制于三个技术瓶颈：世代时间漫长（约 3 个月）、缺乏可用于时间上操控成年再生事件的分子遗传工具，以及心脏作为内部器官在技术上难以进行活体成像。为克服这些挑战，作者建立了一个外植体（explant）系统，可使成年心脏在维持大部分形态与收缩性的前提下培养数周。结合心外膜细胞遗传消融与活体监测工具，作者在近期研究报告中定义并解析了成年斑马鱼心外膜组织的再生能力。此外，该培养系统还可适配组织移植与化学筛选。

与已有培养体系的对比

①心脏切片培养——足以检测心肌行为，但不适用于心外膜研究；② 解离细胞培养——虽便于基因转染与活体成像，但脱离了细胞-细胞、细胞-细胞外基质的相互作用，且环境更「人工」；③ 本方案——结合两者优点，既适合细胞与分子分析，又最大程度保留了心脏表面环境。

图 1　实验流程总览。整个流程依次为：试剂准备与工具布置（步骤 1–3） → 心脏取材（步骤 4–5） → 心脏清理（步骤 6–8） → 处理与培养（步骤 9）（下设三选一分支：标准外植体培养 9A、心外膜消融 9B、增殖检测 9C）→ （可选）移植实验（步骤 10）（心腔移植 10A 或 珠子移植 10B）→ 成像（步骤 11）。此外，取材前还可进行（可选）心脏手术。

二、方案的开发与改良

作者最初的方法是将离体心脏置于含 10%（体积比）胎牛血清与抗生素的 Leibovitz L-15 培养基中培养 7 天。但这种方法有两个明显缺陷：① 心脏外植体倾向于贴附到培养皿底部，导致心室形状改变，使心脏表面心外膜细胞行为的活体观察变得困难；② 约 7 天内外植体内部会自发形成梗死，提示心肌维持不良。

为克服这些局限，作者做了四项针对性改良：① 换用碳酸氢盐缓冲的 DMEM（更适配 CO₂ 培养箱；同时试过 DMEM/F12 与 IMDM 未见明显差异，最终选 DMEM 是因为它足以满足本实验需求且成本低）；② 加入 1% 非必需氨基酸（NEAA）与 50 µM 2-巯基乙醇（前者广泛用于促进细胞生长与存活，后者作为还原剂可限制氧自由基水平）；③ 使用 Primocin 抗生素鸡尾酒用于最初几天的原代培养以降低污染发生率（曾测试青霉素-链霉素 + 两性霉素 B 组合，发现不足以减少污染）；④ 最重要的改良：全程引入振荡培养——在轨道摇床上以 150 rpm 全程摇动培养皿，促使外植体悬浮于培养基中，从而防止心室贴壁与变形，确保心脏表面基本保持完整。相比之下，每 12 小时手动摇动一次通常不足以防止外植体贴壁。

三、操作步骤（PROCEDURE）

准备（步骤 1–3）｜耗时 1 小时

· 1. 按试剂配制章节准备试剂。将 DMEM 培养基与 PBS 预温至 28 °C（或室温 25 °C），按需配制消融培养基；将轨道摇床放入 28 °C 培养箱。

· 2. 用 70% 乙醇浸泡镊子与剪刀消毒；用 70% 乙醇清洁实验台与解剖镜载物台；海绵亦需用乙醇清洗并挤干残余乙醇，后再以养殖水浸湿。反复使用的海绵可能积聚污染性微生物，乙醇清洗可降低污染风险。

· 3. 准备一个含 5 ml 培养基的 60 mm 培养皿，以及每管 1 ml 培养基的 EP 管。同处理、同品系的心脏放入同一管中。

心脏取材（步骤 4–5）｜每颗心脏 2–5 分钟

· 4. 用玻璃碗中的 tricaine 麻醉鱼，直至鳃动停止、尾夹无反应。用塑料勺转移鱼，在纸巾上短暂吸干，然后腹面朝上放置于浸湿海绵的凹槽中，置于解剖镜下。

· 5. 在鳃区沿腹壁作纵向切口打开腹腔，找到流出道（OFT），用镊子夹持流出道远端，轻柔地将心脏从胸腔中拉出；用镊子切断腹主动脉与静脉窦，将心脏放入含培养基的 60 mm 培养皿中。

心脏清理（步骤 6–8）｜耗时 5 分钟

· 6. 一把镊子固定流出道末端，另一把镊子小心清除心脏表面的血凝块；按实验需要去除心房或流出道。

· 7. 剪去 1 ml 移液器吸头尖端（或使用无菌塑料转移吸管），将心脏转移到含 1 ml 培养基的 EP 管中。为避免损伤心脏，转移时必须使用剪去尖端的 1 ml 吸头或无菌塑料转移吸管。

· 8. 在生物安全柜内，用 1 ml PBS 洗涤心脏三次（步骤 8–10 必须在生物安全柜内、使用无菌吸头与 PBS 进行，以保持外植体无菌）。

处理与心脏培养（步骤 9）｜耗时 5 分钟–24 小时 30 分钟

按实验目的三选一：A 标准外植体培养 · B 心外膜消融 · C EdU 增殖检测。

9A｜标准外植体培养

(i) 向 12 孔板各孔加入 1 ml 培养基（须预先温至 28 °C）。

(ii) 用 1 ml 移液器吸头将心脏转移至培养孔。

(iii) 将培养板置于 28 °C 培养箱内的水平摇床上，全程以 150 rpm 振荡；每隔一天更换培养基。

(iv) 转入步骤 10 行移植实验，或步骤 11 行成像。

9B｜心外膜消融（诱导上皮细胞死亡）

(i) 向 12 孔板各孔加入 1 ml 消融培养基（含 1 mM Mtz（甲硝唑））。培养基须预温至 28 °C；消融培养基须在解剖心脏前新鲜配制。

(ii) 用 1 ml 移液器吸头将心脏转移至培养孔。

(iii) 将培养板或培养皿置于 28 °C 培养箱内的水平摇床上，以 150 rpm 振荡 24 小时。

(iv) 水浴中将 PBS 与培养基预温至 28 °C。培养 24 小时后，用 1 ml 吸头轻柔吸去消融培养基（注意勿触碰心脏，以免损伤心外膜）。

(v) 各孔加入 1 ml 预温 PBS，轻柔晃动数次后吸出；再以 1 ml PBS洗一次。

(vi) 各孔加入 1 ml 新鲜培养基（不含 Mtz），放回培养箱继续以 150 rpm 振荡培养。

(vii) 转入步骤 10 或步骤 11。

9C｜增殖检测（EdU 掺入）

(i) 按 9A(i–iii) 或 9B(i–iii) 建立外植体培养。

(ii) 将新鲜 DMEM 培养基预温至 28 °C，加入 EdU 至终浓度 25 µM。到达目标时间点时，吸去原培养基并换成 EdU 培养基，放回培养箱1 小时（1 小时的掺入足以高效标记正在合成 DNA 的细胞）。

(iii) 1 小时后，或直接进入 (iv) 固定外植体，或洗脱 EdU 后继续培养至目标时间点（以 1 ml 预温 PBS 替换EdU 培养基，轻柔晃动后弃去，重复一次，再加新鲜培养基）。

(iv) 用 PBS 洗涤心脏两次，4% 多聚甲醛室温固定 2 小时。EdU 染色按标准方法进行。充分 PBS 洗涤很重要，可避免未掺入 EdU 造成的高背景。

(v) 染色后，将外植体置于盖玻片上，加一滴 Fluoromount G 封片，再压上另一片盖玻片，即可同时观察心室两面。

移植实验（步骤 10，可选）｜耗时 1 小时 + 相应培养时间

10A 心腔移植：在 35 mm 培养皿中央制备 1% 低熔点琼脂糖滴，用镊子在其顶部做一个小孔；将两颗心脏的一个心室与一个流出道紧密并置于小孔中，于琼脂糖中接触 24–48 小时（约 50% 外植体可紧密连接，48 小时比例更高）；随后将心室移植到已遗传消融心外膜的心室基部或心尖。

10B 珠子移植：将浸有 Sonic Hedgehog（Shh）蛋白的 Affi-Gel Blue 琼脂糖珠嵌入心室基部（小孔中可放 1–3 颗），BSA 蛋白珠作为对照；24 小时后从琼脂糖中释放心室并转移至新皿继续振荡培养。注意勿加入过多培养基，否则珠子会浮起；至少 50% 心室可成功植入并保持珠子。

成像（步骤 11）｜最长 30 天

使用 Leica M205FA 体视荧光显微镜或类似解剖镜，每天固定时间拍摄一次，最长可持续 30 天。我们通常拍摄心脏的两个面（心房面与其对侧），便于定向。成像时请保持培养板或培养皿盖子关闭，以降低污染风险。

四、预期结果（Anticipated Results）

培养过程中，心脏收缩会逐渐变慢，但外植体可持续搏动超过 1 个月。用 cmlc2:actinin3-EGFP 转基因品系可视化的肌小节结构在培养前 2 周基本得以维持，肌肉坏死罕见。心脏形状会逐渐改变（轻微缩小并变圆），但这些变化不影响心外膜细胞的增殖与迁移。

心外膜细胞无需任何处理即会自发增殖，细胞密度在前 2 天持续上升（经 Raldh2 抗体染色与 EdU 掺入验证）。增殖的心内膜细胞极为罕见；虽偶尔可见 EGFP⁺EdU⁺ 内皮细胞，但需内皮细胞核标志物进一步确认。培养中的外植体适合原位杂交；在未损伤心脏的外植体培养中可检测到 raldh2、tbx18、wt1 的诱导——这些是发育性激活心外膜细胞的标志物。

在 Mtz 处理下，心外膜细胞死亡自第 2 天（Mtz 孵育后 1 天）即可观察到，心脏表面可见碎屑突出；第 3 天（2 d.p.i.）可实现完全消融，此时腹侧表面大部分区域缺乏 tcf21:nucEGFP 荧光。通过每日成像可观察到心外膜再生：位于心室基部的心外膜细胞增殖并向心尖迁移，约需 2 周完全重新覆盖心室表面。心腔移植实验中，移除流出道后心室心外膜会丧失再生能力，而移植新鲜供体流出道可救援这一缺陷。珠子移植中，Shh 蛋白珠可在宿主心室内诱导心外膜细胞再生，提示该因子参与再生机制。

图 2　心脏解剖与外植体培养。a 心脏解剖的器材布置：解剖镜、镊子、剪刀、移液器与滤芯吸头、开槽海绵、含培养基的 60 mm 培养皿、含培养基的 1.5 ml EP 管、含稀释 tricaine 养殖水的指槽、勺与纸巾。b 取出的心脏置于 60 mm 培养皿中以去除血凝块与多余组织。c 用剪去尖端的 1 ml 移液器吸头将清理好的心脏转移至 EP 管。d 洗涤后的心脏外植体转移至 12 孔培养板，培养板置于 CO₂ 培养箱内的摇床上，振荡频率 150 rpm。e 培养板中两颗心脏外植体的特写，左侧含心房、右侧不含心房。心脏来自 tcf21:nucEGFP 转基因鱼，其心外膜细胞核由 EGFP 荧光标记。A，心房；V，心室；OFT，流出道。f e 图外植体的荧光视图，显示核EGFP 信号。斑马鱼实验已获杜克大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

图 5　外植体培养过程中肌小节形态与心外膜细胞的扩张。来自 cmlc2:actinin3-EGFP 鱼的心脏在指定时间点固定。上排：心脏切片用抗 Raldh2 标记心外膜与心内膜细胞（红色），DAPI 标记 DNA（蓝色）。肌小节结构（绿色）在前 2 周基本得以维持，同时心外膜细胞群明显扩张。第 14 天心肌有一定压缩，可能造成组织收缩。下排：DAPI（白色）染色显示心肌细胞核大体正常，培养 14 天内坏死罕见。

图 6　外植体培养过程中心外膜细胞的自发增殖。a 培养 48 小时后心外膜细胞的自发增殖。该心脏外植体来自 tcf21:nucEGFP 鱼，在培养 47–48 小时以 25 µM EdU 处理 1 小时。框选区域放大显示细节，箭头标示 EGFP⁺EdU⁺ 细胞核。b 来自 fli1a:EGFP 鱼（该品系以 EGFP 标记心内膜与血管内皮细胞）的 72 小时心脏外植体切片，在培养 48–72 小时以 25 µM EdU 处理 24 小时。大多数 EdU⁺ 细胞位于心室壁内，而 EGFP⁺EdU⁺ 心内膜细胞非常罕见；偶见 EGFP⁺EdU⁺ 内皮细胞（箭头）。细胞核以 DAPI（蓝色）染色。EdU，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷；DAPI，4′,6-二脒基苯二胺；比例尺 200 μm。

图 4　离体心外膜再生与心腔移植。a 心室心外膜由基部向心尖方向再生（箭头）。来自 tcf21:NTR; tcf21:nucEGFP 成年鱼的心脏以 1 mM Mtz 处理 24 小时。tcf21:NTR 转基因使得 Mtz 处理后时间可控的心外膜细胞死亡。整体成像每日拍摄。约 2 周完成从基部到心尖的完全再生。d.p.i.，Mtz 孵育后天数。b 来自 tcf21:nucEGFP 鱼（绿色）的新鲜流出道，经琼脂糖中 48 小时接触后移植至 tcf21:NTR 鱼（红色）心室的基部。该心室先以 1 mM Mtz 处理 24 小时，移植前再培养 2 天。c 非转基因供体的流出道（OFT）被移植至已消融心外膜的心室基部。可观察到来自宿主组织的、由基部向心尖的心外膜再生（箭头），说明供体流出道救援了宿主的再生缺陷。d.p.t.，移植后天数。Mtz，甲硝唑；NTR，新霉素抗性胸苷激酶；d.p.i.，Mtz 孵育后天数；d.p.t.，移植后天数；比例尺 200 μm。

图 3　心腔与珠子移植。a 35 mm 培养皿，中央滴加 1%（重量/体积）低熔点琼脂糖；用镊子在琼脂糖顶部做一个小孔。b 洗涤后的 Affi-Gel Blue 珠子沉至 EP 管底部。c 将来自两颗心脏的一个心室与一个流出道紧密并置于琼脂糖小孔顶部。V，心室；OFT，流出道。d 位于小孔内的心室外植体在基部被移植上一颗珠子。e c、d 图实验样本的横切面示意图。V，心室；OFT，流出道（心脏流出道）。

图 7　外植体心室切片培养 2 天后的原位杂交。在培养过程中，raldh2、tbx18 与 wt1 被诱导——它们是发育性激活心外膜细胞的标志物。多数外植体中 raldh2 仅在壁层被检出（左上），而部分外植体显示心内膜也有表达（右上），提示损伤可诱导心内膜激活。

本文核心信息

1. 一个改良决定了整套方法的成败：把静止培养改为150 rpm 全程振荡，一举解决了「外植体贴壁变形」与「内部梗死」两个原始缺陷，使心脏表面能连续观察数周。

2. 心外膜能被消融后完整再生，且方向是「由基部到心尖」——约 2 周完成表面覆盖；移走流出道会让心室心外膜丧失再生能力，而移植新鲜流出道可救援，说明流出道对心外膜再生有必需的贡献。

3. 方法本身是「可扩展平台」：心腔移植、珠子移植、EdU 增殖检测、原位杂交、化合物筛选都可在这套系统上开展，其中化合物筛选可同时在心脏表面测试数百至数千种分子，是筛选心再生增强因子的现成平台。

五、局限性与注意事项

本方案虽已成功用于研究心外膜细胞行为，但不适用于对心肌细胞（cardiomyocytes）的细致研究——培养期间检测到的心肌增殖非常有限，可能是培养基成分缺失或环境条件不理想所致。培养中收缩频率会下降，心脏偶发内部梗死。若要将其拓展至心肌的离体研究，仍需进一步优化协议。

时间维度上：多数应用可在 2 周内完成，此时心脏在形态与搏动上大体正常；超过 2 周的长期培养则会出现形态改变（组织缩小、锥形心室变圆，可能与振荡有关）。心腔移植后，心室形状可能因琼脂糖施加的压力而轻微改变，但不同形状心室中的心外膜细胞行为（如增殖、迁移）未见明显差异。

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