Malgorzata Wiweger, Lukasz Majewski 等

波兰华沙分子与细胞生物学研究所

Frontiers in Cellular Neuroscience, 2021, 15: 647860　doi:10.3389/fncel.2021.647860
原题：npc2-Deficient Zebrafish Reproduce Neurological and Inflammatory Symptoms of Niemann-Pick Type C Disease
通讯作者：Malgorzata Wiweger　|　收稿 2020-12-30，接受 2021-03-26，发表 2021-04-27

导读

尼曼-匹克 C 型病是一种几乎无法在生前确诊的绝症——现行金标准检测需要培养皮肤成纤维细胞，很多实验室根本做不了。这项研究造出了 npc2 敲除斑马鱼，并且找到了一种把试剂水滴进鱼缸里就能确诊的替代方案。

一句话看懂这篇论文

1 作者用 CRISPR/Cas9 敲除斑马鱼 npc2（1 bp 缺失导致提前终止密码子），这是首个 npc2 突变斑马鱼模型——此前只有 npc1 的敲除鱼。

2 尼罗蓝染色是最实用的发现：滴入养殖水，几分钟内活体幼鱼的外周嗅觉器官就会出现特异性强染色，准确率超过 95%，而且用临床用药 2HPβCD 处理后信号可被逆转。

3 模型完整复现了 NPC 病的三大特征：髓鞘缺陷、小脑浦肯野细胞变性、多器官炎症反应；并首次发现 mcu（线粒体钙单向转运体）下调，提示线粒体钙摄取障碍可能参与 NPC 病发病。

最有转化价值的一点

尼罗蓝染色把 NPC 病的诊断门槛从"需要细胞培养的实验室"降到了"一缸水和一个下午"。而斑马鱼 1 个月的生命周期约等于人类 2 年，意味着绝大多数与患者年龄相当的实验都可以在胚胎与早期幼鱼阶段完成。

一、研究背景：一种难以确诊的罕见病

尼曼-匹克 C 型（NPC）病是一种常染色体隐性溶酶体贮积病，由细胞内胆固醇转运蛋白 NPC1（占 95% 病例）或 NPC2（占 5% 病例）突变引起，导致未酯化胆固醇与糖脂在溶酶体和晚期内体中蓄积，主要累及肝脏、脾脏与大脑。

疾病发作时间可从幼儿期（最常见）到成年不等，患者症状谱极宽。胆汁淤积性黄疸与内脏肿大常是最早的表现，而进行性神经退行性变则是最致命的后果。

NPC 病的神经系统症状与其他神经退行性疾病相似——阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、某些线粒体疾病。小鼠模型的组织学分析已鉴定出小脑浦肯野细胞丢失；Npc1−/− 小鼠还出现中枢神经系统髓鞘化异常，并伴随少突胶质细胞分化相关基因（Olig1、Olig2）表达下降。

NPC 病的临床谱从快速进展的产前／新生儿型到青少年期的慢性型不等。胆固醇特异性的 filipin 染色多年来是 NPC 诊断的金标准，但它需要培养皮肤成纤维细胞，操作要求高，无法在每个实验室开展，因此并不推荐作为首要诊断工具。

斑马鱼是研究脂质代谢、神经炎症与神经退行性疾病的优秀模型：与人类基因相似度超过 70%、体型小、身体透明、在体外发育使得从受精到自然死亡的整个生命历程都可以在活体观察，且发育快、产卵量大、饲养容易。作者特别指出：斑马鱼 1 个月的寿命大约相当于人类 2 年。

此前已建立 npc1 突变斑马鱼（Lin 等，2018；Tseng 等，2018），但斑马鱼 NPC2 的相关工作此前是空白。本研究填补了这一空白。

二、研究策略：造出 npc2 敲除鱼

表 1　模型构建与检测方案

三、结果一：5 天幼鱼看起来完全正常

斑马鱼 npc2 基因（ENSDARG00000090912）位于 17 号染色体，编码 149 个氨基酸的蛋白，与人同源蛋白序列一致性超过 64%。该基因在所有受检组织中都有表达——脑、心、肝、肌肉、皮肤与生殖器官。

CRISPR/Cas9 造出 F0 后，经 HRM 初筛选出 6 尾 HRM 谱型差异最明显的供体鱼，其 F2 后代经 HRM 与测序分析，最终选定第三外显子 1 bp 缺失、预测产生提前终止密码子的突变系。

关键的"表型延迟"现象：5 dpf 时，杂合与纯合突变幼鱼的形态与体长与野生型同胞完全无法区分——这与此前 npc1 敲除鱼的表现相似。但随着时间推移差异愈发明显。

• 2 月龄：纯合突变鱼体型小于同胞，且性别比偏向雄性。

• 4 月龄起：运动功能出现明显障碍。

• 摄食与运动能力持续恶化，但个体差异很大——有些鱼 5 月龄因进食与游泳能力严重受损而被安乐死，另一些则健康存活了额外 4 个月。

• 9 月龄：体长与体重显著降低。

• 繁殖：纯合突变鱼可正常产卵，但纯合自交失败；不过纯合雄鱼与野生型或杂合雌鱼杂交可获得存活后代。

还有一个有趣的观察：把纯合突变鱼与同胞分开饲养后，它们不必争抢食物，生长反而更快。这一现象在讨论中被用来解释生长迟缓与性别比偏移——生长受限与雄性偏多的现象，至少部分可归因于摄食能力受损。

图 1A ｜ npc2 突变体的建立与早期表型。（A）多物种比对显示 NPC2 蛋白在脊椎动物中高度保守。箭头标示突变位点。（B）成年鱼不同组织中 npc2 基因的表达水平，以表达量最低的组织（脑）归一化。（C）测序图谱确认 npc2 突变体中存在一个小片段缺失。（D）野生型（黑）、杂合突变体（蓝）与纯合突变体（灰）熔解曲线图谱，后者来自 npc2± 自交后获得的鱼。（E）npc2−/− 斑马鱼各器官中 npc2 基因 mRNA 水平相对于野生型对照的比值。数据为每组 3 尾 9 月龄鱼的均值 ± SEM。误差线表示 SEM。***p < 0.001，**p < 0.01。（F）野生型、杂合与纯合 npc2 突变体在 5 dpf 时表型无法区分。比例尺 = 1 mm。（G）成年鱼形态。8 月龄 npc2−/− 鱼体型与体重更小，而 npc2± 表型无差异。误差线表示 SD。

图 1B ｜ npc2 突变体各组织 mRNA 水平。（E）npc2−/− 斑马鱼各器官中 npc2 基因 mRNA 水平相对于野生型对照的比值；数据为每组 3 尾 9 月龄鱼的均值 ± SEM。

四、结果二：一滴尼罗蓝就能确诊

既然尼曼-匹克 C 型病是溶酶体贮积病，研究者先按惯例做了 filipin 染色，确认纯合突变体的信号确实更亮，即未酯化胆固醇如期在突变体中蓄积。

他们也尝试了 LysoTracker red 探针活体标记酸性细胞器，在部分纯合突变幼鱼的神经丘（neuromast）中看到信号增强，但无法可靠区分野生型与突变体。

而尼罗蓝染色则给出了稳健可靠的结果：把尼罗蓝加到培养皿的水里，几分钟内就能可逆地给活体幼鱼染色。5 dpf 时，外周嗅觉器官的强烈染色是纯合突变鱼特有的（准确率超过 95%），而身体其他部位的染色则显得随机。

特异性也得到了验证——用两种已知影响胆固醇稳态的药物处理：2HPβCD（NPC 病临床试验用药）使突变鱼鼻部染色强度降低，U18666A（胆固醇合成抑制剂，化学诱导 NPC 模型）则使信号增强。

本文最具实用价值的一步

尼罗蓝本身并非 NPC 专属染料（它主要用于检测黑色素与脂褐素），但由于其溶酶体趋光性光敏剂特性可定位到溶酶体，而在斑马鱼幼鱼中，发育期受累的嗅觉器官恰好提供了一个可读的窗口。配合药物可逆性验证，它把一个需要细胞培养的诊断流程简化成了"一缸水加一滴染料"。

图 2 ｜ 尼罗蓝染色区分纯合突变体与野生型、杂合同胞。尼罗蓝染色可将 npc2−/− 鱼与野生型及杂合同胞区分开。在 5 日龄 npc2−/− 幼鱼的外周嗅觉器官中可检测到强烈信号（B–B"），而同批鱼中则无此信号（A–A"）。（A, B）侧位视图；（A′, A", B′, B"）背位视图；（A", B"）分别为 A′、B′ 的放大片段。箭头标示嗅觉器官位置。比例尺 = 0.5 mm。

图 3 ｜ 尼罗蓝染色的特异性验证。5 dpf npc2−/− 幼鱼嗅觉器官中尼罗蓝染色的特异性。（A–A"）未处理的 npc2−/− 幼鱼；（B–B"）用 2 mM 2-羟丙基-β-环糊精（2HPβCD）处理（该药用于 NPC 患者的临床试验）后染色强度降至野生型水平（Figures 2A–A"）；（C–C"）用 8 mM (3β)-3-(2-[二乙氨基]乙氧基)雄甾-5-烯-17-酮盐酸盐（U18666A）处理（化学诱导 NPC 模型的胆固醇合成抑制剂）后，npc2−/− 幼鱼染色强度增加。（A–C）侧位视图；（A′, A", B′, B", C′, C"）背位视图；（A", B", C"）分别为 A′、B′、C′ 的放大片段。比例尺 = 0.5 mm。

五、结果三：动作变慢，还更怕了

在行为学检测中，纯合突变幼鱼与野生型同胞相比移动能力显著下降：移动距离更短、保持运动状态的时间更短、实验前 5 分钟的平均速度更低。

还有一个容易被忽略但很重要的指标：实验开始 5 分钟内，突变幼鱼更倾向于贴近孔板边缘——这就是贴壁行为（thigmotaxis），是斑马鱼幼鱼典型的焦虑样反应。作者据此认为该组对应激源表现出了更强的焦虑相关反应。

这一点在讨论中被特别强调：此前在小鼠上做过的"探索活动下降、多动、焦虑降低"等研究，都是在运动技能已经受损的成年动物上进行的，其表现可能已受运动障碍影响。而在斑马鱼上，同样的行为改变可以在 5 日龄、无震颤的动物上量化，疾病进程还能随时间持续追踪。

图 4 ｜ 突变幼鱼移动能力下降、贴壁行为增加。npc2−/− 幼鱼移动能力下降且贴壁行为增加。（A）npc2+/+ 与 npc2−/− 幼鱼在每个 5 分钟时段内平均轨迹的热图。（B–E）npc2+/+ 与 npc2−/− 幼鱼的总移动距离、运动时间、平均速度与贴壁行为的箱线图。（E）*p < 0.05，**p < 0.01。

六、结果四：内脏里的泡沫细胞与胆固醇沉积

成年纯合突变鱼的内部器官出现明确病变。肝脏中可见大量泡沫肝细胞（含脂肪滴的肝细胞）与细胞核肿大的细胞；肾脏前部出现非典型的间质泡沫细胞群；胰腺结构紊乱——腺泡细胞失去了特征性的酶原颗粒，却含有对照中看不到的多个圆形胆固醇包涵体。

这些泡沫细胞很有意思：鱼没有骨髓，造血由胸腺、脾脏和前肾承担，而这三个主要造血器官都受了累；具有特征性泡沫细胞质的心脏、脾脏与肾脏在 NPC 患者与多种动物模型中也都有报道。

图 5 ｜ H&E 染色揭示软组织的病理改变。H&E 染色揭示 npc2−/− 软组织的病理改变。（A）npc2 缺陷肝脏中可见细胞核肿大（黑色箭头）、不同类型脂肪滴蓄积的肝脂肪变（空心箭头head）与泡沫细胞质（星号）。（B）肾脏中可见位于小管（DT，集合管）与近曲小管（PT）之间的变性细胞（DMc）。（C）胰腺中腺泡细胞的酶原颗粒变性以及胆固醇沉积。石蜡切片来自成年 npc2−/− 鱼与野生型 npc2+/+ 对照。比例尺 = 50 μm。

七、结果五：脑里的空洞、髓鞘脱落与浦肯野细胞变性

脑部的改变最为系统。

• 髓鞘化受损（LFB 染色），缰核连合（habenular commissure）尤为明显，缰核特征性的分层结构也受到影响。

• 束状倒位束（fascicular retroflexus）、脚间核（interpeduncular nucleus）与中缝出现空泡化，轴突束髓鞘化减少。

• 两个机械感受区域中轴突束发育良好的外侧与内侧纵束在纯合突变鱼中完全观察不到。

• 小脑浦肯野细胞较对照更弥散，结构也不同：细胞呈球形、染色质高度不凝缩、细胞核肿大、胞体膨大。

• 浦肯野细胞区域未见 PCNA 阳性细胞（即无增殖），但对照组的室旁下丘脑室周区小细胞旁核与尾侧区可见增殖。

• 嗅球的外层与内层细胞层胞质内出现多重空泡化；端脑与视顶盖（主要在 stratum fibroetgricialem）可见广泛的神经元与胶质细胞泡沫状空泡化及神经元球形体。

• 纯合突变鱼中可见 CD3 阳性细胞，而野生型组没有任何信号。

组织学的另一条线索是基因表达：在 5 日龄整条幼鱼中，mbp、cldn、olig1 下调，而 mpz、plp1、sox10 表达不变；在成年纯合突变脑中，只有 mbp 与 mpz 显著下降。这种髓鞘标志物的下调与 LFB 染色的减少相互印证。

作者特别指出，幼鱼与成鱼的基因表达改变并不相同——这并不意外，因为成年鱼已严重受累，而 5 日龄幼鱼中疾病才刚开始进展。

图 6A ｜ Luxol fast blue 染色显示髓鞘化差异。成年 npc2−/− 斑马鱼中枢神经系统的病理改变。（A）Luxol fast blue 染色显示野生型与 npc2−/− 鱼之间髓鞘化的差异。OB，嗅球；OR，嗅玫瑰；Te，端脑；TeO，视顶盖；Ce，小脑；Me，延髓；PG，前小球复合体；PT，后结节。比例尺 = 500 μm。

图 6B ｜ 缰核结构改变与中脑空泡化。（B）部分 npc2−/− 鱼的缰核结构改变，该部位缺乏缰核束的特征性结构。（C）中脑缰核束空泡化（蓝色箭头），伴束状倒位束（蓝色箭头head）以及内侧与外侧纵束的变性改变。（B, C）H&E 染色。比例尺 = 100 μm（（C）为 500 μm）。

图 6C ｜ 中脑的广泛空泡化与轴突束变性。（C）中脑的病理改变：缰核束空泡化（蓝色箭头）、束状倒位束空泡化（蓝色箭头head），以及外侧与内侧纵束的变性。OB，嗅球；OR，嗅玫瑰；Te，端脑；TeO，视顶盖；Ce，小脑；Me，延髓；PG，前小球复合体；PT，后结节。H&E 染色。比例尺 = 500 μm。

图 7 ｜ 感觉器官的病理改变：小脑浦肯野细胞变性。npc2−/− 感觉器官的病理改变。（A）npc2 突变体中小脑结构与浦肯野细胞变性（灰色箭头）。（B）嗅玫瑰与嗅神经（白色箭头）。（C）视神经节。视顶盖内可见胞质泡沫状苍白、核呈嗜酸性、有变性征象的细胞（黑色箭头）。（A）ML，分子层；P，浦肯野细胞层；GL，颗粒细胞层；OfN，嗅神经；OR，嗅玫瑰；（B）OT，视顶盖；OpG，视神经节。H&E 染色。比例尺 = 50 μm。

图 8 ｜ 幼鱼与成年鱼髓鞘化的下降。npc2 缺陷幼鱼与成年鱼中髓鞘化的下降。散点图显示 5 dpf 幼鱼以及 npc2−/− 与野生型斑马鱼脑内若干基因的归一化表达。每个圆点代表一尾斑马鱼，以 18S 核糖体基因作为参照。至少分析 3 个样本。***p < 0.001；**p < 0.01；*p < 0.05。

八、结果六：炎症与钙信号的失衡

既然 mbp 下调在 npc1−/− 模型中与白细胞介素-1 信号上调相关，研究者进一步在 9 月龄鱼的脑与肝中检测了炎症相关基因。

• 脑：il1、nfκβ、mpeg、capn2a 全部上调。

• 肝：只有 il1 上调，nfκβ、mpeg、capn2a 不变。

• 与脑相反，肝中 mpx、apoE、ppp3ca 上调。

• 5 dpf 幼鱼中，apoE、capn2a、lgals3a、mcu、mpeg、ppp3ca 全部下调，其中mcu 的差异统计显著性最高。

小胶质细胞方面，用中性红（特异性标记幼鱼脑小胶质细胞）染色后，5 dpf 纯合突变幼鱼中可见大量红色标记细胞，带有过度活化小胶质细胞的典型形态——胞体增大、细胞呈阿米巴样。

自噬方面，becn1 表达轻微上调，这与此前 Pacheco 等的发现一致（NPC1 缺陷中增强的自噬基础水平由 Beclin-1 表达增加介导）；但泛素依赖的应激诱导自噬标志物（atg5、atg7、p62）没有显著变化。

最有意思的是药物干预的结果：2HPβCD 处理后，mcu 与 ppp3ca 的表达被救回野生型水平，与髓鞘化相关的基因（olig1、mbp、cldn、plp1）表达也被救回。

首次发现的机制线索

据作者所知，这是首次发现"钙进入线粒体的能力受损可能参与 NPC 病发病"的研究。mcu 编码线粒体钙单向转运体，是线粒体摄取钙的关键通道；而 ppp3ca 编码钙调神经磷酸酶。作者团队此前报道过，敲除 mcu 可以救回 pink1 突变斑马鱼（帕金森病模型）丢失的多巴胺能神经元。更普遍地说，钙稳态与信号改变的并不局限于线粒体——NPC 病与小鼠小脑中 Ppp3ca 表达下降的关联也早已有报道。

图 9 ｜ 炎症标志与钙稳态改变。npc2−/− 斑马鱼中炎症的迹象与 Ca²⁺ 稳态的改变。散点图显示 9 月龄 npc2−/− 纯合鱼与野生型斑马鱼脑与肝组织中若干基因的归一化表达。每个圆点代表一尾斑马鱼，以 18S 核糖体基因作为参照。至少分析 3 尾鱼。***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。

图 10 ｜ 2HPβCD 处理把基因表达救回野生型水平。用 2-羟丙基-β-环糊精处理后，5 dpf npc2−/− 幼鱼中与炎症和 Ca²⁺ 稳态相关基因的表达升高至野生型水平。散点图显示未处理幼鱼（A）与经 2 mM 2HPβCD 处理幼鱼（B）在 5 dpf 时若干基因的归一化表达。每个圆点代表一尾斑马鱼，以 18S 核糖体基因作为参照。实验进行了三次重复。***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。

九、讨论：为什么这个模型值得关注

NPC 病是一种罕见病，但阐明其发病机制，有助于理解那些更常见、同样涉及胆固醇稳态、自噬、炎症与神经退行性变的疾病。越来越多的证据把胆固醇转运抑制与病毒感染易感性降低联系起来，包括 SARS-CoV-2。

在两个 NPC 基因中，NPC1 及其同源基因研究得最为充分；而对 NPC2——这个把胆固醇运送给 NPC1 的可溶性溶酶体蛋白——所知甚少。本文填补的正是这一空白。

寿命：一个耐人寻味的对照

在人和斑马鱼中，NPC1 或 NPC2 任一基因失去一个等位基因都不足以致病；纯合突变则导致早死，但个体寿命差异很大。

这里有个耐人寻味的对照：多数 npc2−/− 鱼能活到 4 月龄，而多数 npc1−/− 鱼在出生后第一个月内就死亡。按"1 个月斑马鱼 = 2 年人类"折算，两者的患者与突变鱼寿命受影响的方式是相似的。（临床上，NPC1 突变携带者中婴儿早发型 NPC 的比例也确实高于 NPC2 突变者。）

作者还诚实指出了一个仍未解决的问题：纯合突变鱼虽体型较小，成年后仍能产生配子，却始终无法成功自交。同样的问题在 Npc2−/− 小鼠与 npc1−/− 斑马鱼中都有报道。但本文发现纯合雄鱼偶尔能与杂合雌鱼交配并产生存活后代，这与 Busso 等（2014）的观察一致。

作者推测原因可能不止一个：小脑形态发育异常、嗅觉系统的病理改变（嗅觉受损是神经退行性疾病的早期标志）、以及震颤、动作缺陷与对化学线索无反应，共同妨碍了求偶行为——而求偶涉及气味沟通等社会性整合。

最后是本模型最有价值的应用前景：斑马鱼 npc2 突变可用于 NPC 病及其他胆固醇依赖性神经退行性疾病的研究，在个体、细胞与分子三个层面均可开展；斑马鱼实验可规模化、适合高通量药物筛选，该突变株有望成为 NPC 病药物研发早期管线的有用模型。

动物福利角度的意义

还有一点值得强调：这个模型把"患者年龄相当的实验"从动物福利角度变得可行。NPC 病绝大多数实验都在 5 日龄幼鱼上完成——这个阶段的斑马鱼尚不属于受保护动物，实验无需伦理审批。

十、结论与意义

首个 npc2 突变斑马鱼模型，补上了 NPC 研究的一块空白。它复现了人类患者的神经病变、细胞学改变、髓鞘化缺陷与炎症反应，并把"无法确诊"这个临床难题部分转化为一个可推广的实验工具。

尼罗蓝染色可能是最有立即价值的一项发现。它在 5 日龄幼鱼的外周嗅觉器官给出特异性信号（准确率超过 95%），染色可逆且能被临床用药 2HPβCD 逆转——为 NPC 病提供了一条不依赖细胞培养的候选诊断路径。

而mcu 的发现则把 NPC 病与线粒体钙稳态联系了起来。线粒体钙摄取受损可能参与发病——这一线索此前只在细胞与小鼠模型中零散出现过，现在有了一个可在个体层面研究、可做药物筛选的脊椎动物模型。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。