Upregulation of metastasis-associated PRL-3 initiates chordoma in zebrafish

Li Li, Hongshun Shi, Mingming Zhang, Xiaoling Guo, Fang Tong, Wenliang Zhang, Junyi Zhou, Haihe Wang, Shulan Yang

中山大学附属第一医院转化医学中心；中山大学中山医学院生物化学系；中山大学干细胞生物学与组织工程中心（广州）

通讯作者：Shulan Yang（yangshl3@mail.sysu.edu.cn）、Haihe Wang（wanghaih@mail.sysu.edu.cn）　共同第一作者：Li Li、Hongshun Shi

期刊论文 · 全文中文翻译　|　International Journal of Oncology　·　《国际肿瘤学杂志》 · Spandidos Publications 出版（希腊） · 2016 年 48 卷 4 期 1541–1552 页 · 原创研究论文（Article）

期刊与出版信息

一句话速读

脊索瘤是一种源自胚胎脊索残余的罕见恶性肿瘤，至今缺乏有效治疗手段。本研究首次发现，蛋白酪氨酸磷酸酶 PRL-3 在斑马鱼胚胎发育早期呈母源性与合子型广泛表达，其转录本随后逐步收窄至脊索、血管与肠道；把 斑马鱼 Prl-3 或 人 PRL-3 mRNA 注入单细胞期胚胎，会在 48 小时内长出肉眼可见的脊索畸形肿块（发生率 38% vs 对照 5%），且畸形部位持续表达脊索标志物 shh 与 ntl（Brachyury），证明这正是"脊索瘤样"表型。临床脊索瘤标本的免疫组化进一步检出 PRL-3 抗原，把一个原本只在肿瘤转移研究中被提及的分子，第一次和一种罕见实体肿瘤的发生（而非转移）挂上了钩。

编者提示

编者提示

本文为 2016 年发表的研究论文，原文正文约 8 页，方法学主线清晰（整体原位杂交 + Northern blot + mRNA 显微注射 + 报告基因 + H&E / 免疫组化）。本译文为全文完整翻译，含材料与方法、全部图表说明、致谢与参考文献。翻译与校对过程中发现原文存在两处需注意的表述问题，此处如实标注，读者引用具体数据时请以对应章节为准：
① 图表编号与正文表述不一致——原文图 3 的图注写作 "knockdown (KD) embryos"，但该图实际展示的是过表达（OE）胚胎的脊索畸形（与图 2 同属过表达实验），图注中的 "KD" 疑为笔误，译文按实际情况译为「过表达（OE）」并在此说明；
② 表 II 中对照组样本量与百分比的自洽性——表中 zPRL-3 无义 mRNA 对照组记为 "5%（48/1021）"，但 48/1021 ≈ 4.7%，且该组发生例数（48）反而高于zPRL-3 mRNA 组的百分比分母逻辑，提示原文该行可能存在笔误（分母或分子之一）。译文按原文如实呈现数值，不作改动，读者据此评估效应量时请自行核验原始数据。

摘要

转移相关蛋白酪氨酸磷酸酶（metastasis-associated phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）在多种人类癌症的进展中扮演多重角色，但它在发育过程中的作用尚未被研究。本文克隆并鉴定了斑马鱼 prl-3 转录本的表达模式，证明它在发育最初的 24 小时内广泛表达，且兼有母源表达与合子表达。到受精后 96 小时（96 hpf），这些转录本已逐步收窄至脊索、血管与肠道。值得注意的是，过表达斑马鱼 Prl-3（zPrl-3）与人 PRL-3 均能在斑马鱼中诱导脊索畸形。该表型类似脊索瘤（chordoma），并由脊索特异性标志物的错误表达所佐证。临床脊索瘤标本中检出 PRL-3 抗原，则强烈提示 PRL-3 在脊索瘤中的临床意义。综上，我们的研究揭示：PRL-3 的异常过表达可在胚胎早期即启动脊索瘤的发生，并提示 PRL-3 可作为脊索瘤的预测标志物与治疗靶点。

关键词　PRL-3；脊索瘤；斑马鱼；肿瘤发生

一、引言

再生肝相关蛋白酪氨酸磷酸酶-3（protein-tyrosine phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3），又称 PTP4A3（酪氨酸磷酸酶 IVA 型 3），是一种分子量相对较小的蛋白（约 22 kDa）。它属于蛋白酪氨酸磷酸酶超家族（1），该超家族包含 PRL-1、PRL-2 与 PRL-3 三个成员。其中 PRL-3 已知在结肠癌的远处转移灶中高表达（2）。在乳腺癌（3）、卵巢癌（4,5）、肝癌（6）与胃癌（7）等其他类型肿瘤中也观察到 PRL-3 高表达。此外，在基于癌细胞系的研究体系中，PRL-3 表达升高与癌细胞增殖、运动能力、侵袭性以及肿瘤血管生成相关（8-10）。越来越多的证据表明，PRL-3 的高表达水平是不良预后因素（11）。在机制层面，PRL-3 可在不同肿瘤中调控包括 Rho GTPase（12）、Src（13）与 PI3K-AKT（14）在内的多条信号通路。所有这些观察都表明，PRL-3 在多种癌症的进展与转移中扮演重要角色。

尽管已有证据将 PRL-3 表达与肿瘤细胞及组织中的成瘤与转移联系起来，但 PRL-3 在发育过程中的表达模式，以及胚胎发生期间普遍表达所导致的后果，仍然未知。在成年组织中，可检出 PRL-3 在心脏与骨骼肌中的表达，而在胰腺中可检出中等水平的表达（15,16）。小鼠 PRL-3 也可在小肠绒毛上皮细胞中被检出（17）。尤为重要的是，在大鼠胎儿心脏与发育中的血管中可检测到 PRL-3 蛋白，但在成年大鼠或人心脏与成熟血管中则不然（9）。这些观察提示，哺乳动物中 PRL-3 的表达模式受发育阶段调控，且 PRL-3 可能在细胞增殖中具有潜在功能。

据我们所知，prl-3 在脊椎动物发育过程中的表达模式及其异常上调的后果尚未被探索。本研究以斑马鱼为脊椎动物模型，通过整体原位杂交测定了 prl-3 在斑马鱼不同发育阶段的表达模式。有趣的是，过表达斑马鱼 Prl-3（zPrl-3）或人 PRL-3（hPRL-3）均导致脊索畸形，该表型酷似脊索瘤——我们又用脊索瘤特异性标志物对其进行了确证。PRL-3 在脊索瘤中作用的相关性，则由人 PRL-3 在临床脊索瘤标本中的免疫化学检出所支持。

二、材料与方法

2.1 鱼品系与饲养

斑马鱼（AB 品系）胚胎采集自中山大学附属第一医院临床与转化研究院的斑马鱼模式动物设施。鱼在循环水系统中饲养，光暗周期为 14 小时光照 / 10 小时暗，28.5°C，每日投喂三次。胚胎按受精后小时数（hpf）或受精后天数（dpf）在 28.5°C 下分期。

2.2 整体原位杂交与成像

斑马鱼 prl-3（zprl-3，即 ptp4a2a，蛋白酪氨酸磷酸酶 IVA 型成员 2a，Gene ID：449541）探针依据数据库（NM_001005583）设计以涵盖其 3'-UTR 区域。用 TRIzol 从斑马鱼胚胎中提取总 mRNA，用于第一链 cDNA 的逆转录。以一对引物（zPRL3-931F 与 zPRL3-1659R，见表 I）PCR 扩增斑马鱼 prl-3（zprl-3），克隆入 pGEM-T Easy 载体（Promega）并经测序确认。zprl-3 的 RNA 探针以地高辛-dUTP（DIG，Roche，货号 11277073910）体外转录标记，并按厂商说明纯化。Shh（sonic hedgehog）探针按既往方法使用（18）。编码 ntl（no tail）的质粒由新加坡分子与细胞生物学研究所 Vladimir Korzh 教授惠赠。胚胎以 4% 多聚甲醛（PFA，PBS 配液）固定过夜，随后用 PBST（0.1% Tween 配 PBS）清洗。胚胎随后依胚胎发育阶段经经验确定的时间用蛋白酶 K（Roche，货号 3115844001）处理。消化后胚胎再固定并用 PBST 清洗，再于 65°C 在 HYB 缓冲液（50% 甲酰胺、5× 标准柠檬酸钠、0.1% Tween-20、50 µg/ml 肝素、0.5 mg/ml 总酵母 RNA、9.2 mM 柠檬酸）中预杂交 2 小时。随后于 65°C 与相应地高辛-dUTP 标记探针（2 µg/ml）孵育过夜。移除探针后，胚胎于 65°C 依次用 100%、75%、50%、25% 甲酰胺（溶于 2× SSCT：15 mM 柠檬酸、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、pH 7.0）清洗，再以 0.2× SSCT 清洗。随后胚胎于 MABT 缓冲液（150 mM 马来酸、100 mM NaCl、0.1% Tween-20，pH 7.5）中孵育，并用溶于 MABT 的封闭试剂（Roche）封闭 2 小时。碱性磷酸酶（AP）偶联的抗 DIG 抗体（Roche，货号 11093274910）按 1:2,000 稀释后于 4°C 孵育过夜。随后用 PBST 清洗 4 次，并用 pH 调整的 Tris-HCl 显色缓冲液（0.1 M NaCl、5 mM MgCl₂、0.1 M Tris-HCl、0.1% Tween-20，pH 9.2）清洗 1 次。加入 nBT 与 BCIP（10 ml Tris-HCl 显色缓冲液中含 54 µl 50 mg/ml nBT 与 42 µl 75 mg/ml BCIP）启动显色，直至胚胎达到视觉上可接受的信噪比。显色后的胚胎使用装配于体视镜（Leica M205FA）上的 Leica DFC550 相机成像。图像对比度用 Photoshop CS 处理。

2.3 Northern blot 杂交

用 TRIzol（Life Technologies，货号 15596026）从相应发育时期的斑马鱼胚胎中提取总 RNA。10 µg RNA 经甲醛变性胶电泳并转印至尼龙膜（GE，货号 RPn303B），用 UV 交联仪固定。Northern 杂交按厂商说明（Roche，货号 12039672910）进行，所用地高辛标记的 zprl-3 反义探针与整体原位杂交中所用相同。

2.4 斑马鱼 PRL-3 的 5'RACE 及 mRNA 与质粒的显微注射

从 2 dpf 胚胎提取总 RNA。用 Ambion FirstChoice^® RLM RACE Kit 按厂商说明、以相应引物（表 I）进行 zprl-3 的 5'-RACE。斑马鱼与人 PRL-3 的编码区及其近端 5'UTR 片段用 iProof 高保真 PCR 试剂盒（Bio-Rad，货号 172-5331）扩增，并克隆入 pCS2 质粒以用于功能性 mRNA 合成。过表达实验中所用的阴性对照为斑马鱼 prl-3（zprl-3）与人 PRL-3（hPRL-3）的无义突变体，使用 QuickChange 定点突变试剂盒（Stratagene，货号 200518）获得。以 pCS2-zprl-3 与 pCS2-hPRL-3 为模板，按厂商说明制造 PRL-3 起始密码子点突变（ATG→TAG）。突变的引物亦见表 I。上述所有构建体均经 DNA 测序验证。功能性的 zprl-3 与 hPRL-3 mRNA 及其无义 mRNA 用 Message Machine 试剂盒（Ambion，货号 AM1340）合成。mRNA（75–100 pg）用 Microinjector（Warner PLI-100A）注入斑马鱼单细胞期胚胎。hPRL-3 的过表达通过在单细胞期斑马鱼胚胎中同时共注射编码 PEGFP-PRL-3（19）与 PEGFP 的质粒各 100 pg 实现。注入无义 mRNA 的胚胎作为正常对照。

2.5 Western blot 分析

收集斑马鱼胚胎，用预冷 PBS 清洗并用移液器反复吹打以去除卵黄。15 个胚胎在含蛋白酶抑制剂的裂解液中于冰上裂解 1 小时。随后裂解物于 4°C 离心，上清收集。等量蛋白经 SDS-PAGE 分离并转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Roche，货号 03010040001）。转印后的膜在 5% 脱脂奶粉中封闭 1 小时，然后于 4°C 与一抗孵育过夜。之后膜于室温与二抗孵育 1 小时。信号用增强化学发光系统（ECL，Millipore，货号 WBKLS0500）按厂商说明检测。由于斑马鱼 PRL-3 与人 PRL-3 具有很高的同源性，此处使用人 PRL-3 单克隆抗体（克隆株 318）检测斑马鱼 PRL-3 的过表达，方法同既往文献（4）。

2.6 H&E 染色

胚胎经 PFA 固定、石蜡包埋，用 Leica 切片机（RM2135）切成 5 µm 厚度切片。随后在新鲜二甲苯中脱蜡两次、每次 15 分钟。所有切片依次用 100%、95%、80%、75% 乙醇与水进行梯度复水，之后苏木精染色 2 分钟。染色切片以蒸馏水冲洗，并在 1% 酸性乙醇（1% HCl 配 70% 乙醇）中短暂浸染。处理后的切片立即用伊红溶液染色 10–30 秒，随后依次用 75%、80%、95%、100% 乙醇脱水。切片以二甲苯透明，中性树胶封固后镜下成像（Zeiss Axio Imager Z1）。

2.7 免疫组织化学（IHC）

IHC 实验采用 PRL-3 单克隆抗体（克隆株 318）（4）检测中山大学附属第一医院收集的临床脊索瘤标本中的 PRL-3 表达。临床脊索瘤标本经福尔马因固定、石蜡包埋并切成 5 µm 切片。切片于 60°C 烘烤 1 小时，然后在二甲苯中脱蜡 10 分钟，此步骤重复两次。处理后的切片用 100%、95%、80%、75% 乙醇与 PBS 复水，随后在 0.01 M 柠檬酸钠缓冲液中于 95°C 进行抗原修复 15 分钟。切片冷却后用 PBS 清洗 3 次，在 3% H₂O₂ 中孵育 10 分钟，再以 PBS 清洗数次。处理后的切片在 10% 山羊血清中封闭 2 小时，然后于 4°C 与按 1:200 稀释的 PRL-3 抗体孵育过夜。以 PBS 冲洗后，切片于室温与二抗孵育 30 分钟。以 3,3-二氨基联苯胺（DAB）实现显色。反应以水终止，切片以中性树胶封固，使用 Zeiss Axio Imager Z1 显微镜观察与成像。

三、结果

3.1 PRL-3 在斑马鱼中的表达模式

在演化上，正交基因之间的序列同一性强度与其功能的保守性相互平行。数据库检索鉴定出斑马鱼 Prl-3，发现其与人源正交物具有 90% 的蛋白同一性（图 1A），提示二者在脊椎动物发育过程中可能具有相似功能。因此，理解 prl-3 在斑马鱼中的动态表达模式，有助于领会其在哺乳动物中的生理作用。研究以 zPrl-3 反义地高辛标记探针，通过整体原位杂交（ISH）检测 prl-3 在斑马鱼发育过程中的表达模式。斑马鱼 prl-3 转录本在胚胎发育的8 细胞期即被检出（图 1B），提示 prl-3 是一种母源表达的转录本。自 12 hpf（图 1C）至 24 hpf（图 1D），prl-3 mRNA 在整个胚胎中持续泛表达，提示 prl-3 在胚胎发生最初 24 小时具有普遍重要性。自 48 hpf 起检测到组织限制性表达，此时斑马鱼 prl-3 富集于脑（br），提示其参与神经发生（图 1E）。prl-3 转录本的其他表达位点还包括消化道（dt）、肌肉（mu）与血管（ve）（图 1E）。从 72 hpf 到 96 hpf，表达持续收窄，此时 prl-3 mRNA 集中于特定器官，包括食道（es）、脊索（no）、血管（ve）与肠道（in）（图 1F、G），提示其可能参与这些器官的器官发生。从 48 hpf（图 1E）到 96 hpf（图 1F、G），消化道中持续可检出 prl-3 转录本，提示其在消化系统发育中具有重要作用。至 96 hpf，prl-3 转录本限于斑马鱼肠道与胃的内皮（图 1H–J）。96 hpf 时在肝脏（li）中亦可检出痕量 prl-3 转录本（图 1G）。本文的 ISH 结果清楚地记录了 prl-3 在发育中组织的动态表达。这些从 24 hpf 到 96 hpf 的 prl-3 mRNA 表达动态变化，另经 Northern 杂交加以验证。Northern blot 各泳道下方标注了所测发育时期的相对表达值。计算结果显示，随胚胎发育推进，prl-3 转录本逐渐减少（图 1K），与 ISH 观察一致。

图 1 ｜ 斑马鱼胚胎发育过程中 prl-3 转录本的动态表达模式。（A） 人源与斑马鱼 PRL-3 蛋白的氨基酸序列比对，相同氨基酸以红色标出。（B–G） 以 prl-3 特异性反义探针对斑马鱼胚胎进行整体原位杂交所显示的 Prl-3 mRNA 表达模式：8 细胞期（B）、12 hpf（C）、24 hpf（D）、48 hpf（E）、72 hpf（F）与 96 hpf（G）的典型侧视图。（H）自 96 hpf 胚胎剥离的肠道原位杂交。（I）整胚肠道中 Prl-3 表达的背侧视图；虚线标示（J）中斑马鱼幼鱼的横切位置。（J）96 hpf 胚胎横切肠道的原位杂交。（K）野生型胚胎在 24、48、72、96 hpf 的 Northern blot 分析，各泳道下方标注 prl-3 mRNA 水平与 18S RNA 水平之比。es，食道；dt，消化道；he，头部；in，肠道；li，肝脏；no，脊索；ve，血管。

3.2 斑马鱼 PRL-3 过表达诱导脊索畸形

prl-3 mRNA 的动态表达模式提示它在胚胎发育中受调控的角色。要回答在发育期间扰动 prl-3 剂量会产生什么后果，最直接的办法就是在斑马鱼胚胎中造成 prl-3 的过度表达。为此，我们把斑马鱼 prl-3 mRNA 显微注入单细胞期胚胎，并观察其对胚胎发育的影响。对照群注射的是 prl-3 无义 mRNA（通过将 ATG 突变为 TAG 而来）。由于斑马鱼 PRL-3 与人 PRL-3 同源性很高，故使用人源抗体检测该蛋白。Western blot 分析支持了显微注射的 prl-3 mRNA 成功被翻译为 PRL-3 蛋白——与野生型或注射无义对照 mRNA 相比，其 PRL-3 蛋白水平最高（图 2A）。随后在 12、24、30、50 与 96 hpf 追踪发育畸形。畸形特征为脊索内及其周围出现异常的细胞增殖。究结果表明，对照胚胎的脊索细胞整齐排列成列（图 2B-a、a' 与图 3A、A'），而在 PRL-3 过表达（OE）胚胎中则一致观察到团块状畸形（图 2B-b、b'、c、c' 与图 3B、B'、C、C'、D、D'）。统计分析证实，PRL-3 过表达胚胎与对照组之间脊索异常的发生率差异具有统计学意义（表 II）。此外，2 dpf 时 PRL-3 OE 胚胎的 H&E 染色证实畸形脊索附近存在异常的细胞增殖，与正常对照脊索细胞形成鲜明对比（图 4A、B）。而在 PRL-3 OE 胚胎中为大型空洞化上皮细胞，沿初级轴规则排列（图 4C–H 黑框所示）。综上，我们观察到的脊索畸形可能是源自胚胎脊索残余、起源于轴向骨骼的典型脊索瘤样恶性肿瘤表型（20）。

图 2 ｜ PRL-3 过表达在斑马鱼发育中诱导脊索畸形。（A） 正常斑马鱼（WT）、prl-3 过表达（OE）与无义 mRNA 显微注射斑马鱼（对照）中 Prl-3 的 Western blot，以 Tubulin 作为上样对照。（B） prl-3 过表达诱导斑马鱼脊索畸形。展示过表达（OE）胚胎（b、b'、c、c'）的代表性侧视图（48 hpf 明场），左栏每个高亮区域在右栏以更高倍放大显示；对照组胚胎为（a、a'）。

图 3 ｜ prl-3 异位表达所致的脊索畸形。（A–C） 48 hpf 胚胎在暗场下的代表性图像。侧视对照组胚胎（A、A'）与过表达（OE）胚胎（B、B'、C、C'、D、D'）。左栏标注区域在右栏相应放大显示。

图 4 ｜ PRL-3 过表达所致脊索畸形的病理分析。（A、B） 对照胚胎脊索的 H&E 染色；（C–H）prl-3 过表达胚胎（2 dpf）异常脊索的 H&E 染色。（B、D、F、H）为左栏整体胚胎图中高亮部分的放大图，右栏相应显示。

3.3 PRL-3 过表达所致的脊索畸形即脊索瘤

斑马鱼脊索是胚胎中线结构，在脊椎动物发育中起结构作用（21），而 shh 被用作早期斑马鱼胚胎中脊索的分子探针（22-25）。为阐明所观察到的脊索畸形是否源于脊索增殖，我们以 shh 反义探针进行了 ISH。结果显示，在对照群体中未检出异位 shh mRNA 表达（图 5A-a~c）；然而在畸形脊索区域观察到 shh mRNA 的富集，且在 2、3、4 dpf 的各个发育阶段均一致可见（图 5A-d~i）。上述结果提示所观察到的异常细胞增殖源于未成熟、未分化的脊索细胞。

鉴于脊索瘤发生于早期胚胎的脊索残余，公认的脊索瘤表型即为脊索中 shh 阳性细胞的积聚。在斑马鱼中，Ntl（no tail）作为标志性转录因子，通常表达于未成熟脊索中（26-28），而 ntl 的持续表达则支持未成熟脊索以肿瘤形式扩张，这与临床脊索瘤以 Brachyury 为特异性生物标志物的诊断实践相一致（29,30）。由于斑马鱼 ntl 与 brachyury 是正交同源基因，后者已在小鼠中评估过（26,31,32），我们遂以斑马鱼 ntl 探针进行 ISH，以明确 prl-3 mRNA 过表达所致的表型是否为脊索瘤。结果显示，在对照胚胎中随着脊索细胞空洞化，ntl 在脊索中的表达逐渐消失（图 5B-a~c）。相反，我们在 3 dpf 的 PRL-3 过表达样本中观察到 ntl 表达的维持，且在脊索畸形区域检出的异位细胞团至 4 dpf 全部呈 ntl 阳性（图 5B-d~i），支持脊索瘤表型。以 shh 与 ntl 双探针，我们的结果确证了胚胎发育期间 PRL-3 过表达所致的脊索异常即由脊索瘤所致。

图 5 ｜ 以 shh 与 ntl 表达原位杂交鉴定脊索畸形为脊索瘤。（A） 对照胚胎中 shh 的整体原位杂交：2 dpf（a）、3 dpf（b）、4 dpf（c），与 prl-3 上调（OE）所致脊索畸形中的 shh：2 dpf（d、g）、3 dpf（e、h）、4 dpf（f、i）对比。箭头指示 shh 阳性的脊索畸形区域。（B） 对照胚胎中脊索瘤特异性 ntl 的整体原位杂交：2 dpf（a）、3 dpf（b）、4 dpf（c），与 prl-3 上调（OE）所致脊索畸形中的 ntl：2 dpf（d、g）、3 dpf（e、h）、4 dpf（f、i）对比。箭头指示 ntl 阳性的脊索畸形区域。标尺均为 500 µm。

3.4 人类同源 PRL-3 过表达同样在斑马鱼中导致脊索瘤

我们已证明斑马鱼 Prl-3 过表达可在斑马鱼胚胎发育早期启动脊索瘤。为检验人源正交物过表达是否导致类似结果，我们将人 PRL-3 mRNA 显微注入单细胞期胚胎。注射人 PRL-3 无义 mRNA 的群体作为反映内源 PRL-3 水平的对照。此外，编码 eGFP-PRL-3（EGFP-PRL-3）（19）与 eGFP 单独的质也被显微注入斑马鱼胚胎的单细胞期，以上调 hPRL-3 表达。Western blot 结果确认了外源人 PRL-3 RNA（图 6A）以及 GFP-PRL-3（图 7A）在注射胚胎中成功表达，而对照中 PRL-3 水平与未注射的野生型相当。注射后 30 小时即可观察到脊索畸形胚胎，其外观与 zPrl-3 过表达所致者相似。脊索变形表型的注射胚胎实例摄于注射 PRL-3 mRNA 后 48 小时（图 6B）或 GFP-PRL-3 质粒注射后 48 小时（图 7B）。统计分析显示，无论通过 PRL-3 mRNA 注射还是质粒注射过表达 hPRL-3，均能显著诱导脊索畸形，与对照群相比差异有统计学意义（表 II）。这一现象揭示出人 Prl-3 与斑马鱼 PRL-3 在诱导脊索发育扭曲上的功能保守性。此外，由人 PRL-3 过表达所致的异常脊索，经 ISH 以 shh 与 ntl 探针确认为脊索细胞的异常增殖——即脊索瘤的定义性特征（图 8A、B）。最重要的是，通过免疫组化（IHC）分析，在数例临床脊索瘤标本中检出了 PRL-3（图 8C），进一步支持 PRL-3 作为脊索瘤的预测标志物与治疗靶点。

图 6 ｜ 人 PRL-3 过表达同样在斑马鱼中诱导脊索畸形。（A） 斑马鱼中（WT）、PRL-3 过表达（OE）与无义 mRNA 显微注射斑马鱼（对照）中人 PRL-3 的 Western blot，以 Tubulin 作为上样对照。（B） 人 PRL-3 过表达在斑马鱼中诱导脊索畸形。展示人 PRL-3 过表达（OE）胚胎（b、b'、c、c'）的代表性侧视图（48 hpf 明场），左栏每个高亮区域在右栏以更高倍放大显示；对照组胚胎为（a、a'）。

图 7 ｜ 人 GFP-PRL-3 过表达所致的脊索畸形。（A） 以 Western blot 检测斑马鱼中人 GFP-PRL-3 的过表达，以 Tubulin 作为上样对照。（B） 48 hpf 胚胎的代表性图像（明场）。侧视对照组胚胎（a、b）与过表达（OE）胚胎（c–f）。标注目录区域在下方相应放大显示。箭头指向脊索畸形区域。

图 8 ｜ 确认人 PRL-3 过表达所诱导的脊索瘤。（A） 对照胚胎中 shh 的整体原位杂交：2 dpf（a）、3 dpf（b）、4 dpf（c），与 prl-3 上调（OE）所致脊索畸形中的 shh：2 dpf（d、g）、3 dpf（e、h）、4 dpf（f、i）对比。箭头指示 shh 阳性的脊索畸形区域。（B） 对照胚胎中脊索瘤特异性 ntl 的整体原位杂交：2 dpf（a）、3 dpf（b），与 prl-3 上调（OE）所致脊索畸形中的 ntl：2 dpf（c、e）、3 dpf（d、f）对比。箭头指示 ntl 阳性的脊索畸形区域。标尺长度 500 µm。（C） 临床脊索瘤标本中 PRL-3 上调的免疫组化分析，下排为放大图。

五、讨论

既往报道显示，PRL-3 通常表达于小鼠组织的心脏、骨骼肌与小肠（15,16），在人类胎儿心脏、骨骼肌以及骨髓的成红细胞前体中亦然（9,33）。然而近期一项报道显示，PRL-3 主要表达于斑马鱼的体节中（34）。为澄清这些混乱，我们研究了 prl-3 在斑马鱼中的动态表达模式，结果显示 prl-3 具有母源表达，并在斑马鱼发育早期呈泛表达（图 1B、C）。从受精后 2 到 4 天，胚胎发育推进伴随 prl-3 表达的进行性下降，但其表达仍保留在增殖活跃区域，包括前肠、食道、血管与脊索（图 1D–F）。因此，prl-3 在胚胎发育过程中是动态表达的。

鉴于 brachyury（ntl）在原肠胚形成开始时表达于斑马鱼脊索中，且最终 ntl 与 shh 表达会在脊索细胞空洞化时消失（26-28），我们的结果显示，在 PRL-3 过表达的斑马鱼中，ntl 与 shh 在变形脊索区域持续表达，进一步凸显了斑马鱼与人 PRL-3 过度表达对脊索畸形的影响（图 2B、4、6B）。我们进一步首次证明，这种脊索变形源于未成熟脊索细胞的异常增殖（图 5 与图 8A、B）。尽管斑马鱼胚胎中脊索瘤发作迅速，但所形成的肿瘤在组织学特征上与人类脊索瘤相似（20,35）。综上，我们的发现表明 PRL-3 可能在脊索发育中扮演重要角色，而 PRL-3 的异常表达因导致脊索细胞异常增殖而对斑马鱼胚胎发育有害。这提示 PRL-3 在脊索瘤形成中具有关键作用。

既往研究已将 PRL-3 表达增强与多种人类癌症的转移驱动因素及预后标志物联系起来（8,14,36）。在临床脊索瘤样本中检出高 PRL-3 蛋白表达（图 8C），则进一步提示 PRL-3 可作为脊索瘤诊断的特异性生物标志物。

六、结论

本研究首次系统刻画了 PRL-3 在脊椎动物胚胎发育中的表达模式，并证明其异常过表达足以在早期发育中启动脊索瘤：斑马鱼与人源 PRL-3 的过表达均导致脊索畸形，病理学形态与 shh/ntl 双标志物检测共同证实该畸形为脊索瘤；临床脊索瘤标本中 PRL-3 抗原的检出，则将这一发育生物学发现锚定到了临床相关性上。对脊索瘤这一罕见、缺乏有效治疗的实体瘤而言，本研究最直接的启示在于：PRL-3 不仅是肿瘤转移的"伴随标志物"，更可能是疾病发生的早期驱动因子，因而具备作为预测标志物与治疗靶点的双重价值。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。