原文信息

Kugler EC, Frost J, Silva V, Plant K, Chhabria K, Chico TJA, Armitage PA.Zebrafish vascular quantification: a tool for quantification of three-dimensional zebrafish cerebrovascular architecture by automated image analysis.Development, 2022, 149: dev199720. DOI: 10.1242/dev.199720

英国谢菲尔德大学 ｜ The Bateson Centre ｜ Insigneo 计算医学研究所 ｜ 赫尔约克医学院

收稿：2021-04-21 ｜ 接受：2021-12-17 ｜ 开放获取（CC BY 4.0）

斑马鱼胚胎透明、血管转基因品系齐全，再配上能把整条血管"一网打尽"的光片显微镜——听上去，脑血管发育研究是天时地利。

但现实是：大多数论文最后只能甩出一张"代表性图"，配一句"处理组血管明显变少"。至于到底少了多少、哪里少了、个体差异多大——没人说得清。原因很硬核：一条胚胎的光片数据约 3.5 GB，其中只有 3–15% 的体素是血管，血管直径仅 5–20 µm，还互相叠影。

这篇 2022 年发表在 Development 的论文（Techniques and Resources 专栏）给出的答案是 ZVQ：第一个开源的斑马鱼脑血管 3D 定量流程——配准、画"群体平均图"、一键算出 8 项参数，全部在免费的 Fiji 里跑。

结论速览

• 自动配准 > 人工配准：变异系数（CoV）从 81–84% 压到 18–38%，每组只需框一次 ROI。

• 8 项参数：相似度（Dice）、体积、表面积、密度、网络长度、分支点、半径、Sholl 复杂度。

• 2–5 dpf 发育中，体积、长度、分支点显著增加，而半径与复杂度不变——血管在"长多"，不在"长粗"。

• 13 种条件（发育、无血流、6 种药物、6 个 morpholino）聚类成 4 大类，药物作用机制"一图分层"。

• 两个新发现：后脑平均血管半径比中脑大（主要是基底动脉撑的）；2–5 dpf 脑血管高度左右对称。

代码、GUI、示例数据、逐步文档全部开源——不会写代码也能用。

摘要

斑马鱼转基因品系与光片荧光显微术（LSFM）让我们得以深入窥探三维血管发育的体内过程，但脑血管的 3D 定量仍极具挑战。本文描述并检验了一个名为 ZVQ 的图像分析流程：它首次实现了基于解剖标志或物体的斑马鱼脑血管样本间配准，生成群体平均图（PAM），快速评估组内与组间血管解剖；并从用户指定的 ROI 中提取体积、表面积、密度、分支点、长度、半径与复杂度等参数。在 13 种实验条件（胚胎发育、药物处理、morpholino 敲低）上的应用表明 ZVQ 稳健可靠、能检出生物学相关的血管改变并带来新认识。ZVQ 是第一个开源的斑马鱼脑血管 3D 结构定量方法。

一、脑血管定量，到底难在哪？

先算一笔账。3 dpf 斑马鱼的脑血管横向约 600 µm、背侧轴向约 280 µm，血管直径 5–20 µm、管壁仅 1 µm。想看清，就得用 0.33×0.33×0.6 µm 的体素去采——一条胚胎约 3.5 GB，多通道、多时间点、多视角之后指数级膨胀。

更难受的是，这 3.5 GB 里只有 3–15% 的体素属于血管。分析算法一不小心就会"学偏"，把背景当主角。所以大部分研究退而求其次：先靠眼睛挑表型，再挑几根血管手工量——偏向显眼表型、耗时、且其余血管的信息全丢。

ZVQ 的底气来自作者团队之前验证过的分割方法（Sato 增强＋Otsu 阈值），它能把"双峰"管腔和"单峰"无腔血管一并填实分割。在可靠的分割之上，才谈得上定量。

图 1 | ZVQ 流程概览

A 工作流：原始图像（On）→ 运动校正 → Sato 增强（En）→ Otsu 分割（Sen）→ 配准到模板胚胎（Ren）→ 生成群体平均图（PAM）→ 指定 ROI 后定量体积（Vn）、表面体素（An）、密度（ρn）；欧氏距离图（EDMn）与血管骨架（Skn）结合给出半径（Rn）、网络长度（Ln）、分支点（BPn）与 Sholl 复杂度（Cn）。

B 8 项血管参数的示意：相似度、体积、表面积、密度、网络长度、分支点、半径、复杂度。

二、先拿发育"试刀"：2–5 dpf 血管怎么长？

把 2、3、4、5 dpf 各 6 条胚胎两两配准后，作者发现了第一件有趣的事：自动配准完胜人工标志配准——3 dpf 组的 Dice 相似度从"无差异"变成 P<0.0001，CoV 从 84% 掉到 26%。配准之后，全组共用一个 ROI，人工操作也从"每条鱼框一次"降到"每组框一次"。

PAM（群体平均图）一眼就能看出哪些血管是"标准件"：原始中脑管道（PMBC）、原始后脑管道（PHBC）、中脑静脉、中央动脉这些神经周血管高度保守；而后脑血管随发育逐渐扩张、中央动脉越生越多。

参数定量给出了很有味道的答案（每组仅 6–15 条鱼）：

• 显著增加：体积（P=0.0008）、网络长度（P<0.0001）、分支点（P=0.0082）。

• 不变：表面积、密度、平均半径、Sholl 复杂度。

翻译一下：这几天的脑血管在"长多、长密"，不在"长粗、长复杂"——哪怕样本量这么小，ZVQ 也能把差异抓出来。

图 2 | ZVQ 用于分析 2–5 dpf 的血管生长

A–C 配准前、人工配准后、自动配准后的深度编码重叠 MIP（紫色腹侧、白色背侧）——自动配准的重叠最好。

D 两种配准在各时间点均显著提高 Dice 系数（^****P<0.0001）。

E–K 八项参数的 2–5 dpf 变化：体积（E，P=0.0008）、网络长度（H，P=0.0001）、分支点（I，P=0.0082）显著增加；表面积（F）、密度（G）、平均半径（J）、复杂度（K）无显著变化。均值±s.d.

三、两场"压力测试"：停血流 & 微量药物

压力测试一：停掉血流。用 tnnt2a morpholino 让心脏不跳、血流消失。PAM 显示：对照组里 PMBC 位置、中脑血管格局高度可重现，而 tnnt2a morphant 的相似度崩了，连头都变小了——但耐人寻味的是，基底动脉（BA）和 PHBC 的"刻板格局"在无血流时依然保守。定量上，除密度外的全部 8 项参数中 7 项显著下降。这是一个早已发表、但从未被量化过的表型，ZVQ 一次把"效应量"补齐了。

压力测试二：2 小时 VEGF 抑制。4 dpf 用 250 nM AV951 只泡 2 小时——PAM 上肉眼完全看不出差别。但定量一算：体积、表面积、分支点、网络长度、平均半径全部显著下降（P=0.0004–0.0371）。

这两场测试合起来说明了同一件事：ZVQ 的灵敏度下限，比人的眼睛低得多。

图 3 | 血流缺失使脑血管减少

A 未注射对照 / 对照 MO / tnnt2a MO 的平均 MIP：蓝箭头＝PMBC 格局，青色虚线＝头部尺寸（PMBC′–PMBC″），绿箭头＝BA，品红箭头＝PHBC。tnnt2a MO 中格局相似度与头部尺寸下降，但 BA 与 PHBC 保守。

B Dice 系数显著下降（^****P<0.0001）。

C, D, F, G, H, I 体积、表面积、分支点、网络长度、平均半径、复杂度均显著下降（P=0.0019–0.0092）。

E 唯一例外：血管密度无显著变化——血管整体缩了，但"密度"保持不变。均值±s.d.

图 4 | 短时 VEGF 抑制降低血管拓扑参数

A 对照与 AV951 的平均 MIP：目视无差别（蓝箭头＝PMBC，青虚线＝头部尺寸，绿箭头＝BA，黄箭头＝CtAs，品红箭头＝PHBC）。

B Dice 系数无显著差异。

C, D, F, G, H 体积（P=0.0014）、表面积（P=0.0010）、分支点（P=0.0016）、网络长度（P=0.0004）、平均半径（P=0.0371）均显著下降。

E, I 密度与复杂度无显著变化。均值±s.d.

四、13 种条件，一张图分出"四个帮派"

真正体现 ZVQ 通量的一步：把 13 种条件（无血流、6 种药物、6 个 morpholino）的全部参数变化汇总成百分比差异矩阵，再做聚类分析——不同机制的干预自动"物以类聚"：

几个值得咀嚼的点：notch1b 敲低在脑和躯干一样"无事发生"（功能保守）；ccbe1 缺陷与它在淋巴管生成中的经典角色一致；而 dll4 敲低让脑血管变少——与它在躯干里的"促过度生成"角色相反，提示 Dll4 可能有一套被忽视的脑血管特异功能。另外，jag1a 与 jag1b 这对基因组加倍留下的旁系同源基因，敲掉谁都只是"轻度"缺陷——同时敲掉会怎样，值得期待。

图 5 | 血管参数定量与聚类分析

A 13 种条件下 8 项参数均值的百分比差异热图（对照 MO→MO，未处理→处理）。tnnt2a、dll4、Latrunculin B 等条件整列"变红"（下降），Notch 抑制等条件偏向"变绿"（上升）。

B 聚类树：四大类——①抗血管因子抑制；②细胞状态改变；③严重血管新生缺陷；④促血管因子抑制。机制不同的干预按"最终血管结局"自动归队。

五、显微镜下的新发现：后脑更"粗"，左右更"对称"

把 ROI 缩小到脑区级别，ZVQ 挖出了两个此前没人量过的答案：

• 中脑 vs 后脑：长度、分支点、体积都差不多，唯独后脑的平均血管半径显著更大（P=0.0008）——追下去发现，"元凶"是那根粗壮的基底动脉（BA）。一个区域性的解剖学结论，就此从"感觉"变成了数字。

• 左 vs 右：网络长度、半径、连接点、体积全部无显著差异；镜像分析进一步显示外周/神经周血管在 2–5 dpf 高度左右对称。

不过作者也坦白了两处"未尽事项"：左右血管的 Dice 系数其实很低——总量对称≠逐根对称，血管格局里藏着不少随机性；而单根血管的自动提取与标注依然缺工具——目前靠人工标注一条鱼约需 8 小时。

另一个有意思的提示：斑马鱼脑血管是一个封闭系统（与人脑血管树不同），局部的打击（比如中风）很可能会转化为全局性的后果——这让 ZVQ 天然适合做这类"全局响应"的研究。

图 6 | 区域相似性与左右对称性比较

A–E 中脑（虚线）vs 后脑（实线）：网络长度、连接点数、体积无差异，后脑平均血管半径显著更大（C，P=0.0008）——主要由基底动脉贡献。

F–J 右半球 vs 左半球：网络长度、半径、连接点数、体积均无显著差异。

K–P 左右对称性分析流程：选左右体轴 → 旋转 → 镜像右半球 → 按体素多数决取重叠（Q，白＝重叠）→ 量化。

S–V2–5 dpf 外周/神经周血管高度左右对称；颅血管体积（T，****P<0.0001）与网络长度（U，*P=0.0194）随发育增加，但左右均无差异；左右间 Dice 系数虽低（V），说明总量对称之下的逐根差异客观存在。

六、人人可用：开源、GUI、带文档

这篇论文发表在 Development 的 "Techniques and Resources" 专栏——定位就是"方法工具"。为了让没有计算背景的实验室也能上手，作者做了五件事：

• 全部功能打包成一个 Fiji Macro：免费、跨平台、模块化，想跑几步跑几步。

• 图形界面（GUI）：下拉框选步骤，零代码。

• 代码发布于 GitHub，附逐步文档（每步的输入输出都讲清楚），第一作者长期维护、他人可自由改编。

• 提供示例数据，先试跑再上自己的数据。

• 纳入审稿人与用户反馈持续改进。

作者也列出了改进空间：分割可以靠无色素品系或多视角融合再优化；配准可以尝试迭代配准或针对稀疏血管定制的高阶变换；未来配合不同年龄/表型的脑图谱与血管图谱，才能真正做到"单根血管级"的自动分析。

一句话点评

血管生物学长期有个尴尬：成像技术跑在定量能力前面——大家都拍得出 3.5 GB 的漂亮数据，却大多只能"看图说话"。ZVQ 把"看图说话"升级成"人口普查"：配准让个体与组站到同一坐标系，PAM 把保守区与可变区亮在明处，8 项参数把表型变成可统计的数。

它最锋利的一点，是那组"眼睛看不见、ZVQ 看得见"的结果——2 小时 VEGF 抑制就能量出显著性。方法学的灵敏度，直接决定了实验设计的自由度；何况这次还是全开源。做斑马鱼血管表型的实验室，值得一试。

译者说明：本文为学术论文中文译稿之导读与图解版，仅用于学习与学术交流；所有实验数据、结论与观点均归属原作者（Kugler et al., Development 2022;149:dev199720），如需引用请以英文原文为准。

图片来源：原文图 1–6（© 2022. Published by The Company of Biologists Ltd，CC BY 4.0）。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。