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Gong B, Li Z, Xiao W, Li G, Ding S, Meng A, Jia S. Sec14l3 potentiates VEGFR2 signaling to regulate zebrafish vasculogenesis.Nature Communications, 2019, 10: 1606. DOI: 10.1038/s41467-019-09604-0

清华大学生命科学学院 ｜ 膜生物学国家重点实验室 ｜ 清华-北大生命科学联合中心

2019-04-15 发表 ｜ 开放获取（CC BY 4.0）

VEGF-VEGFR2 通路是血管发育的"总开关"，几乎所有血管生物学教科书都会讲到它。但有一个角落长期没人细看：VEGFR2 内化进入细胞后，怎么才能在"路过"磷酸酶的枪林弹雨时保住自己的磷酸化？

这篇 2019 年发表在 Nature Communications 的研究给出了答案。主角是 Sec14 样磷脂酰肌醇转运蛋白（PITP）家族的成员 Sec14l3——一类经典的"脂质搬运工"，却被抓到了一份新兼职：给 VEGFR2 当保镖，同时兼职推动它的"班车"（RAB 囊泡）。

斑马鱼 *sec14l3* 一缺，背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）的管腔就打不开；机制一层层剥下来，最后落在四个字母上：Y1175。

⚡ 结论速览

*sec14l3* 表达于动脉+静脉内皮祖细胞、随后局限于 PCV——时间窗正好对应血管发生（而非血管新生）。

敲低/敲除 → 动-静脉分离失败、DA/PCV 管腔变窄；机制是成血管细胞迁移与静脉祖细胞出芽受损。

VEGFa 刺激下 p-ERK/p-AKT 双双衰减；ca-MEK 只救 DA，ca-AKT 只救 PCV，共注射全救——动脉/静脉各吃一条下游分支。

精确到点：Sec14l3/SEC14L2 特异保护 VEGFR2-Y1175，防止其被 PTP1B 去磷酸化（Y1054/1059 不受影响）。

运输层面：与 VEGFR2 结合（偏好激活态）、与 RAB4A/5A 结合并促其 GTP 化 → 加速内吞与循环，缩短 VEGFR2 暴露给 PTP1B 的时间。

敲低 SEC14L2 → RAB5A/4A-GTP 掉一半以上 → VEGFR2 滞留晚期内体 → 信号衰减 → 管腔打不开。

摘要

VEGF 通过受体酪氨酸激酶调控血管发生，但 Sec14 样磷脂酰肌醇转运蛋白是否参与此过程鲜有研究。本研究发现斑马鱼 sec14l3 特异地参与动脉与静脉的形成——通过调控成血管细胞及后续静脉祖细胞的迁移。*sec14l3* 缺陷造成的血管缺陷可在受体或下游效应分子水平被部分挽救。生化分析表明，Sec14l3/SEC14L2 与 VEGFR2 物理性结合，特异地阻止其 Y1175 位点被近膜酪氨酸磷酸酶 PTP1B 去磷酸化，从而增强 VEGFR2 信号激活；同时二者与 RAB5A/4A 相互作用并促进其 GTP 结合态形成——这对 VEGFR2 的内吞运输至关重要。Sec14l3 通过调控 VEGFR2 的激活来控制斑马鱼的血管发生。

一、抓嫌疑人：sec14l3 长在哪儿？

作者从 24 hpf 的 Tg(*fli1a:EGFP*) 胚胎里 FACS 分选内皮细胞做转录组测序，在长长的高表达名单里盯上了 *sec14l3*。整胚原位杂交（WISH）显示：

• 19 hpf：动脉与静脉内皮祖细胞都有表达；

• 25 hpf 起：局限于后主静脉（PCV）隔室；

• 在没有躯干血管的 *etsrp* 突变体中表达消失——血管表达实锤。

这个时间窗的妙处在于：19–25 hpf 正是血管发生（从头造血管）的窗口，而不是血管新生（出芽扩张）。qRT-PCR 显示 *sec14l3* 在内皮细胞中的富集程度约 5 倍——和血管金标准 *kdrl* 一个量级。

跨物种检查：人 HUVECs 里没有 SEC14L3，但SEC14L2 有，而且约 28% 与内吞池的 VEGFR2 共定位、呈囊泡样分布——这颗"囊泡"伏笔后面要收。

图 1 | sec14l3/SEC14L2 表达于内皮细胞并与 VEGFR2 共定位

a WISH：*sec14l3* 在 19 hpf 表达于动脉+静脉祖细胞、25 hpf 局限于 PCV（NT 神经管、NC 脊索、DA 背主动脉、PCV 后主静脉、VC 血管索）。b *etsrp* 突变体（无躯干血管）中表达消失。c qRT-PCR：*sec14l3* 在内皮细胞中富集约 5 倍，与 *kdrl* 相当。

d HUVECs 免疫荧光：SEC14L2（绿）与 VEGFR2（红）在囊泡样结构上共定位（约 28%）。比例尺：a、b 100 µm；d 20 µm（放大 5 µm）。

二、拔掉嫌疑人：DA 和 PCV 的管腔打不开了

两个 morpholino（翻译阻断 tMO2＋剪接阻断 sMO）加一个 CRISPR 突变体，三条线交叉验证：

• 23 hpf：动-静脉分离失败——动脉与静脉祖细胞没能各自归位；

• 25–30 hpf：DA 与 PCV 管腔明显变窄；mRNA 共注射可挽救——特异效应确认；

• *p53* 突变背景 rescue ISV 缺陷 + 突变体表型分析，把 morpholino 的非特异 ISV 出芽问题和真正的血管发生缺陷干净地分开了。

机制上，高分辨率成像锁定两处细胞行为异常：成血管细胞迁移减少（14–16 体节期）＋静脉祖细胞从血管索的出芽减少（21–23 hpf）。特化（8 体节期）不受影响——细胞造得出来，但走不到位。

体外平行实验：HUVECs 敲低 SEC14L2，划痕愈合变慢、成管减少——内皮细胞迁移是共同的软肋。

图 2 | sec14l3/SEC14L2 为体内外的血管形成所必需

a,b 敲低导致动-静脉分离与管腔形成缺陷（白/黄括号＝DA/PCV；红箭号＝ISV 出芽）；c,e 管径统计；d CRISPR 突变体表型一致。f 成血管细胞迁移缺陷（*etsrp* WISH：中央箭头/外侧箭号）；g 静脉祖细胞腹侧出芽缺陷。

h,i HUVECs 敲低 SEC14L2：划痕闭合变慢、成管减少。比例尺 50 µm。

三、锁死通路：VEGF 信号掉线，还各救各的

VEGFR2 的两大下游分支——PLCγ/ERK 与 PI3K/AKT——在 SEC14L2 敲低的 HUVECs 里双双响应乏力；斑马鱼胚胎里的 p-Erk/p-Akt 也同步下降。但真正精彩的，是那个"一半一半"的挽救实验：

往 *sec14l3* morphant 里注射组成活性型（ca）MEK 与 AKT 的 mRNA：

• ca-MEK 单独 → 只恢复 DA（动脉）；

• ca-AKT 单独 → 只恢复 PCV（静脉）；

• 两者共注射 → DA 与 PCV 都恢复。

这不是巧合，而是经典发育生物学的回声：动脉命运靠 ERK/Notch，静脉命运靠 AKT 压制 ERK。Sec14l3 坐在信号的上游，两条分支同时缺油。

图 3 | SEC14L2/sec14l3 敲低减弱 VEGF 信号

a–c HUVECs Western blot 与统计：SEC14L2 敲低显著衰减 VEGFa 诱导的 p-ERK 与 p-AKT。d,e *sec14l3* 缺陷胚胎的 p-Erk/p-Akt 同步下降。

f,g 挽救实验：ca-MEK 选择性恢复 DA，ca-AKT 选择性恢复 PCV，共注射两者均恢复（g 上 DA、下 PCV 管径统计）。

比例尺 50 µm；ANOVA。

四、精确到点：Y1175，以及那个"橡皮擦"PTP1B

VEGFR2 胞内段有好几个磷酸化位点，各自负责呼 Different下游。Western blot 一跑，分辨率立现：

• Y1054/1059：不受影响；

• Y1175：显著下降——恰好是招募 PLCγ、连接两大分支的关键位点。

进一步的"身份互换"实验证明功能保守：把斑马鱼 Sec14l3 转进人 SEC14L2 敲低细胞，Y1175 磷酸化不仅恢复、还超额增强。而 co-IP 筛遍三个 VEGF 受体，只有 VEGFR2 胞质区能与 Sec14l3 强结合——特异到没朋友。

那 Y1175 为什么会掉？嫌疑"橡皮擦"浮出水面：近膜酪氨酸磷酸酶 PTP1B。三组实验完成闭环：

• SEC14L2 在，VEGFR2 与 PTP1B 的结合被削弱；

• PTP1B+SEC14L2 共敲低，Y1175 磷酸化比单独敲 SEC14L2 还高——橡皮擦一拿走，磷酸化立刻回弹；

• 在体验证：*sec14l3* morphant 里过表达 VEGFR2-cyto mRNA、或共敲低 *ptp1b*，DA/PCV 管径恢复（单独操作均无效）。

逻辑链完整：Sec14l3 保护 Y1175 不被 PTP1B 擦掉 → 信号保得住 → 管腔打得开。

图 4 | SEC14L2 敲低降低 VEGFR2 Y1175 磷酸化

a Western blot 全景：p-Y1054/1059 无变化，p-Y1175 显著下降（p-ERK/p-AKT 同步衰减）。b,c 定量统计。

d,e 功能保守性：斑马鱼 Sec14l3 转入人 SEC14L2 敲低细胞，恢复并增强 Y1175 磷酸化。t 检验与双向 ANOVA。

图 5 | 增强 Y1175 磷酸化可挽救 SEC14L2/sec14l3 缺失

aSec14l3 只与 VEGFR2 胞质区强结合（VEGFR1/3 不行）。b SEC14L2/Sec14l3 削弱 PTP1B-VEGFR2 相互作用。c,dPTP1B 共敲低使 Y1175 磷酸化回弹。

e–h 在体挽救：过表达 VEGFR2-cyto mRNA（e,f）或共敲低 *ptp1b*（g,h）均恢复 *sec14l3* morphant 的 DA/PCV 管径。比例尺 50 µm；ANOVA。

五、追问一层：Sec14l3 到底怎么"挡住"磷酸酶？

如果 Sec14l3 只是在膜边上"人肉挡子弹"，故事未免太简单。回想图 1d 的伏笔——SEC14L2 呈囊泡样分布、与内吞池 VEGFR2 共定位——作者顺势打开运输这扇门。表面生物素标记＋免疫染色＋循环实验三连测：

• 内吞变慢：诱导内吞后，敲低细胞的内化 VEGFR2 明显更少、与早期内体标记 EEA1 的重叠降低；

• 循环变慢：VEGFR2 回到质膜的速率显著下降；

• 滞留变多：VEGFR2 在晚期内体标记 RAB7⁺/CD63⁺ 区室中积累——卡在"仓库"里，没被降解、也没被送回岗位。

画外音：VEGFR2 停留越久、离膜越远，暴露给 PTP1B 的时间就越长——运输缺陷和磷酸化缺陷，在这里接上了头。

图 6 | SEC14L2 敲低扰乱 VEGFR2 的内吞与循环

a 生物素标记实验：内吞受损（***p<0.001）。b,c 免疫染色：内化 VEGFR2 减少、与 EEA1 重叠降低。d循环速率显著下降（±VEGFa）。

e,fVEGFR2 在 RAB7⁺/CD63⁺ 晚期内体中滞留积累——卡在仓库，既没降解也没回岗。比例尺 10 µm。

六、分子对接：保镖的"两只手"

生化层面，Sec14l3 的"手"被一只只摸了出来：

• 左手抓受体：内源 SEC14L2-VEGFR2 相互作用被 VEGFa 增强；与 WT-VEGFR2 的结合远强于激酶死突变体——只保"激活态"的 VEGFR2。结构域定位：Sec14 结构域负责抓受体。

• 右手抓班车：筛选四个 RAB，只有 RAB4A 与 RAB5A 能与 Sec14l3 强结合——正好对应"快速循环"与"早期内体"两条路线。结构域定位：CRAL-TRIO 与 GOLD2 结构域负责抓 RAB4A。

一只手把激活的受体按上正确的班车，另一只手催班车发车——这就是"保护伞"的结构基础。

图 7 | Sec14l3/SEC14L2 经互补结构域结合 VEGFR2 与 RAB4A/5A

a 内源相互作用（VEGFa 增强之）。b,c偏好 WT-VEGFR2（激活态）。d 结构域示意。eSec14 结构域抓 VEGFR2。

f只与 RAB4A/RAB5A 结合；g,h 内源验证；iCRAL-TRIO+GOLD2 结构域抓 RAB4A。

七、收官：RAB 的"点火开关"，和完整因果链

最后一锤：RAB 是 GTP 酶，"点火"与否取决于 GTP/GDP 状态。两个发现收束全篇：

• Sec14l3 偏好结合 GDP 态的 RAB5A/4A——像是在"点火前"就位（作者推测它可能通过招募 GEF 或搬运特定磷脂酰肌醇来促 GTP 化，而非自己做 GEF）；

• 敲低 SEC14L2，RAB5A-GTP 与 RAB4A-GTP 直接掉了一半以上——班车集体熄火，与前文内吞/循环缺陷严丝合缝。

把整条因果链串起来：

完整因果链

Sec14l3/SEC14L2（左手 Sec14 域抓激活态 VEGFR2 ＋ 右手 CRAL-TRIO/GOLD2 域抓 RAB4A/5A）→ 促进 RAB5A/4A 进入 GTP 活性态 → VEGFR2 加速内吞＋循环 → 受体快速离开质膜、缩短暴露给 PTP1B 的时间 → Y1175 磷酸化保住 → PLCγ/ERK 与 PI3K/AKT 满血激活 → 成血管细胞迁移与静脉祖细胞出芽正常 → DA 与 PCV 管腔打开，血管发生完成。

图 8 | Sec14l3/SEC14L2 促进 RAB5A/4A 激活

a,bSec14l3 偏好结合 GDP 态 RAB4A/5A（转染细胞与重组蛋白双重验证）。c,dSEC14L2 敲低使 RAB5A-GTP / RAB4A-GTP 下降 50% 以上。

e 工作模型：Sec14l3/SEC14L2 促进 RAB5A/4A 的 GTP 结合态，加速 VEGFR2 囊泡移向早期内体与循环内体，使 VEGFR2 免受 PTP1B 去磷酸化。

八、这项研究的价值

VEGFR2 的内吞与降解已有不少人研究，但能覆盖"内吞→回收→信号增强"完整链条的调控因子寥寥无几。Sec14l3 的特别之处在于两头兼顾：既管受体的"人身安全"（挡磷酸酶），又管它的"通勤班次"（推 RAB）。

对 PITP 家族而言，这也是一次教科书级的"跨界"：从脂质搬运工到受体信号调控者，把 PI 代谢与 RTK 内吞运输两条线拧在了一起。至于 Sec14l3 促 RAB-GTP 化的具体分子机制（招募未知 GEF？搬运特定磷脂酰肌醇？），作者坦诚尚待后续——这扇门后面的空间还很大。

最后别忘了那条发育生物学彩蛋：ca-MEK 救动脉、ca-AKT 救静脉——同一个受体、同一条通路的两个分支，在动脉与静脉里被命运各取所需。斑马鱼的透明，让这种"一半一半"看得清清楚楚。

译者说明：本文为学术论文中文译稿之导读与图解版，仅用于学习与学术交流；所有实验数据、结论与观点均归属原作者（Gong et al., Nat Commun 2019;10:1606），如需引用请以英文原文为准。

图片来源：原文图 1–8（© The Author(s) 2019，Springer Nature，CC BY 4.0）。

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