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期刊：Cell Death and Disease（《细胞死亡与疾病》，Nature 旗下期刊）

最新影响因子：12.2（2025 年度 JCR，2026 年 6 月发布）｜JCR 分区：Q1（Cell Biology 27/207）

中科院分区（2025）：大类·生物学 1 区（Top 期刊）；小类·细胞生物学 2 区

发表信息：Cell Death Dis (2024) 15:281｜收稿 2023-11-30，接收 2024-03-18

DOI：10.1038/s41419-024-06622-9

通讯作者：Nicola Facchinello、Francesco Argenton、Natascia Tiso（意大利帕多瓦大学 / 意大利国家研究委员会 CNR）

开放获取：CC BY 4.0

导读：线粒体 DNA 聚合酶 γ 的辅助亚基 POLG2 突变同样可致线粒体疾病，但相关模型一直非常匮乏。本研究用 CRISPR/Cas9 构建了首个斑马鱼 polg2 敲除品系，纯合突变体重现了人类 POLG 相关疾病的核心特征——mtDNA 大量耗竭、线粒体网络紊乱、肌肉心脏等高耗能组织病变与运动障碍，并且老药氯非铵（CLO）可部分"救命"。

摘要

人类线粒体 DNA 聚合酶 γ（Pol γ）是一种全酶，参与线粒体 DNA（mtDNA）的复制与维持，由催化亚基（POLG）和赋予持续合成能力的二聚体辅助亚基（POLG2）组成。POLG 或 POLG2 的突变会导致人类 POLG 相关疾病——一组孟德尔遗传的线粒体疾病，以 mtDNA 耗竭（MDD）或多重缺失积累为特征，表现为多器官缺陷，并常在年轻时导致过早死亡。

鉴于 POLG2 模型的匮乏，研究团队利用 CRISPR/Cas9 技术构建了稳定的斑马鱼 polg2 突变系（polg2ia304），该品系携带 10 个核苷酸的缺失，造成移码突变和提前终止密码子。与野生型同胞相比，polg2 纯合突变斑马鱼发育更慢、存活率更低，在幼体期之前即死亡。突变体表现出一系列与人类 POLG 相关疾病症状相当的表型，包括显著的 MDD、线粒体网络与动力学改变、线粒体呼吸减弱。组织学分析在高耗能组织中检出形态学改变，并伴有骨骼肌纤维的显著排列紊乱；与之对应，运动学检测显示幼体运动能力下降。值得注意的是，此前已被证明在 POLG 模型中有效的药物甲苯磺酸氯非铵（Clofilium tosylate，CLO），可部分挽救 Polg2 突变动物的 MDD。

总体而言，本研究结果证明斑马鱼是研究人类 POLG2 相关 POLG 疾病发病机制的有效模型，也是在 POLG2 相关类型中筛选 POLG 导向药物效力的合适平台。

引言

线粒体 DNA（mtDNA）耗竭综合征（MDS）是一大类以常染色体隐性或显性遗传为特征的遗传性疾病，在临床和遗传上均具高度异质性【1】。MDS 的共同特征包括：细胞生物能量受损、mtDNA 维持与复制异常，以及严重的 mtDNA 耗竭（MDD），最终导致高 ATP 消耗器官的功能障碍【2,3】。MDS 中受累最严重的组织包括脑、骨骼肌、肝、肾和肠。MDS 可由核基因突变引起，这些基因参与核苷酸生物合成（TK2、SUCLA2、SUCLG1、RRM2B、DGUOK、TYMP）、核苷酸转运（MPV17、SLC25A4/ANT1）或 mtDNA 复制（POLG、POLG2、SSBP1、TWNK、TFAM、LIG3、MGME1）【4】。近年来，线粒体融合也被证实参与 mtDNA 复制体的维持——多数由 OPA1 突变引起的融合过程异常同样导致 MDD【5】。此外，尚有少数 MDS 病例报道了其他基因突变，如 AGK、FBXL4、MRM2、SLC25A21、SLC25A10/DIC【4】。

在各种常染色体遗传的线粒体疾病中，与 mtDNA 聚合酶 γ（Pol-γ）功能障碍相关者最为常见、研究也最为深入。Pol γ 是迄今已知在动物线粒体中发挥功能的唯一复制性聚合酶【6】，对 mtDNA 复制与修复必不可少。人类 Pol γ 全酶由催化亚基 p140（由 15q25 位点的 POLG 编码）和辅助亚基 p55 的同源二聚体（由 17q24.1 位点的 POLG2 编码）组成【7】。POLG 催化亚基为 140 kDa 蛋白，兼具 5′→3′ DNA 聚合酶、3′→5′ 外切核酸酶和 5′ dRP 裂解酶活性；辅助亚基 POLG2 为 55 kDa 蛋白，以同源二聚体形式发挥紧密 DNA 结合与持续 DNA 合成的功能。HeLa 细胞研究显示，与单独的催化亚基相比，POLG2 亚基可使核苷酸掺入提高 50–100 倍，从而增强 Pol γ 的 DNA 持续合成能力【8】。此外，近期研究还发现 POLG2 能直接结合 DNA，为理解线粒体疾病中 POLG2 破坏相关的分子缺陷提供了新视角【9】。

人类 POLG 或 POLG2 突变导致一组孟德尔遗传的多器官线粒体疾病，统称为"POLG 相关疾病"【10】，特征为 mtDNA 多重缺失和/或耗竭。POLG 突变与一系列相互重叠的连续表型相关，包括 Alpers-Huttenlocher 综合征、儿童型肌-脑-肝病谱系、肌阵挛性癫痫伴肌病和感觉性共济失调、共济失调神经病谱系、心肌病，以及常染色体隐性/显性进行性眼外肌麻痹（arPEO 和 adPEO）【10】。迄今，携带 POLG2 突变的患者多诊断为 adPEO，可不同程度地伴随骨骼肌无力、共济失调、抑郁及多种神经感觉症状，且通常随年龄增长而加重。

目前针对 POLG 相关疾病的治疗均为非根治性，以对症为主。引人注目的是，甲苯磺酸氯非铵（CLO）在酵母、线虫和细胞模型【11】以及斑马鱼突变体【12】中均显示出改善 POLG 相关症状的效力。CLO 因其钾离子（K⁺）通道阻断特性被归为 III 类抗心律失常药【11】。CLO 是一种季铵盐化合物，其活性部位为 clofilium：由于带正电荷，clofilium 可嵌入钾通道、阻止 K⁺ 外流，从而干扰心脏动作电位三相期的复极化，延长不应期，产生抗心律失常效应。尽管这一机制已较明确，其在 polg2 突变背景下的适用性此前仍未被探索。

学界已采用多种模式生物研究 Pol-γ 功能障碍，包括酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫和小鼠。小鼠 Pol-γ 与人类全酶高度相似，是研究人类 POLG/POLG2 致病变异和 POLG 相关疾病的良好体系。然而，小鼠 POLG 敲除（KO）导致 mtDNA 几乎完全丢失并在成年前致死【13】；因此，尽管与人类遗传相似性很高，小鼠模型存在局限——Polg−/− 突变体在胚胎发生期即丧失活力【14】。相反，近期对斑马鱼（Danio rerio）的研究表明，斑马鱼是研究人类 POLG/POLG2 致病变异的宝贵模型：polg 突变斑马鱼可存活至幼体期，出现显著 mtDNA 耗竭、发育迟缓和线粒体质量减少，与人类患者的表现相似【12,15】。斑马鱼 Polg 蛋白与人类 POLG 高度保守（序列一致性 70%、相似性 79%）；Polg2 与人类同源蛋白一致性 50%、相似性 67%；且斑马鱼全酶的化学计量与人类聚合酶 γ 构象一致——一条 Polg 催化多肽与两个 Polg2 辅助亚基结合。与小鼠模型不同，斑马鱼 polg−/− 突变系已被证明能重现人类 POLG 相关疾病的许多特征【12,15】，如 MDD、生长迟缓和过早死亡。这些特点使斑马鱼成为研究 POLG 相关疾病临床特征、并评估潜在治疗化合物挽救能力的合适模式生物。

鉴于目前 Polg2 模型的匮乏，本研究旨在更深入理解 Polg2 功能障碍的后果，在体内揭示疾病进展的部分表型特征。具体而言，我们对一个新型斑马鱼 polg2 敲除品系 polg2ia304（第 4 外显子 10 个核苷酸缺失、导致提前终止密码子）进行了形态功能表征。该品系是首个斑马鱼 polg2 突变体，在 POLG 疾病建模方面具有潜在应用价值。

材料与方法（概要）

斑马鱼饲养：所有实验均遵循意大利及欧盟法规（2010/63/EU 指令），并获帕多瓦大学伦理委员会和意大利卫生部批准（授权号 D2784.N.DQT）。斑马鱼（雌雄 1:1）在标准条件下饲养（28.5 °C，12:12 光暗周期）；所用野生型品系包括 Tuebingen、Giotto 和 Umbria。线粒体活体成像使用线粒体表达转基因 Tg(Hsa.Cox8a:MLS-EGFP)ia301；缺氧信号评估使用 Tg(4xHRE-TATA:EGFP)ia21 报告基因品系；肝脏分析使用 Tg(lfabf:dsRed;elaA:EGFP)gz15 品系。所有实验中，杂合子交配后后代先分组、盲法分析，随后进行基因分型。

polg2 KO 突变系的构建与基因分型：用 CHOPCHOP 软件设计靶向 polg2 基因第 4 外显子的 sgRNA，将 Cas9 蛋白（280 ng/μL）与 sgRNA（68 ng/μL）注射单细胞期胚胎；F0 养至成体后，通过 F1 基因分型筛选生殖系传递，杂合子经 4 次外交叉去除非目标突变后再互交获得纯合子（F5 代）。polg2ia304 品系在第 4 外显子携带 10 个核苷酸缺失，导致移码和提前终止密码子：Polg2 蛋白在第 235 位氨基酸后发生改变，突变蛋白仅长 267 个氨基酸。PCR 产物经 3.5% 琼脂糖凝胶电泳区分三种基因型。

存活分析：杂合子互交获得的野生型、杂合子与纯合子幼鱼分缸同条件饲养，每 5 天计数各缸存活个体，并与预期孟德尔比例比较。

组织学与透射电镜（TEM）分析：受精后 20 天（dpf）幼鱼经 Bouin 液固定，梯度乙醇脱水、石蜡包埋，切 8 μm 切片，HE 染色后镜检。TEM 分析则用戊二醛/多聚甲醛固定、四氧化锇后固定、环氧树脂包埋，切 60–70 nm 超薄切片，醋酸铀与柠檬酸铅复染， Tecnai G2 电镜观察。

发育分析：在 3、6、20 dpf 测量各基因型个体体长（ImageJ），3 月龄成鱼麻醉后在坐标纸上测量。

mtDNA 与基因表达分析：分别于 6、20 dpf 收集幼鱼，qPCR 检测 mtDNA 相对含量（10 尾一组）；TRIzol 提取总 RNA 并逆转录，qPCR 检测基因表达。

行为学检测：使用 DanioVision 系统在 6、15、20 dpf 进行明暗交替运动检测；8 dpf 进行轻敲（tapping）刺激检测，统计 15 秒游动距离与尾鳍摆动反应。

心率、线粒体与膜电位分析：在 2、3、4、8 dpf 活体计数心率；利用 mitoGFP 转基因在共聚焦显微镜下评估线粒体质量与形态；以 TMRM 荧光探针评估线粒体膜电位（Δψ）。

线粒体代谢分析：用 Agilent Seahorse 细胞外通量分析仪测量 4 dpf 幼鱼的氧消耗速率（OCR）：依次加入寡霉素、FCCP、鱼藤酮+抗霉素 A，分别测定基础呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸和非线粒体呼吸。

氯非铵（CLO）处理：胚胎期处理为 2–6 dpf 暴露于 3 μM CLO 共 5 天（此前已证实 CLO 在 5 μM 以下无毒性），以能否挽救 mtDNA 含量下降为疗效指标；幼体期处理为 10–15 dpf 暴露于 2 μM CLO 共 6 天，以能否挽救运动表型为疗效指标。

统计分析：使用 GraphPad Prism；数据经 Shapiro–Wilk 正态性检验后，采用非配对 t 检验、单/双因素 ANOVA（Tukey、Games-Howell、Dunn 等事后检验）、Mann-Whitney、Kruskal-Wallis 及 χ² 检验等。结果以均值 ± SEM 表示，p<0.05 视为显著。

结果

1｜polg2 敲除斑马鱼可存活至幼体期，但无法进入幼鱼期

利用 CRISPR/Cas9 技术，研究团队构建了名为 polg2ia304 的斑马鱼突变系：其第 4 外显子携带 10 个核苷酸缺失，导致提前终止密码子（图 1A）。该 KO 突变连续外交叉五代，以稀释基因组中可能的非特异性损伤。存活分析显示，polg2ia304 品系在纯合条件下"幼体期可活、幼鱼期致死"：5–15 dpf 期间各基因型分布与预期的 25:50:25 孟德尔比例无显著差异，但到 20 dpf 时纯合突变幼鱼数量已显著低于预期，且仅有 1 尾 polg2ia304/ia304 个体存活到 30 dpf（早期幼鱼期）（图 1B）。正如预期，纯合突变体中 polg2 表达显著低于野生型同胞（图 1C），可能源于无义介导的 mRNA 降解；相反，其同源基因 polg 表达升高（p<0.05）（图 1D），提示存在遗传补偿——这是斑马鱼敲除中常见的现象【28】。

图 1　polg2ia304 品系的构建、存活与发育迟缓。（A）斑马鱼 polg2 基因结构示意及其 CRISPR/Cas9 编辑策略。（B）polg2ia304/ia304 个体无法存活至受精后 4 周（χ² 检验；3 dpf n=120、6 dpf n=115、12 dpf n=89、20 dpf n=70、25 dpf n=50、30 dpf n=46）。（C、D）polg2（C）与 polg（D）的 mRNA 水平检测；数据为三次独立实验的均值 ± SEM，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001。（E）20 dpf 野生型对照与纯合突变体、以及 90 dpf 野生型与杂合子的代表性体貌图像（标尺：上 2 mm，下 1 cm）。（F）野生型、杂合子与纯合子体长分析（Mann-Whitney 检验，****p<0.0001）。

2｜polg2 敲除影响斑马鱼生长

为进一步表征 polg2ia304 突变的宏观影响，研究者考察了体格发育差异：20 dpf 纯合突变体的体长显著短于野生型和杂合子同胞；而野生型与杂合子在 6、20、90 dpf 均无显著发育差异（图 1E、F）。

3｜polg2 敲除损害运动能力

骨骼肌是 POLG 患者受累最重的组织之一，因此研究者在明暗交替条件下检测了 6、15、20 dpf 幼鱼的运动行为。6 dpf 时，三种基因型对明暗转换诱发的运动模式几乎重叠（图 2A），总游动距离无显著差异（图 2B）。而在 15 和 20 dpf（图 2C、E），虽然三种基因型仍保留明暗反应，但 polg2ia304/ia304 突变体的总游动距离在 15 dpf（图 2D）和 20 dpf（图 2F）均显著低于野生型，提示其感觉能力保留、而运动反应进行性受损。轻敲刺激分析同样证实"感觉保留、运动受损"（图 2G、H）：突变体对最大轻敲刺激的平均反应显著低于野生型，说明外周感觉系统正常而运动系统受损。由此，研究者进一步探究代谢和/或结构改变是否是这些运动表型的基础。

图 2　运动分析评估的 polg2ia304 行为缺陷。（A、C、E）6、15、20 dpf 突变体在光刺激下的运动（白框为光照时间，灰框为黑暗时间）；分别统计 6 dpf（B）、15 dpf（D）、20 dpf（F）的平均总游动距离。数据来自 3 次独立生物学重复，均值 ± SEM；单因素 ANOVA+Tukey（B）或 Kruskal-Wallis+Dunn（D、F）；*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001。（G）8 dpf 时轻敲刺激对运动的影响（20 秒窗口内每秒刺激一次）。（H）纯合突变体对最大轻敲刺激的平均反应显著低于野生型和杂合子（Kruskal-Wallis+Dunn，*p<0.05）。

4｜polg2 敲除导致高耗能组织的组织学改变

为考察 polg2ia304 突变对纯合子组织结构的最终影响，研究者对 20 dpf 幼鱼进行了组织学分析。根据 ZFIN 数据库，polg2 在野生型成体组织中广泛表达，因此分析聚焦于高耗能器官：脑、心、骨骼肌、肝和肠——它们既是 POLG 相关疾病中常受累的组织，也是线粒体供能贡献最突出的组织。结果显示：突变体心脏小梁网络较野生型更薄、更稀疏（图 3A、C），心脏体积减小，但心率至 8 dpf 仍正常；骨骼肌肌纤维粗糙、排列紊乱（图 3B），且双折射检测提示该紊乱在 3 dpf 已可检出、并随发育加重。TEM 超微结构观察显示：心肌线粒体形态与嵴间距正常（图 3E、H、I）；而骨骼肌中肌原纤维失去特征性的对称排列并部分断裂（图 3D），线粒体出现异常嵴结构的比例显著升高（图 3F、G、J–L）——与野生型管状嵴均匀分布不同，突变体线粒体出现更宽的嵴间区域。此外，肝、肠未见病理异常，也未检出 6 dpf 肝功能衰竭迹象（与 polg 敲除显著肝缺陷不同）；脑组织学切片则显示突变体脑体积显著减小。

图 3　polg2 突变对高耗能组织的影响。（A、C）20 dpf 心脏组织对比：突变体心房（a）、心室（v）尺寸差异及小梁网络（t）异常（标尺 5 mm）。（B）20 dpf 骨骼肌 HE 染色：突变体纤维排列紊乱、肌节边界改变；箭头示肌纤维脱离（标尺 5 mm）。（D）骨骼肌 TEM：突变体肌原纤维排列异常（标尺 1 μm）。（E）心肌线粒体 TEM（标尺 500 nm）。（F、G）骨骼肌 TEM：突变体肌原纤维形态改变、线粒体嵴异常（黑色箭头）（标尺 500 nm）。（H–L）心肌/骨骼肌嵴间距、线粒体异常形态及宽嵴间区域定量（****p<0.0001）。

5｜polg2 敲除体线粒体网络异常、mtDNA 严重耗竭

利用 mito:EGFP 转基因在骨骼肌水平评估发现，polg2ia304/ia304 纯合子线粒体质量显著下降，有趣的是 polg2+/ia304 杂合子同样下降——提示单等位基因突变即足以影响线粒体质量。6 dpf 时，野生型荧光信号约为杂合子（p<0.05）和纯合子（p<0.0001）的两倍（图 4A、B）；骨骼肌线粒体成像显示线粒体网络缺陷（图 4A），提示融合与分裂过程未能正常进行。

鉴于 Polg 与 Polg2 蛋白在 mtDNA 耗竭中的核心地位，研究者检测了突变体的 mtDNA 含量：6 dpf 时纯合子已出现显著 MDD（p<0.005），而杂合子与野生型 mtDNA 正常（图 4C、D）；20 dpf 时纯合子 MDD 更为严重（p<0.005）（图 4E）。

6｜polg2 敲除下线粒体生物能受损、缺氧信号激活

为检验严重 MDD 是否导致线粒体代谢异常，研究者用 Seahorse 分析仪测量氧消耗速率（OCR）。整个实验中杂合子表现与野生型相似，而纯合子表现明显不同（图 4F）：其基础 OCR 低于杂合子和野生型同胞（图 4G），FCCP 刺激后差异依然存在；加入鱼藤酮+抗霉素 A 后各基因型 OCR 趋于一致，说明非线粒体呼吸在各基因型间几乎相同，而纯合子的基础和最大线粒体呼吸速率严重降低（p<0.05）。

功能异常的线粒体可激活线粒体-细胞核逆行信号通路（包括缺氧感知），且这些信号变化与 mtDNA 水平相关【29】。借助 Tg(4xHRE-TATA:EGFP)ia21 报告鱼（图 4H），6 dpf 纯合突变体的荧光强度显著高于野生型（图 4I），与此前 polgia302 突变系的观察一致；且杂合子中也可见该激活，提示一个突变 polg2 等位基因即足以触发 Hif 介导的缺氧应答。此外，TMRM 膜电位检测未发现基因型间显著差异（趋势下降，见补充图 6）。

图 4　polg2 KO 下线粒体含量、形态与代谢缺陷。（A）6 dpf 各基因型 mito:EGFP 线粒体标记的共聚焦图像（标尺 10 μm）。（B）mito:EGFP 相对定量（Kruskal-Wallis+Dunn；*p<0.05，****p<0.0001）。（C、D）6 dpf 线粒体 nd1（C）与 nd2（D）基因相对丰度（**p<0.005，***p<0.001）。（E）20 dpf nd1 基因分析（**p<0.005）。（F）4 dpf 幼鱼 Seahorse OCR 曲线（基础、FCCP 诱导最大呼吸、ROT/AA 抑制）。（G）基础 OCR 定量（*p<0.05）。（H）6 dpf HRE:EGFP（Hif-缺氧）报告基因成像示例（标尺 1 mm）。（I）Hif 缺氧信号激活的积分密度分析（**p<0.005）。

7｜CLO 可部分挽救 polg2 敲除突变体的 mtDNA 含量与运动能力

鉴于 CLO 在 Polg 缺陷斑马鱼中的挽救作用已被证实【12】，研究者测试其对 Polg2 突变是否同样有效。与 polg 突变体的观察类似【11】，CLO 对 mtDNA 含量产生正面影响：虽然 polg2 KO 的 mtDNA 含量显著低于野生型，但 CLO 处理后这一差异消失（图 5A）——提示 CLO 虽不及在 polgsa9574 中效果强烈，却可在缺失 Polg2 的情况下部分恢复 MDD。

在 15 dpf 幼鱼中评估 CLO 对运动行为的影响：CLO 处理轻微改善了纯合突变体的游泳表现（图 5B），但未完全恢复正常水平（可能与 KO 表型的严重程度有关）；对杂合子未见明显效应（可能与个体反应差异有关）。值得注意的是，CLO 处理后纯合突变体在光刺激下的反应性得到改善，达到与野生型对照相当的水平（图 5C）。

图 5　CLO 在 polg2 KO 条件下的挽救效应分析。（A）2–6 dpf 经 3 μM CLO 处理（+）与未处理（−）的各基因型 mtDNA 含量；每个数据点代表一组 10 尾幼鱼（单因素 ANOVA+Tukey；*p<0.05，**p<0.005，****p<0.0001）。（B）10–15 dpf 经 2 μM CLO 处理后的光刺激运动分析（双因素 ANOVA+Dunn）。（C）各基因型对光刺激的最大反应（游动距离，mm）（Kruskal-Wallis+Dunn；*p<0.05，**p<0.005）。

讨论

Polg2 功能障碍相关实验体系的匮乏，一直制约着 Polg2 相关 POLG 疾病表型的建模与药物治疗研究。本研究描述了一个斑马鱼 polg2 KO 品系的构建与形态功能表征：polg2ia304 等位基因携带 10 个核苷酸缺失，导致移码突变和提前终止密码子。由于缺乏针对斑马鱼 Polg2 的抗体，无法对突变体进行蛋白定量；但 polg2 mRNA 的减少与 polg 表达的升高提示，polg2 存在突变诱发的 mRNA 衰减机制，而 polg 成员则出现代偿性过表达。纯合突变体在受精后 3–4 周（幼鱼期之前）死亡，证明了 Polg2 对机体存活不可或缺，进一步支持该诱发突变是功能缺失效应。由于杂合子可育且存活（尽管线粒体质量较野生型降低），基本可排除显性负性效应或关键单倍剂量不足效应。

polg2 纯合子在幼体期的存活，使研究者得以识别一系列与早发型 POLG 相关疾病患者相似的表型【3,30】：存活率下降、发育迟缓、高耗能器官组织学改变、进行性运动缺陷、MDD、线粒体结构改变与 OCR 降低——所有这些都可归因于 mtDNA 复制体机器的功能失调。可用于呼吸链亚基合成的 mtDNA 基因拷贝减少，很可能引起线粒体膜电位下降、进而 ATP 合成减少【31】。6 dpf 时即已出现线粒体功能受损和 MDD，而生长迟缓和行为改变在更晚的发育阶段才显现——提示生长缓慢是生物能受损、可供细胞过程利用的 ATP 减少的结果。生物能受损也可解释包括人类在内的多种生物中高耗能组织（脑、肝、肌肉、心脏）的发育异常——这些正是 MDS 和 POLG 相关疾病常见的受累部位【10,32】。此外，Hif 缺氧传感器成像提示，在 mtDNA 耗竭的 polg2 突变体中该通路被强烈激活；除低氧外，线粒体功能障碍的多种信号都可上调 Hif 通路，包括细胞"伪缺氧"状态（尽管有氧却无法利用）【12】。

对特定组织的深入分析揭示了可能构成发育迟缓和过早死亡基础的组织学改变：纯合突变体骨骼肌发育异常、纤维排列紊乱、肌节破坏，进而导致运动行为缺陷——这与人类线粒体疾病中特征性的骨骼肌功能障碍（MDS 与 POLG 相关疾病中的线粒体肌病）相呼应【33】。心脏方面，突变体心房、心室尺寸减小、小梁网络异常，可对应线粒体疾病中常见的心肌病【34】。神经系统方面，脑组织学测量显示突变体脑体积显著缩小，提示神经发育受损——正如 Alpers-Huttenlocher 综合征及其他 POLG 相关疾病中所见【10,35】。这一特点与骨骼肌缺陷共同促成运动实验中光暗转换反应减弱。

借助既往将 CLO 鉴定为 POLG 相关疾病候选药物的研究【11,12】，研究者在早期发育中让 polg2ia304 突变个体暴露于 CLO，并比较处理与未处理个体的 mtDNA 相对含量。正如预期，CLO 轻微提高了野生型对照的 mtDNA 基础水平，且值得注意的是，这一效应在 polg2 杂合子和纯合子中同样观察到。CLO 还改善了突变体在光刺激下的反应性，再次显示其作为 POLG 相关疾病有效药物的潜力——提示 CLO 治疗不仅适用于 Polg 功能障碍，也可能适用于 Polg2 突变，拓宽了 CLO 可干预的线粒体疾病范围。未来可延长给药周期，检验 CLO 能否挽救线粒体质量、线粒体代谢、线粒体-细胞核逆行信号、高耗能组织发育及运动活性等其他表型。另一方面，与 KD/点突变模型相比【12】，在 Polg 或 Polg2 亚基完全缺失的极端严重条件下，CLO 效果有限——这强化了 CLO 作用机制是稳定 DNA 聚合酶 γ 全酶（脊椎动物中为异源三聚体复合物）的假说。

总之，对首个斑马鱼 polg2 KO 品系的分析揭示了与 Polg（Polg1）突变体相似的独特表型：严重 mtDNA 耗竭、线粒体动力学改变、生长迟缓、运动障碍和过早死亡，忠实模拟了人类 POLG 患者的特征。本研究凸显了聚合酶 γ 辅助亚基（Polg2）在斑马鱼 mtDNA 复制与机体存活中的重要性。近期研究鉴定 Polg2 是维持 mtDNA D-环的关键蛋白，除作为持续合成因子外还具有双链 DNA 结合活性【9】——Polg2 在 mtDNA 复制与维持中的双重角色，解释了为何 polg2 突变会导致严重 MDD 和致死表型。最后，本研究提供了概念验证：在 Polg 靶向筛选中预先发现的药物（如 CLO）可能有效挽救 Polg2 依赖的表型，为利用斑马鱼 polg2 突变体（本 KO 及未来 KI 品系）作为药物筛选平台、寻找 POLG 相关疾病及其他 MDD 疾病的疗法开辟了道路。

补充说明：本文系文献翻译整理，原文及全部图表以开放获取（CC BY 4.0）形式发表于 Cell Death and Disease (2024) 15:281，DOI: 10.1038/s41419-024-06622-9。文中图片版权归原论文作者所有。数据可用性、致谢、作者贡献与参考文献详见原文，此处从略。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。