Host development overwhelms environmental dispersal in governing the ecological succession of zebrafish gut microbiota

期刊：npj Biofilms and Microbiomes（Nature Portfolio 旗下开放获取期刊）

影响因子：11.4（2025 年度 JCR）｜ 分区：JCR Q1，中科院大类生物学 1 区（Top 期刊）

国内团队成果

论文信息：npj Biofilms and Microbiomes (2021) 7:5 ｜ DOI: 10.1038/s41522-020-00176-2

发表时间：2021 年 1 月（收稿 2020-07-14，接收 2020-12-03）

通讯作者：黄杰（中国科学院水生生物研究所）、颜庆云（中山大学环境微生物组研究中心）

开放获取：CC BY 4.0 ｜ 参考文献与补充材料详见原文

导读

肠道菌群演替的驱动机制是肠道生态学的核心问题。本研究设计了一个巧妙的"交叉养殖"实验：同一批斑马鱼胚胎分别在与外界隔绝的三种不同水环境（种植不同植物的 A/B 环境和无植物 C 环境）中孵化，12 日龄后再交叉转入不同水箱饲养，从 12 到 98 日龄系统采样。结果发现：孵化环境和水体转移对肠道菌群演替几乎没有影响，而宿主发育阶段才是决定性因素——肠道菌群按发育阶段清晰聚类，控制演替的"同质选择"随宿主发育不断增强。换句话说，"长在谁身上"比"泡在什么水里"重要得多。

引言

生态演替作为生态学核心主题已逾 120 年，但水生动物肠道菌群演替的机制仍不清晰。理解宿主相关微生物的演替必须考虑宿主遗传与生态的相互作用。鱼类约占脊椎动物多样性的一半，其成功演化离不开肠道菌群的帮助——反过来，鱼类也为肠道微生物提供适宜的栖息地和必需的营养，并保护其免受病原入侵等不利干扰。这种宿主-微生物互作对鱼类的健康、免疫、代谢、发育、繁殖和行为至关重要。

调控鱼类肠道菌群的机制可能与陆生哺乳动物截然不同：卵生鱼无法像胎生哺乳动物经产道获得可遗传微生物。鱼类肠道菌群与宿主遗传、免疫、生理和生态密切相关，但也有研究表明环境因素是塑造鱼类微生物组的关键力量。理论上，定植于鱼肠道的微生物都应来源于周围水体；鱼类也能截留环境中一些低丰度微生物——即使是不善定植的细菌，也能进一步演化为高效定植者，且细菌可通过外部水体在宿主间反复移动而日益适应鱼类定植。因此，最好将肠道与水体微生物视为一个元群落（metacommunity）来完整理解鱼类相关微生物组。然而，鱼类微生物对元群落多样性（γEcosystem）的贡献很少被研究。

本研究利用可操控的斑马鱼模型，旨在阐明宿主发育与环境传播如何影响鱼类肠道菌群的组装与演替。作者假设：由于宿主遗传、免疫和肠道营养生态位，宿主对肠道菌群演替的影响远强于环境。为此：首先检验不同环境中孵化的鱼是否能组装出相似菌群；其次检验换环境饲养后已建立的肠道菌群是否被扰动；第三定量宿主发育与环境传播对演替的相对贡献。

结果一：构建三种操控斑马鱼的水环境

为检验周围环境对肠道菌群初始定植和后续演替的影响，研究者构建了三种水环境（图 1）。所有水化学因子在 A、B、C 间差异显著：环境 A 的叶绿素 a 和总有机碳（TOC）最高；环境 B 的可溶性正磷酸盐（SOP）、NH4-N 和 NO2-N 最高；环境 C 的 NO3-N 最高。A、B 环境水体微生物的丰富度和系统发育多样性显著高于 C，A 的 Shannon 多样性也显著高于 B、C。Venn 图显示三种环境的 OTU 组成差异很大：仅 3.0–14.5% 的 OTU 被两或三个环境共享，63.7% 为独有 OTU；丰度加权 DCA 排序也将三种环境清晰分开。因此，构建的环境可为鱼类肠道菌群定植提供截然不同的微生物种库。

图 1　检验宿主与环境对斑马鱼发育过程中肠道微生物群生态演替影响的实验设置。斑马鱼在三种不同环境（A、B、C）下操控：同一同胞群的胚胎分别在注入 A、B、C 环境水的三个独立圆盘中孵化；12 日龄（dph）时从盘中转入水箱并在小网笼中饲养（虚线框），从 12 到 98 dph 跨发育阶段收集各笼肠道样本。绿色、红色和蓝色的线条、鱼与字母分别对应环境 A、B、C。笼 1、5、9 为保持原环境的斑马鱼，其余笼为经历环境切换的斑马鱼。

图 2　三种构建水环境及 12 dph 定植于斑马鱼肠道的微生物群的化学与微生物学特征。(a) 水化学因子（均值 ± 标准误；ANOVA + LSD 检验，不同字母表示环境间差异显著）。Chl-a 叶绿素 a，SOP 可溶性正磷酸盐，TOC 总有机碳。(b) 水体与肠道微生物群的 α 多样性。PD 系统发育多样性。(c) 水体微生物群 Venn 图（表示共享 OTU 占全部检出 OTU 的比例，不代表定量数据）。(d) 去趋势对应分析（DCA）显示 12 dph 水体与肠道微生物群的相异性。

结果二：原环境中斑马鱼肠道菌群的组装与周转

同一批胚胎在不同环境中孵化后，12 dph 时组装出相似的肠道菌群——基于 Bray–Curtis 距离的 DCA 排序中无法分开，PD、丰富度和 Shannon 等 α 多样性也无显著差异。此后，在始终饲养于原环境的组（笼 1、5、9）中，各发育阶段的肠道菌群与水体菌群明显不同：肠道与水体共享且平均丰度 >1% 的 OTU 仅 3 个（OTU_1、OTU_3 均为 Cetobacterium，OTU_4 为 Aeromonadaceae）；肠道中多数较常见 OTU 在水体中并不丰富。肠道菌群按发育阶段（12–20、27–42、56–98 dph）清晰分离；解释了 39.7–43.1% 群落变异的前 20 位 OTU 也随发育阶段明显分化。具体而言：12–20 dph 幼鱼定植较多 OTU_5（Vibrio）和 OTU_4（Aeromonadaceae），累计占比 >50%；27–42 dph 时 OTU_2（Plesiomonas）成为优势（16.2–26.7%），Vibrio 降至约 5%；56–98 dph 时两个 Cetobacterium 成员（OTU_1、OTU_3）显著上升、合计约 40%，Aeromonadaceae 降至 8.2–11.0%。值得注意的是，水体中较丰富的类群（如 Flavobacterium 的 OTU_7、OTU_11）理论上极易经环境传播进入肠道，却未成为肠道优势类群；相反，水体中的低丰度微生物却依赖宿主发育成为肠道的高效定植者。肠道菌群组成和优势 OTU 丰度都表现出清晰的发育阶段特异性模式。

图 3　各检出 OTU 的平均丰度及前 20 位 OTU 解释的肠道微生物群落变异。(a) 各 OTU 在水体与肠道微生物群中的平均丰度。在肠道与水体中丰度相当的 OTU 沿对角线分布，在水体或肠道中富集者分别位于对角线上、下方。虚线标记水体或肠道平均丰度 1% 阈值；蓝色和红色分别为肠道或水体平均 >1% 的 OTU，红蓝混合点为两者均占优的 OTU，黑点为平均 <1% 的 OTU。(b) 典范对应分析（CCA）显示前 20 位 OTU 解释的肠道菌群变异。每个点代表一条斑马鱼的肠道微生物群落，箭头代表前 20 位细菌 OTU 的贡献。

结果三：环境转换后的肠道菌群演替

12 dph 后部分斑马鱼被两两交叉转移环境，以检验环境传播对演替的影响。结果表明：无论按孵化环境（图 4a）还是饲养环境（图 4b）划分，肠道菌群演替都主要与斑马鱼发育阶段相关；每个水箱内的菌群都能按三个发育阶段清晰分为三组（PERMANOVA，p<0.05）。原环境组（笼 1、5、9）与换环境组（笼 2、3、4、6、7、8）在同一阶段内无显著差异（p>0.05）。跨所有水箱的分析同样呈现阶段特异性模式，而无环境特异性模式。任一阶段的肠道菌群也与对应水体菌群显著不同。换环境后的演替模式与原环境组一致，7 个时间点同样按三个阶段划分。因此，孵化环境和环境转换都未显著影响肠道菌群演替——演替主要由宿主发育决定。

图 4　去趋势对应分析（DCA）显示环境对斑马鱼发育过程中肠道菌群演替的影响。(a) 按孵化环境划分。(b) 按饲养环境划分。不同环境孵化或饲养的斑马鱼，其肠道菌群在宿主发育过程中呈现相似的演替模式。

结果四：宿主发育决定肠道菌群演替

多变量回归树（MRT）分析共解释了肠道菌群多样性方差的 68.3%（图 5a）：菌群多样性首先按发育阶段分裂（解释 46.2%），是最重要的影响因素；水环境仅在早期解释很小比例（12 dph 1.4%，27–42 dph 1.8%）。Shannon、PD 和丰富度在不同发育阶段差异显著（图 5b）；广义线性模型（GLM）表明发育阶段是塑造 α 多样性的唯一显著预测因子（PD、丰富度、Shannon 的方差 r²=33.4–45.9%，p<0.001），环境仅解释 3.4% 的丰富度变异，转换和食物无显著解释。层级分割显示发育阶段贡献 64.3–82.4%，远高于环境（1.2–9.8%）、转换（5.8–14.8%）和食物（9.7–11.1%）。Mantel 及偏 Mantel 检验（Bray–Curtis 与 Jaccard 两种距离）一致表明发育阶段是 β 多样性最强的显著因子（r>0.5，p<0.001），而转换与 β 多样性无显著相关，环境和食物仅有微弱相关（|r|≤0.2）。因此，斑马鱼发育阶段是肠道菌群演替的主要预测因子，压倒环境、转换和食物。（需说明的是，本研究未考察母源/绒毛膜变异这一菌群变异来源。）

图 5　斑马鱼肠道微生物多样性主要与发育阶段相关。(a) 基于 Bray-Curtis 距离、交互各因素（发育阶段、环境、转换、食物）的多变量回归树（MRT）分析。(b) Shannon、系统发育多样性（PD）和丰富度（均值 ± 标准误）；ANOVA + LSD 检验，不同字母表示差异显著。

结果五：控制肠道菌群演替的生态过程

元群落多样性贡献方面：各水箱或跨所有水箱格局相似，栖息地内平均差异（βIntra-Habitats）贡献最大（39.8–53.9%），说明肠道菌群是养殖生态系统微生物多样性的重要贡献者；各样本平均多样性（αLocal-Communities）和水体-肠道间差异（βInter-Habitats）分别占 24.8–29.2% 和 20.8–34.3%。零模型检验显示，同一发育阶段内群落相似度与随机排列显著不同，确定性比例较高。生态过程定量分析证实（图 6b）：肠道菌群演替由强确定性过程主导——同质选择（使同一环境条件下群落组成趋同）解释了 28.2–40.8% 的变异，且随宿主发育不断增强；异质选择额外贡献 4.4–8.4%。相比而言，均匀化扩散仅在早期较重要（20.5%），扩散限制全程都弱（仅 0.6–2.0%）。因此，斑马鱼肠道菌群演替主要受阶段依赖性选择控制，均匀化扩散只在早期重要。

图 6　元群落多样性与生态过程的定量分析。(a) 多尺度元群落多样性的层级分割：各水箱或跨所有水箱的生态系统多样性（γEcosystem）被分解为 αLocal-Communities（各水体或肠道样本的平均多样性）、βIntra-Habitats（水体或肠道栖息地内多样性均值）和 βInter-Habitats（水体与肠道栖息地间多样性之和）的贡献。(b) 控制肠道菌群群落的主要生态过程定量。柱上数字为各已知过程在不同阶段对群落演替的相对贡献，其余归为未主导过程。

讨论

本研究在控制良好的不同水环境下阐明了跨宿主发育的鱼类肠道菌群组装与演替的主要驱动力：菌群主要由宿主发育决定，而非孵化环境或环境转换，支持了作者的核心假说。宿主遗传是提供肠道菌群初选的最重要力量。此前研究显示莫桑比克孔雀鱼短至 12 天的监测期内肠道菌群即由独立于水体菌群的确定性宿主效应驱动；不同鱼种肠道菌群因宿主遗传/系统发育而显著不同；同一鱼种无论来自野外还是实验室多代饲养都能定植核心肠道菌群；宿主亚基因组和基因型也能影响肠道菌群。但这些研究多聚焦于特定短发育阶段。本研究与 Burn 等的结论一致：随宿主发育，中性过程相对重要性下降，同质选择这一确定性过程不断增强。

为什么发育阶段特异性的肠道菌群模式会出现？研究者归因于三个方面。第一，肠道微生物定植始于受精后约 3 天（口开启），与肠腔形成同步；6 天时整个消化道贯通、卵黄囊几乎耗尽，幼鱼开始摄食并定植多样微生物，定植微生物又反过来促进肠道发育——即微生物在肠道生态系统中辅助的功能随发育（尤其器官形成期）而变化，呈现阶段特异性。第二，宿主免疫：早期（约 18 dph 前）先天免疫对菌群多样性影响小，而适应性免疫会增强菌群组装中的选择作用——本研究中 12–20 与 27–42 dph 之间的清晰分界，可能与 25 dph 后才发挥功能的适应性免疫系统发育相关；免疫功能强的宿主动物肠道微生物种群明显更小。第三，宿主为微生物提供受保护且营养丰富的生态位，其营养格局由宿主食物与分泌物塑造，肠道营养可利用性、蠕动和消化过程随发育变化，共同促成阶段特异性菌群。

环境因素影响远小于宿主：这与此前斑马鱼、草鱼的研究一致——肠道菌群不同于周围环境；其他水生动物的肠道菌群也与周围水体或沉积物差异巨大；大西洋鲑在淡水-海水转换中维持稳定的核心肠道菌群。除宿主选择压力外，经水体的宿主间微生物传播也是塑造不同个体相似肠道菌群的重要力量。本研究还发现元群落总多样性主要来自水体或肠道栖息地内的平均差异，说明肠道菌群对养殖生态系统元群落有显著贡献。成功的肠道定植者应具备占据空间、获取资源、避免随排泄物被清除的性状优势；其在鱼肠中以较高丰度定植后，通过与周围水体持续的物质交换（摄食与排泄）反过来影响养殖系统的元群落。

总之，本研究解析了宿主发育、孵化环境和环境转换对幼鱼至成鱼肠道菌群演替的影响：斑马鱼发育阶段实质性地解释了肠道微生物群落的生态演替和优势 OTU 的更替；演替主要由宿主效应导致的阶段依赖性同质选择控制，孵化环境与环境转换的环境影响则小得多。这些发现拓展了对鱼类发育过程中肠道菌群生态演替的认识，也为其他水生动物的肠道生态学提供了新见解。

方法概要

实验设计与养殖：野生型 AB 系斑马鱼。用三个独立玻璃缸（130×30×40 cm）建立三种水环境：A 种植天胡荽（Hydrocotyle vulgaris）、B 种植绿萝（Epipremnum aureum），根系浸入水中与水体交换物质；C 无植物。植物生长 30 天后评估环境差异（水化学因子：NH4-N、NO3-N、NO2-N、叶绿素 a、可溶性正磷酸盐、总有机碳）。同一批受精卵随机分入三个圆盘（约 1000 枚/盘）分别在 A、B、C 水中孵化；12 dph 时每个环境各取 100 尾转入三个水箱中的小网笼（每水箱 3 笼，笼内水体连通构成元群落）；按 12、20、27、42、56、70、98 dph 采样。水温 28±0.5 °C，14/10 h 光暗周期；4 dph 前不投喂，之后依次投喂草履虫（5–8 dph）、蛋黄水（9–11 dph）、活卤虫（12–19 dph）和标准干饲料（20 dph 起）。

取样与 DNA 提取：每缸每处理每时间点随机取 3 尾鱼，解剖镜下无菌取出整条肠道作为单个样本；各时间点（除 20 dph）另取缸内左中右三点水样，500 mL 经 1.2 µm 和 0.22 µm 滤膜过滤收集微生物。共获 189 个肠道样本（7 时间点×3 缸×3 笼×3 重复）和 54 个水样。肠道用 PowerFecal、水样用 PowerWater 试剂盒提取 DNA，统一稀释至 10 ng/µL。

16S rRNA 扩增子测序：扩增 V4–V5 区（引物 515F/907R），Illumina HiSeq 2500 平台 2×250 bp 测序。QIIME 拼接双端序列，去除低质量序列，按 UNOISE 法以 Greengenes 13_863 为参考生成 zOTU，去除 singleton，统一重抽样至每样本 14,666 条序列。

生态过程分析：用加性多样性分配框架（Rao 函数）将生态系统多样性分解为栖息地间、栖息地内与局部群落组分；用 βNTI（加权 beta 最近分类单元指数）结合 RCbray 定量生态过程：βNTI>2 或 <−2 分别对应异质/同质选择；|βNTI|<2 且 RCbray>0.95 或 <−0.95 对应扩散限制或均匀化扩散；|βNTI|<2 且 |RCbray|<0.95 归为未主导过程。

统计分析：MRT 回归树、GLM、层级分割、（偏）Mantel 检验、DCA、PERMANOVA、零模型（Chase 等方法，估计确定性选择强度）、CCA、ANOVA+LSD 等，均在 R 中完成。原始测序数据已存入 NCBI SRA（登录号 PRJNA565801）。

译读小结：这项研究用设计精巧的交叉养殖实验证明：对斑马鱼肠道菌群而言，"宿主发育阶段"远比"泡在哪种水里"重要——菌群按发育阶段清晰演替，同质选择随宿主发育不断增强。这提示水产养殖中调控肠道菌群应更关注宿主发育阶段（如适口饲料与免疫发育节点），而非单纯更换水体环境。

原文：Xiao F, et al. npj Biofilms Microbiomes. 2021;7:5. 本文为中文译读，仅供参考，请以原文为准；参考文献与补充材料详见原文。

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