文章信息

期刊：Autophagy（《自噬》，自噬领域旗舰期刊，Taylor & Francis 出版）

最新影响因子：18.6（2025 年度 JCR，官网数据）｜JCR 分区：Q1

中科院分区（2025）：大类·生物学 1 区；小类·细胞生物学 2 区

发表信息：Autophagy (2021) 17(5):1222–1231｜收稿 2019-01-06，接收 2020-04-02，在线发表 2020-04-22

DOI：10.1080/15548627.2020.1755119

通讯作者：Raymond Chuen-Chung Chang（香港大学）、Alvin Chun-Hang Ma（香港理工大学）

导读

0.003% PTU（苯硫脲）几乎是所有斑马鱼实验室"压胚胎色素"的标配。但这篇 Autophagy 论文提醒大家：PTU 处理会激活斑马鱼胚胎的自噬——皮肤、脑、肌肉中自噬体、自噬溶酶体大量形成，自噬流显著增强；用 CRISPR 敲掉酪氨酸酶（Tyr）也能重现该表型。好消息是黑色素生成本身并不依赖自噬。用 PTU 做活体成像研究自噬相关过程的同学，需要留个心眼了。

摘要

1-苯基-2-硫脲（PTU）是一种酪氨酸酶（Tyr）抑制剂，被广泛用于阻断斑马鱼胚胎的色素沉着、提高光学透明度。本研究报道了 PTU 对斑马鱼胚胎巨自噬/自噬的一种此前未知的影响。经 0.003% PTU 处理后，斑马鱼胚胎的多种组织和器官（如皮肤、脑和肌肉）中观察到异常的自噬体与自噬溶酶体形成、溶酶体积累以及自噬流增强。与 PTU 处理类似，体细胞 tyr 突变体斑马鱼胚胎中也观察到自噬激活与溶酶体积累，提示 Tyr 抑制可能参与 PTU 诱导的自噬激活。此外，研究还证明自噬参与色素沉着的抑制，但并非 PTU 诱导的色素抑制所必需。鉴于自噬广泛参与多种生理与病理过程，而 PTU 又是自噬相关过程研究中的常规工具，这些观察为使用 PTU 处理的斑马鱼胚胎开展自噬相关研究提出了一个新问题。

关键词：1-苯基-2-硫脲；自噬；黑色素生成；酪氨酸酶；斑马鱼胚胎

引言

PTU 是黑色素生成关键限速酶——酪氨酸酶（Tyr）的抑制剂，常用于抑制斑马鱼的色素沉着：在受精后 24 小时（hpf）之前用 0.003%（w:v，200 μM）PTU 处理胚胎，可提高显微镜成像的光学透明度【1】。过去十年间已报道了 PTU 的若干分子与生理副作用，包括孵化率与存活率改变、甲状腺功能受损、神经嵴发育异常、眼睛变小以及视觉行为异常等【2–6】。由于这些副作用相对轻微、仅影响有限的研究领域，大多数研究仍在使用 200 μM PTU 抑制斑马鱼胚胎的色素沉着。不过，PTU 对斑马鱼胚胎的生理影响可能干扰以斑马鱼为模型的研究，值得进一步探究。

巨自噬/自噬即细胞的"自我消化"，是对多种生理与病理条件的重要细胞反应，调控细胞内物质更新、细胞死亡、增殖、发育、衰老和肿瘤发生等重要过程【7】。关键自噬基因如 Atg5、Atg7、Becn1 的缺失导致肿瘤发生，而过表达 Atg5 可延长啮齿类动物的寿命【8】。过去十年间，各类斑马鱼自噬模型被逐步建立，包括 GFP-Lc3 与 GFP-Gabarap 转基因鱼，以及自噬相关基因敲降/敲除模型【9,10】，广泛用于器官发生、再生和感染等研究【11–13】。借助其光学透明性，配合 PTU 处理抑制色素沉着进行活体成像，是在转基因斑马鱼胚胎中研究体内自噬的常规手段——这是啮齿类模型无法实现的。

既往研究表明，自噬既调控黑色素生成，也参与黑素小体的破坏，尤其在黑色素细胞中【14,15】。关键自噬蛋白 LC3 的敲降会抑制黑色素细胞中的黑色素生成【16】；此外，若干黑色素生成抑制剂（如 ARP101、白藜芦醇、Hinokitiol）通过自噬依赖通路阻断黑色素细胞的色素沉着【17–19】。这些研究主要聚焦于体外黑色素细胞模型中黑色素生成如何受自噬调控，而黑色素生成调节剂对自噬的影响——特别是在整体动物水平——仍不清楚。本文报道了 PTU 处理对斑马鱼胚胎自噬的一种此前未知的诱导效应；在将 PTU 处理的斑马鱼胚胎应用于自噬相关研究时，这一效应应被纳入考量。

结果

1｜PTU 诱导斑马鱼胚胎自噬

在 24 hpf 前用 0.003% PTU 处理，可获得光学透明的斑马鱼胚胎（图 1A）。为研究 PTU 处理胚胎中的自噬活性，研究者用梯度浓度 PTU（1X=0.003%、2X=0.006%、4X=0.012%）处理胚胎。Western blot 显示，与对照组相比，Lc3-I 与 Lc3-II 随 PTU 剂量依赖性显著升高；经典自噬底物 Sqstm1（p62）在 2X 和 4X 处理后显著下降（图 1B），提示 Lc3 蛋白表达、自噬体和/或自噬溶酶体形成增加【20】。进一步用 Tg(GFP-Lc3) 转基因鱼结合 LysoTracker Red（标记溶酶体及自噬体-溶酶体融合后的自噬溶酶体）观察：与 western blot 一致，PTU 处理后神经细胞中 GFP-Lc3⁺（自噬体和/或自噬溶酶体）、LysoTracker⁺（溶酶体）及双阳性（自噬溶酶体）点状结构随剂量增加（图 S1A）；皮肤细胞、肌肉细胞及尾部造血组织（CHT）细胞中亦显著增加（图 1C、S1B）。PTU 诱导的 GFP-Lc3⁺ 及双阳性点状结构可被 3-甲基腺嘌呤（3-MA，通过阻断 III 型磷脂酰肌醇 3 激酶 PtdIns3K 抑制自噬体形成）缓解（图 1D），提示 PTU 通过作用于 PtdIns3K 的上游激活自噬。总之，24 hpf 前的 0.003% PTU 处理即可诱导胚胎多种组织出现自噬体、溶酶体和自噬溶酶体增加的自噬激活表型；在色素形成后的 48 hpf 再给予 0.003% PTU，同样观察到类似的自噬激活（数据未展示）。

图 1　PTU 诱导斑马鱼胚胎异常自噬体与自噬溶酶体形成。（A）2 dpf 胚胎经 E3（对照）或约 1 dpf 起 0.003%（200 μM，1X）PTU 处理后的明场图像（标尺 0.5 mm）。（B）各剂量 PTU 处理后 Lc3-I、Lc3-II 剂量依赖性积累及 Sqstm1/p62 降解（每组 50 枚胚胎，3 次独立实验；单因素 ANOVA，Lc3-I:Tuba 与 Lc3-II:Tuba 显著升高 p<0.05，2X/4X 组 Sqstm1:Tuba 显著降低）。（C）成像位置示意图（眼上方外皮层或基底表皮细胞）；Tg(GFP-Lc3) 胚胎经 PTU 处理并以 LysoTracker 染色的代表性图像（9 尾/组，3 次独立实验），定量每细胞 GFP-Lc3⁺、LysoTracker⁺ 及双阳性点状结构；红色箭头示双阳性点；**p<0.01；标尺 10 μm（合并图）、5 μm（放大图）。（D）中脑神经元成像（基于 Z-Stack 100 层中 10 层）；PTU 和/或 3-MA 处理的代表性图像；*p<0.05，**p<0.01 vs 对照；##p<0.01 vs PTU；标尺 40 μm（合并图）、6 μm（放大图）。

2｜PTU 提高斑马鱼胚胎的自噬流

接下来用 GFP-Lc3-RFP-Lc3ΔG 探针检测自噬流：探针中的 GFP-Lc3 会被自噬降解，RFP-Lc3ΔG 则作为内参，因此 GFP/RFP 荧光比值代表自噬流速率【21】。PTU 处理后，胚胎皮肤中 GFP/RFP 比值显著下降（图 2A）；高倍镜下可见中脑细胞中 GFP-Lc3⁻/RFP-Lc3ΔG⁺ 与双阳性点状结构增多（图 2B、S1C），表明 PTU 处理后自噬流增强。用氯喹（CQ）阻断自噬体与溶酶体融合及后续降解：CQ 单独处理不改变 Lc3-II:Tuba 比值，而 PTU+CQ 共处理较 PTU 单独处理显著升高该比值（图 2C）。中脑神经元计数显示，自噬体（GFP-Lc3⁺/LysoTracker⁻）相对数量在 CQ+PTU 共处理组达 379%、CQ 组 199%，而 PTU 组 153%、对照组 100%（图 2D）；PTU 处理胚胎中 CQ 共处理引起的自噬体增幅（2.59 倍）显著高于对照组（1.99 倍），进一步证明 PTU 处理提高了自噬流。正如预期，CQ 处理后自噬溶酶体（双阳性）数量显著下降，溶酶体（LysoTracker⁺/GFP-Lc3⁻）数量保持不变（图 2D）。

图 2　PTU 提高斑马鱼胚胎自噬流。（A）头部皮肤背面观成像示意图；用 GFP-Lc3-RFP-Lc3ΔG 探针检测自噬流，按选定区域平均荧光强度计算 GFP-Lc3:RFP-Lc3ΔG 比值（9 尾/组，3 次独立实验）；红色箭头示双阳性点；**p<0.01；标尺 100 μm。（B）中脑成像示意图：6 hpf 起经 PTU 处理的 24 hpf 胚胎中脑中检测 GFP-Lc3 与 RFP-Lc3ΔG 共定位点（标尺 100 μm）。（C）CQ 处理后 CTRL 与 PTU 组 Lc3-I/Lc3-II 水平（每组 50 枚胚胎，3 次独立实验；双因素 ANOVA+Tukey，Lc3-II:Tuba 在 PTU 与 PTU+CQ 之间差异显著，CTRL 与 CTRL+CQ 之间无差异）。（D）中脑神经元中自噬体（GFP-Lc3⁺/LysoTracker⁻）、溶酶体（GFP-Lc3⁻/LysoTracker⁺）与自噬溶酶体（双阳性）的每细胞计数；PTU 和/或 CQ 处理的代表性图像；**p<0.01 vs CTRL；##p<0.01 vs PTU；标尺 40 μm、3 μm（放大图）。

3｜遗传学抑制 Tyr 同样诱导斑马鱼胚胎自噬

Tyr 是 PTU 抗黑色素生成的关键调节酶，不仅在黑色素细胞中表达，也广泛表达于胚胎的皮肤、眼、脑、肌肉和尾部造血组织（CHT）；PTU 处理后其表达水平下降（图 S2A、B）。为确定 Tyr 抑制是否为 PTU 诱导自噬的机制，研究者用 CRISPR-Cas9 靶向敲除 tyr【22】：向单细胞胚胎注射 tyr gRNA 与 Cas9 蛋白，获得光学透明的 F0 胚胎（tyrMut，图 3A）。Western blot 显示 tyrMut 中 Lc3-II:Tuba 比值显著升高（图 3B）；常用透明突变品系 Casper（mpv17/roya9; mitfaw2）和 Absolute（ednrbab140; mitfab692）胚胎中也观察到 Lc3 蛋白升高（图 S2C、D）。LysoTracker 共染色显示，tyrMut 皮肤细胞与神经元中 GFP-Lc3⁺、LysoTracker⁺ 及双阳性点状结构显著多于对照，提示 tyr 突变引发了自噬体、溶酶体与自噬溶酶体的形成（图 3C、D）。自噬抑制剂实验显示，3-MA 显著减少 tyrMut 神经元中 GFP-Lc3⁺ 点状结构（图 S3），说明 tyr 突变与 PTU 一样作用于 PtdIns3K 上游；CQ 共处理显著增加自噬体、减少自噬溶酶体（图 3D）。但 CQ 共处理后 tyrMut 自噬体增幅（1.57 倍）与对照组（1.79 倍）无显著差异，western blot 亦显示 CQ 引起的 Lc3-II:Tuba 升高在 tyrMut 与对照间相似（图 3B）——即 tyrMut 中自噬流并未升高。PTU 处理胚胎与 tyrMut 之间的差异可能源于体细胞 tyrMut 中不完全、嵌合体的 tyr 靶向；但遗传抑制 Tyr 确实重现了 PTU 诱导的自噬体与自噬溶酶体形成增加。此外，PTU 共处理未能在 tyrMut 中引发更高水平的自噬激活（图 S3），提示 PTU 诱导的自噬活性很可能是 Tyr 抑制特异性的。

图 3　tyrMut 斑马鱼胚胎中异常自噬体与自噬溶酶体形成。（A）注射 tyr gRNA+Cas9 蛋白（tyrMut）及其同胞对照（CTRL）的 2 dpf 胚胎明场图像（标尺 0.5 mm）。（B）CTRL 与 tyrMut 经 CQ 处理后 Lc3-I/Lc3-II 水平（每组 50 枚胚胎，3 次独立实验；双因素 ANOVA+Tukey：tyrMut 中 Lc3-I、Lc3-II 显著升高 p<0.05；tyrMut+CQ 与 tyrMut 之间 Lc3-II:Tuba 无显著差异）。（C）成像位置示意图；tyrMut Tg(GFP-Lc3) 胚胎 LysoTracker 染色代表性图像；每细胞 GFP-Lc3⁺、LysoTracker⁺ 及双阳性点状结构定量；红色箭头示双阳性点；*p<0.05；标尺 10 μm、5 μm（放大图）。（D）中脑神经元成像（Z-Stack 10/100 层）；CQ 处理的代表性图像；**p<0.01 vs CTRL；##p<0.01 vs tyrMut；标尺 40 μm、3 μm（放大图）。

4｜自噬并非 PTU 抗黑色素生成所必需

既然 PTU 是阻断斑马鱼胚胎黑色素生成的强效 Tyr 抑制剂，其色素抑制效应是否依赖自噬？结果显示：自噬抑制剂（CQ 与 3-MA）对色素沉着无可观察影响；而经典自噬激活剂雷帕霉素（靶向 Mtor）显著减少胚胎色素沉着、并显著增强自噬活性（图 4A、S3）。此外，CQ 与 3-MA 阻断 PTU 诱导的自噬激活后，胚胎色素沉着未能恢复（图 1D、2D、4A）。这些结果提示：雷帕霉素诱导的自噬参与色素抑制，但自噬并非 PTU 抗黑色素生成所必需。有趣的是，黑色素生成通路的关键底物 L-酪氨酸可部分恢复 PTU 处理胚胎的色素沉着（图 4A）；而且 L-酪氨酸并未缓解 PTU 诱导的自噬活性，反而在对照和 PTU 处理胚胎中都诱导了自噬活性（图 4B）——提示 L-酪氨酸可能同时参与 PTU 诱导的自噬与抗黑色素生成。

图 4　L-酪氨酸（而非自噬调节剂）恢复 PTU 处理斑马鱼胚胎的黑色素生成。（A）2 dpf 胚胎分别经 E3、DMSO、CQ、3-MA、雷帕霉素和 L-酪氨酸（±PTU）处理后的明场图像；红色箭头示放大图中的黑色素；标尺 0.5 mm。（B）中脑成像：基于 Z-Stack（10/100 层）计数每细胞 GFP-Lc3⁺、LysoTracker⁺ 及双阳性点状结构；PTU、L-酪氨酸或 PTU+L-酪氨酸处理的代表性图像（成像前 LysoTracker 染色）；红色箭头示 GFP-Lc3⁺ 和/或 LysoTracker⁺ 点；**p<0.01 vs CTRL；##p<0.01 vs L-酪氨酸；标尺 40 μm、6 μm（放大图）。

讨论

斑马鱼已迅速成为包括自噬及其相关通路在内的多种生理与病理过程的体内模型【23】。胚胎期透明的身体便于在显微镜下观察荧光蛋白标记的转基因斑马鱼【10】。为维持胚胎期透明度，0.003% PTU 处理已被广泛用作抑制色素沉着的标准策略。尽管 PTU 的若干副作用已被证实，但尚不足以让斑马鱼研究放弃使用 PTU【2–6】。本研究首次报道 PTU 处理会在胚胎多种组织和器官中诱导剂量依赖性的自噬体、溶酶体与自噬溶酶体异常形成，并升高自噬流——说明 PTU 诱导的自噬并非黑色素细胞或其周围皮肤细胞所特有。PTU 处理后 Lc3-I 与 Lc3-II 同时显著升高，提示 Lc3 表达增加伴随 Lc3-I 向 Lc3-II 的转化，与雷帕霉素处理胚胎中已报道的自噬诱导一致【9,24】。通过遗传操作抑制 Tyr 同样诱导自噬体、溶酶体与自噬溶酶体的异常形成，且 PTU 共处理未能在 tyr 突变体中进一步激活自噬。虽然 tyrMut 中自噬流未升高（可能因为体细胞 tyrMut 中不完全、嵌合体的靶向），但 PTU 诱导的自噬与溶酶体积累很可能为 Tyr 抑制所特异。

TYR 作为黑色素生成的关键酶，虽主要表达于黑色素细胞，但在人和小鼠的多种组织器官中也有检出【25,26】。本研究显示斑马鱼胚胎的皮肤、脑和肌肉细胞中也表达 Tyr，且 PTU 处理在蛋白水平抑制了 Tyr。尽管黑色素细胞之外 Tyr 的功能尚不清楚，这一发现为 PTU 在黑色素细胞与皮肤以外的组织中诱导自噬和溶酶体积累提供了合理解释。本研究还证明，自噬并非 PTU 抗黑色素生成效应所必需，尽管雷帕霉素诱导的自噬参与色素抑制。既往研究报道 PTU 在黑色素细胞中抑制 TYR 活性，并在高尔基体成熟后降解 TYR 蛋白【27】。自噬可能参与无功能 TYR 的降解，但不参与对 TYR 活性的抑制——因此自噬抑制剂无法恢复 PTU 处理胚胎的 TYR 活性与黑色素生成。近期研究显示，敲降 LC3 与雷帕霉素处理分别降低和增强 TYR 活性，说明自噬可能是黑色素生成过程中维持 TYR 水平所必需【16】。除自噬体与自噬溶酶体增多外，PTU 还显著增加溶酶体数量。由于 TYR 可被错误靶向至溶酶体降解【28】，PTU 处理下额外的溶酶体形成可能是为非自噬性清除 TYR 而诱导的；此外，黑色素生成中 TYR 主要在溶酶体（或前黑素小体）内催化酪氨酸氧化【29】，反馈机制也可能促成溶酶体积累。本研究还发现 L-酪氨酸可在不缓解自噬活性的情况下部分恢复色素沉着，且单独处理也诱导自噬——L-酪氨酸可直接增强 TYR 活性【30】，或通过过量营养条件经 ROS 介导的内质网应激信号（不依赖 Mtor 通路）诱导自噬【31,32】。鉴于自噬在黑色素细胞与角质形成细胞中对黑色素生成的作用相反【33】，自噬在黑色素合成与解构（尤其非黑色素细胞中的黑素小体降解）中的确切作用仍需深入研究。

由于自噬与肿瘤等多种生理病理过程相关，本研究为使用 PTU 处理的斑马鱼胚胎开展自噬相关研究提出了新的顾虑。尽管既往斑马鱼研究多比较经历相同 PTU 处理的对照与处理组，PTU 与其他实验处理之间的协同或遮蔽效应仍可能影响自噬及自噬相关表型的解读。作为进化上最保守的通路之一，PTU 诱导的抗黑色素生成及黑色素相关基因的遗传改造也被用于啮齿类和爪蟾等其他动物模型【34–36】，相关动物模型中的进一步研究同样必要。近年报道的透明转基因斑马鱼品系（Casper、Absolute）被视为 PTU 处理的替代方案【37】；但本研究表明遗传靶向 tyr 同样导致自噬体、溶酶体与自噬溶酶体的异常形成，且纯合 Casper 与 Absolute 突变胚胎中 Lc3 蛋白水平升高，提示这些透明品系未必是 PTU 的更优替代。相反，借助更好的显微系统（如本研究使用的光片显微镜），活体荧光成像几乎不受色素影响。不过，这些局限不应掩盖斑马鱼模型在自噬相关研究中的独特优势。

材料与方法（概要）

斑马鱼品系与饲养：野生型与转基因鱼按标准条件饲养（14:10 光暗周期，每日两次喂活丰年虾）。Casper 与 Tg(GFP-Lc3) 分别由香港城市大学与梅奥诊所惠赠，Absolute 购自 ZIRC。胚胎取自自然产卵，28.5 °C 培养。动物实验经香港大学 CULATR 与香港理工大学 ASESC 批准。

CRISPR-Cas9 构建 tyrMut：将 20 bp 靶序列（5ʹ-GGGCCGCAGTATCCTCACTC-3ʹ）克隆入 pT7-gRNA 载体，BamH1-HF 线性化后用 HiScribe T7 试剂盒体外转录 sgRNA；Cas9 核酸酶（500 ng/μL）与折叠的 tyr sgRNA（100 ng/μL）等体积混合，37 °C 孵育 10 min 后共注射单细胞胚胎。

GFP-Lc3-RFP-Lc3ΔG 探针：pMRX-IP-GFP-Lc3-RFP-Lc3ΔG 经 BglII/NotI 酶切后通过 Gibson 组装亚克隆入 pT3TS 载体；体外转录并加 poly(A) 尾后，将 500 pg mRNA 注射单细胞胚胎卵黄。

PTU 与药物处理：24 hpf 前将胚胎转入含 0.003% PTU 的 E3 培养液（剂量梯度 0X/1X/2X/4X）；24 hpf 成像时于 6 hpf 起处理。自噬调节剂与 L-酪氨酸处理为 48–96 hpf 孵育于 20 μM 雷帕霉素、5 mM 3-MA、50 μM CQ、5 mM L-酪氨酸（±0.003% PTU），每日换液。

Western blot：去卵黄胚胎裂解，SDS 上样缓冲液 95 °C 变性 5 min，12% 凝胶电泳转膜；抗 Lc3b、抗 Sqstm1/p62、抗 Tuba 一抗 4 °C 过夜，山羊抗兔二抗孵育后化学发光显影，ImageJ 定量。

LysoTracker 染色与显微成像：LysoTracker Red DND-99（10 μM）28.5 °C 避光孵育 45 min，E3 洗涤 4 次。胚胎麻醉后包埋于 1.5% 低熔点琼脂糖，Leica TCS SPE 共聚焦（10X/40X）与 Zeiss Lightsheet Z.1 光片显微镜（20X）成像；体视显微镜记录形态与色素。

定量与统计：Zeiss ZEN 软件测量头部上方皮肤同区域荧光强度以计算自噬流；基于最大投影 Z-Stack 图像计数中脑神经元、躯干肌肉细胞及 CHT 细胞中各类点状结构（每样本至少 10 个独立细胞）；ImageJ 定量 western blot。数据以均值 ± SD 表示，SPSS 14.0 分析，p<0.05 视为显著。

补充说明：本文系文献翻译整理，原文发表于 Autophagy (2021) 17(5):1222–1231，DOI: 10.1080/15548627.2020.1755119。文中图片版权归原论文作者所有。补充材料（图 S1–S3）、致谢、基金、参考文献详见原文，此处从略。

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