前言

在过去的几十年里，肝病逐渐成为世界范围内死亡和患病的主要原因之一。尽管人类已经开发出了疫苗和抗病毒药物，但由于人们的预期寿命延长、久坐不动的生活方式和营养过度等因素，全球肝病负担仍将进一步加重。我国是世界上肝炎第一大国，根据2018年国际癌症研究中心的一份报告，中国的肝癌发病率位居第9，中国的肝癌患者人数是全球最多的。据估计，在中国，约有五分之一的人口受到某种形式的肝脏疾病困扰，包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、肝硬化、肝癌、非酒精脂肪肝(NAFLD)、酒精肝病(ALD)、药物诱导肝损等。

随着肝胆相关疾病发病率的增加，深入理解肝病发展过程中分子、细胞和生理因素在临床诊断和治疗中的作用显得尤为重要。合适的动物模型能够帮助针对性的识别相关疾病的可能机制。近些年，在肝脏发育、再生、癌症、损伤，以及相关药物筛选和评价等方面的研究进展使得斑马鱼模式生物在生物医学研究中得到研究学者的广泛认可。接下来，本文将从斑马鱼模型在肝脏疾病研究中的优势及应用对其进行介绍。

01 斑马鱼模型在肝脏疾病研究中的优势

斑马鱼肝脏的细胞表型与哺乳动物相似，除了肝脏免疫细胞(即Kupffer细胞) 之外，斑马鱼肝脏还包含哺乳动物肝脏中的其他细胞类型，拥有许多相同的细胞功能，包括胆汁分泌、糖原和脂质储存、胰岛素反应、异种物质和氨代谢以及血清蛋白的分泌，如补体和凝血因子、转铁蛋白和白蛋白样蛋。此外，斑马鱼与人类基因的同源性高达87%，基因信号传导通路、代谢通路也与哺乳动物高度相似。研究人员利用斑马鱼和哺乳动物在肝细胞组成、功能以及遗传学方面的相似性可深入了解主要肝脏疾病的发病机制。且斑马鱼的肝脏功能发育完成于5d之内，药物的肝毒性评价结果往往在1周之内。

斑马鱼的基因组序列完整，易于操作。目前通过基因敲除或者敲入已经产生了超过1万个突变体，这些变化创造了新的生物医学模型，并且已经培育了几种斑马鱼转基因系来研究人类疾病。斑马鱼幼鱼尤其是胚胎具有光学透明性，因此通过光学显微镜就能够获得体内发育和多种病理过程的直观影像。

斑马鱼肝组织结构（→肝血窦，△肝细胞）

图片素材来源于文献《斑马鱼器官石蜡组织切片制作与观察》

近些年，斑马鱼研究中所需的分子遗传技术也得到快速发展。通过控制荧光蛋白表达就能够轻易的实现对肝细胞、肝内胆道细胞、内皮细胞和肝星状细胞的在体观察，更加有助于研究人员使用转基因技术实现器官发育、脏器大小、不同类型细胞之间相互作用以及对伤害反应的详细研究。不仅如此，研究者还可以利用这些转基因斑马鱼和荧光激活细胞分选术来分离不同类型的肝细胞，用于下游的组学和生物指标分析。

目前，商业上可用的荧光脂类类似物旨在用来观察活鱼体内脂质的摄取和处理，而且在检测肝胆损伤方面具有极高的敏感性。由于斑马鱼肝细胞的结构和功能与哺乳动物相似，哺乳动物肝毒性研究中常见的组织病理学切片和染色技术也同样适用于评价斑马鱼肝病组织病理学的改变。此外，传统的分子生物技术，比如RT-PCR，Western blot技术，免疫组化，基因编辑和组学技术也都适用于斑马鱼肝毒性评价中。

02 斑马鱼模型在肝脏疾病研究中的应用

非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是近年来发病率不断上升的一种疾病，其特点是肝细胞内脂肪的过度积累，而与过量饮酒无关。传统上，啮齿动物模型被广泛用于NAFLD的机制和测试候选药物研究。然而，使用啮齿动物模型往往涉及到研究者较大的经济负担，因此啮齿动物不适合大样本筛选。斑马鱼的肝脏在细胞结构、功能和遗传学上与人类肝脏相似，且具有高通量，经济负担较低的特性。这一发现促使研究人员使用斑马鱼来研究与人类肝脏发育相关的胚胎学和遗传学细节，以及肝脏疾病和潜在的肝病治疗方法。

NAFLD是一个广泛的分类，包含了单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH可能会从非酒精性脂肪性肝炎发展为纤维化，最终可能引发更严重的疾病。最近研究表明，斑马鱼的脂质代谢过程和NAFLD的发生机制与人类相似，肝脏代谢紊乱会引起人类和斑马鱼的脂肪肝，比如高脂肪或高糖的饮食、禁食、毒素暴露、蛋氨酸消耗和遗传因素。在极少数情况下，先天性代谢紊乱和其他遗传病也可引起脂肪肝。

最重要的是人类和斑马鱼FLD模型具有许多相似的特征，包括肝细胞的增大和膨胀、甘油三酯的积累、激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)的分泌通路功能障碍以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加等。此外，氧化应激和脂肪因子超载可促进炎症反应，加重肝细胞损伤、血管改变和纤维化。截止到目前，研究者利用转基因、化学诱导和饮食诱导等方法建立的斑马鱼NAFLD模型被应用于临床研究和药物评价中，而且斑马鱼在脂质代谢研究方面的潜力得到了积极的报道。

酒精性脂肪肝

长期饮酒是世界范围内慢性肝病的主要原因，酒精对肝脏的急性影响尤其令人担忧。几十年来，研究人员一直在使用含乙醇的利伯-迪卡里液体饲料喂食来诱导啮齿类动物的ALD模型。然而，这种饮食只能诱导啮齿类动物出现轻度脂肪变性，即使以接近人类正常醉酒状态酒精喂养长达9个月后才会出现ALD特征。近年来，斑马鱼幼鱼已成为一种新的酒精性肝病脊椎动物模型。斑马鱼幼鱼实验可以重复多次，展现出较强统计功能和详细实验设计的优势，目前最有效的研究主要集中在幼鱼对乙醇的急性效应上。然而，由于年龄的显著差异，幼鱼的实验结果可能不能准确地概括人类酗酒的状况。因此，研究者逐步开始将斑马鱼成鱼作为研究酒精肝的模式生物。

近期研究者发现，低浓度乙醇(0.2%) 处理成年斑马鱼4周能够引起脂肪变性和肝细胞膨胀，促进血清丙氨酸氨基转移酶活性、血糖和三酰甘油显著升高。且结果表明发现参与糖脂代谢、线粒体生物发生和功能、氧化应激和内质网应激的基因表达水平显著上调。总之，在低剂量慢性酒精暴露下，成年斑马鱼很好地再现了ALD患者的病理、代谢和应激反应状态。成年斑马鱼ALD模型可以作为研究人类慢性肝病的替代动物模型。目前，斑马鱼NAFLD模型已经被广泛的用于中药中具有显著NAFLD治疗活性的化合物的筛选和评价。

在斑马鱼的遗传学研究中，aft6是乙醇诱导脂肪变性的充分必要条件，UPR活化可以引起乙醇诱导的肝脏疾病。这些发现表明atf6是酒精诱导FLD的重要中介物质。有趣的是，转录组分析发现乙醇诱导的UPR-ome与atf6过表达诱导的基因几乎完全重叠。因此，atf6可能作为一种机制，感知和介导肝细胞蛋白分泌对酒精的反应，这有望能够将ALD与FLD的其他病因区分开来。IMRAN M 等最近的研究使用斑马鱼幼鱼来测试膜重塑对肝脏毒性的影响，结果表明将肥胖斑马鱼幼鱼同时暴露于苯并［a］芘和乙醇能够通过膜重塑诱导斑马鱼肝脏毒性。以上谈到的研究结果都有助于促使科学家开发出一种治疗脂肪肝疾病及其相关危险因素的方法。

肝纤维化和肝硬化

慢性肝损伤和炎症可导致胶原沉积和纤维化。肝纤维化和肝硬化(肝代谢和合成功能丧失)以及门脉高压患者血流动力学改变的血管汇合度是造成慢性肝病患者高发病率和高死亡率的原因。日益加重肝纤维化的负担和有效的抗纤维化治疗缺乏，突出了对肝纤维化途径和互补模型系统识别的必要性。目前临床上还没有有效的治疗方法来预防或逆转肝硬化，而任何新颖的治疗方法都需要临床前动物模型进行广泛试验。

众所周知，肝星状细胞(HSCs) 的活化是肝纤维化的核心，也是抗纤维化药物研究的主要焦点。有研究报道了斑马鱼胚胎肝纤维化模型。在水中加入乙醇后，斑马鱼胚胎出现急性纤维化反应，其特征是胶原蛋白和星状细胞增殖标记物(Hand-2)蛋白水平升高。在上述条件下，与人类一样，荧光蛋白标记的肝星状细胞被激活并能够分泌与纤维化有关的细胞外成分。同时，近期研究表明斑马鱼模型和人类在肝纤维化过程具有相似的转化途径。比如研究表明硫代乙酰胺(TAA)可能通过类似于人类和小鼠的作用机制可诱来导斑马鱼胚胎肝纤维化，同时，充质干细胞似乎可以阻止肝纤维化的发生；斑马鱼体内肝脏和培养的HSCs中MPI的缺失激活了纤维化反应，添加甘露糖可以减弱HSCs的激活，从而降低斑马鱼、培养激活的HSCs和乙醇激活的HSCs的纤维化激活。

以上研究结果都为未来的肝纤维化机制研究和改善肝纤维化程度治疗研究提供了一个有效快速模型。这种方法的一个局限性是，在成年斑马鱼中既没有观察到晚期纤维化，也没有观察到肝硬化。相反，在急性乙醇诱导肝脏疾病中发现了星状细胞活性的变化，这种变化可能被证明是一种有用的表型来筛选能够调节星状细胞活化的基因和化合物、开发抗纤维化的新疗法。

药物性肝损伤药物性肝损伤 (drug induced liver injury，DILI) 可导致大量肝细胞死亡而引起急性肝功能衰竭。鱼类肝细胞中能够表达多种CYP酶，这些酶能够通过与哺乳动物肝细胞相似的代谢途径代谢外源物质。3日龄(dpf)斑马鱼的肝脏已具有完整的代谢功能，因此3dpf的幼鱼通常被用于DILI相关研究。研究表明暴露于4-氯苯胺后斑马鱼肝脏首先出现的是修复过程，并且肝脏组织结构改变和动物存活率表现出明显的剂量相关性。此后斑马鱼模型被用来评估许多化合物的潜在肝毒性。目前有关乙酰氨基酚(扑热息痛) 和环境毒素对斑马鱼肝脏影响的研究已经取得了很大进展，利用斑马鱼来筛选肝毒性化合物的同时，斑马鱼也可能被用来筛选具有拮抗 DILI 的新化合物。事实，上许多生物技术公司已经利用斑马鱼的相对成本效益来评估大量化合物和药物的毒性。

结语

基于斑马鱼肝脏发育和病理、生理发展中所表现出的巨大优势，利用斑马鱼研究肝脏病理和药物诱导肝脏毒性的研究人员越来越多，斑马鱼肝胆疾病方面相关研究的文章数量也在同步增长。同时，新的工具和方法正在不断得到开发，包括基因编辑技术，大规模的化学筛选设备，先进的成像方法，肝细胞标记和跟踪等相关技术。斑马鱼的相关研究不仅能够增加我们对肝病机制的了解，还能在对临床患者进行测试之前确定新的治疗靶点，评价测试候选化合物的疗效和安全性。

总的来说，斑马鱼越来越被认为是肝病研究中一个有价值的新模型，它是体外细胞评价模型和体内啮齿动物模型系统的补充。对斑马鱼肝脏疾病模型的研究将为疾病发病机制相关的分子事件和细胞机制提供新的见解。通过斑马鱼进行高通量的基因筛选和化学筛选，有望为识别新的治疗目标提供巨大的机会。

以上内容参考自《中国中药杂志》发表的李芝奇、徐玥、赵霞、贾哲、王昭懿、冯丹、李翠柏、马志强、赵崇军、林瑞超等题为“斑马鱼作为一种重要的工具进行肝脏疾病研究”的论文。