前言

《柳叶刀》（Lancet）公布的一份数据显示，中国慢性肾脏病患病人数达1.3亿，也就是全国平均每10人里面就有一名慢性肾脏病患者，慢性肾脏病近年也逐渐脱离了所谓“老人病”的印象，年轻化趋势越来越明显。

由于哺乳动物胚胎于体内发育，肾脏结构复杂，难以研究，人们对于肾脏发生和肾单位结构分段的过程和机制了解较少。而斑马鱼肾脏在结构、功能和分子组成上均与人类肾脏相似，且斑马鱼具有独特的生理特征，如体外受精和体外发育，胚胎透明等，为人类肾脏发育和肾脏疾病的研究提供了可视化窗口。接下来，本文从斑马鱼在肾脏领域研究中的应用对其进行介绍，重点介绍斑马鱼在肾脏发育、肾小球疾病、急性肾损伤( AKI)和肾脏再生、多囊性肾病等领域中的应用及进展。

斑马鱼胚胎前肾结构(背侧观)

图源 | 文献《斑马鱼在急性肾损伤研究中的应用进展》

斑马鱼模型在肾脏疾病研究中的应用

斑马鱼模型在肾小球疾病研究中的应用

肾脏的发育和行使功能需要固有细胞协调作用，足细胞在肾小球毛细血管袢的形成中发挥了至关重要的作用。足细胞是维持肾小球滤过膜结构和功能完整的主要细胞之一，足细胞损伤与蛋白尿水平和肾小球硬化密切相关。Zhou 等和 Huang 等构建了可诱导性损伤足细胞的转基因斑马鱼模型(pod：NTR-mCherry)，该转基因斑马鱼足细胞上高表达硝基还原酶(pod：NTR-mCherry)，在含有甲硝唑(MTZ)的溶液中时，硝基还原酶将甲硝唑的硝基还原为具有细胞毒性的氨基代谢物，特异性诱导表达硝基还原酶的足细胞损伤，斑马鱼出现严重足突融合，足细胞凋亡，随着肾小球滤过屏障破坏，斑马鱼出现蛋白尿，眼周和心包水肿。这些表型与足细胞损伤的啮齿类动物模型和人类肾病综合征患者表型高度一致，进一步支持了斑马鱼作为肾病动物模型的有效性。

此外，Gee 等应用外显子测序和纯合子定位技术(homozygosity mapping and whole-exome sequencing)发现上皮膜蛋白 2 突变(EMP2) 单基因突变可致肾病综合征。有研究人员应用基因组编辑核酸酶TALEN 技术在对斑马鱼 EMP2 突变体的研究中，发现 emp2 缺失可上调肾小球内窖蛋白 1(Caveolin-1)的表达，并加重 MTZ 诱导的 NTR 转基因鱼的损伤。在足细胞上特异性高表达窖蛋白 1，能够重现 emp2斑马鱼突变体的表型，激素类药物能减少 Caveolin-1基因在足细胞中的表达，进而改善 emp2 突变体中足细胞损伤和蛋白尿。提示 Caveolin-1 基因可能是一个新的治疗肾病综合征和足细胞损伤的药物靶点。

斑马鱼模型还是强大的高通量基因功能筛选评价平台。在组学时代，肾小球滤过屏障功能或蛋白尿发生相关的基因不断被发现。通过 morpholino 瞬时抑制斑马鱼基因表达，研究人员相继发现核孔蛋白107(Nucleoporin 107 kD，NUP107)，KANK (KN Motif And Ankyrin Repeat Domains)，TMEM234(Transmembrane Protein 234 )，鼠双微体2( Murine double minute-2，MDM2 )，发动蛋白2(dynamin2)，Rho-GTPase 结合蛋白 IQGAP2 (IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 2)，载脂蛋白L1 (APOL1)，ADCK4 (AarF Domain Containing Kinase 4)，ARHGDIA［Ｒho GDP Dissociation Inhibitor (GDI) Alpha］，Fan1 (FANCD2 /FANCI-Associated Nuclease 1)等基因缺失可模拟人类肾病表型。Morpholino 的结果还需要在斑马鱼基因突变体中进一步验证，Sanger 斑马鱼基因组突变计划显示，只有约 20% morpholino 表型可在突变体中得到证实。得益于 CRISPR/Cas9 等基因组编辑技术的进步，研究人员能够更加迅速且准确地编辑基因靶标。

斑马鱼在 AKI 和肾脏再生研究中的应用

AKI 是一种常见的临床综合征。Hentschel等首次建立了斑马鱼 AKI 模型，应用庆大霉素或顺铂注射 50hpf 或 72hpf 的斑马鱼胚胎的心脏静脉窦，可剂量依赖性诱导斑马鱼模型出现眼周和心包水肿，肾小球和肾小管扩张，随后脱落的上皮细胞堵塞管腔，造成梗阻；超微结构可观察到肾小管上皮细胞内溶酶体增加，这是氨基糖甙类药物肾损伤的典型病理特征。在庆大霉素肾损伤斑马鱼血管内注入菊粉或 10 kD 荧光素标记葡聚糖，可发现斑马鱼菊粉清除率和近端肾小管重吸收葡聚糖能力明显减弱，庆大霉素诱导的上述斑马鱼肾损伤表型与人AKI 的临床表现相似。

目前，人们对 AKI 损伤后肾单位再生情况所知甚少。肾损伤分子 1(KIM-1) 是 T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子 4(TIMD4) 和甲型肝炎病毒的膜受体，在急性和慢性肾损伤情况下，近曲小管 KIM-1表达上调。斑马鱼的 KIM 家族包含 KIM-1，KIM-3和 KIM-4。Yin 等研究显示，持续的 KIM-1 表达可通过 mTOR 通路导致斑马鱼慢性肾损害。庆大霉素诱导的斑马鱼肾脏急性损伤中，KIM-1 表达明显上调，并且伴斑马鱼的生长抑制，斑马鱼肾小管组成型或诱导性表达 Kim-1 可致小管刷状缘脱落，GFR 降低，心包水肿，鱼生长减缓和死亡率增加。由于 KIM-1 表达可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 通路，研究人员应用雷帕霉素抑制 mTOR信号通路可明显提高斑马鱼模型的生存率。

视黄酸已应用于 AKI 模型的治疗，可减组织损伤和纤维化，但具体机制不明，

Chiba 等发现在小鼠和斑马鱼 AKI 模型中，视黄酸信号通路被激活，激活的视黄酸信号可影响 M1 和 M2 型巨噬细胞平衡。M1 型巨噬细胞参与促炎反应，且在宿主防御细菌和病毒感染中发挥核心作用。M2 巨噬细胞与抗炎反应、组织重构、纤维化及肿瘤疾病发展相关。AKI 后局部视黄酸表达上调可抑制 M1 型促炎巨噬细胞，减轻 AKI 后巨噬细胞依赖的炎性损伤；同时活化 M2 型巨噬细胞，促进组织修复。因为视黄酸信号在肾脏发育中起重要作用，而在发育成熟的肾脏表达量低，这一发现提示胚胎发育相关信号通路参与 AKI 后的组织修复。

斑马鱼在囊性肾病发病机制及治疗中的应用

囊性肾病是最普遍的人类遗传性疾病之一。常染色体显性多囊肾(ADPKD)的致病基因有多囊蛋白 1(PKDl) 和多囊蛋白 2(PKD2) 。常染色体隐性多囊肾(ARPKD)的致病基因为 PKHDJ。这 3 种基因编码的蛋白均位于肾小管上皮细胞的初级纤毛内，提示纤毛结构、功能异常可能是囊肿形成的共同通路。纤毛拥有正向转运和逆向转运的功能。纤毛行使双向转运功能的物质基础就是细胞纤毛内转运蛋白(IFT)。IFT 表达异常与肾囊肿的发生密切相关。Lee 等用 morpholino 抑制斑马鱼 ift46 表达，可引起斑马鱼身体向腹部弯曲弯曲、肾囊肿，心包水肿和视网膜发育异常等典型的纤毛病表型，其他类型的IFT，如 IFT54，IFT57，IFT81 和 IFT172 等功能异常也可导致相同表型的病变。

在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)中，PKD2基因突变可导致囊性纤维化转膜传导调节因子(CFTR)激活。CFTR是由 1480 个氨基酸组成的跨膜蛋白，主要参与膜内外氯离子运输。CFTR介导离子和体液分泌入囊腔，导致囊肿不断扩大。Roxo-Rosa 等应用斑马鱼枯否氏囊(Kupffer’s vesicle)这一在体模型研究 PKD2 对 CFTR 的作用。枯否氏囊是一个充满液体的囊状器官，源自聚集于尾芽处的背部前驱细胞(DFCS)，短暂存在于斑马鱼胚胎早期(约 14 hpf)，后期发育成体腔。PKD2 morphant 可使 KV 体积明显增大，CTFR 抑制剂(ouabain 或 CFTRinh-172)可以抑制囊腔的扩大，而 CTFR 激动剂(forskolin 和 IBMX)则能使囊腔的体积进一步扩大，显示 KV 囊腔的扩大依赖于 CTFR 的活性。这一研究揭示了 CTFR 在多囊肾进展中的重要作用，同时提出了多囊肾病的体内研究模型，由于斑马鱼胚胎的透明性，可实时观察和测量囊腔的体积，为多囊肾的研究提供了一个潜在的工具。

结语

斑马鱼肾脏的分子组成、结构和功能与高等哺乳动物后肾高度保守，是连接体外细胞研究模型和传统的啮齿类动物模型的“桥梁”。斑马鱼已用于正向和反向遗传学技术分析影响肾脏发育和疾病的基因及其功能，还包括药物筛选等。较之小鼠模型，斑马鱼适合于多重复杂基因操作以及高通量基因功能筛查，是一种极具前景的动物模型，将在肾脏病发育、疾病研究和治疗药物的筛选中发挥重要作用。

以上内容参考自《肾脏病与透析肾移植杂志》发表的陈朝红、刘志红题为“模式动物斑马鱼在肾脏疾病研究中的应用”的论文。