前言
消化系统疾病是指发生在口腔、唾液腺、食管、胃、肠、胆、胰腺、腹膜及网膜等脏器的疾病，包括消化器官的器质性和功能性疾病。随着生活方式、生活环境的改变及人口老龄化进程加速，消化系统疾病发病率逐年上升，成为新时代常见病。由此引发的消化道恶性肿瘤高发现象，皆表明消化系统疾病的防治不可小觑。而由于消化系统疾病类别繁多，一直以来缺乏防控能力评估标准，消化领域诊疗发展存在巨大挑战。
明确消化系统疾病发生的分子机制对疾病的预防和治疗具有重要意义。斑马鱼是一种独特的活体脊椎动物模型，与人类基因高度保守，早期胚胎透明，有助于对发育过程的实时观测。且斑马鱼器官及组织的癌变与人类极为相似，为肿瘤的发展、抗肿瘤药物的开发和筛选、最佳治疗方案的确定等提供了较好的肿瘤模型，如斑马鱼肝癌模型、结直肠模型、胰腺癌模型、胃癌模型等。此外，斑马鱼模型在遗传、分子机制以及药物筛选研究中展现出巨大的潜力，使之受到越来越广泛的关注与重视。本文主要总结了斑马鱼模型在消化系统疾病研究中的优势，以及以斑马鱼建立的消化系统疾病及肿瘤模型的应用进展。
斑马鱼模型在消化系统疾病研究中的优势
01转基因技术和成像技术的独特性
在斑马鱼中，有众多细胞特异性启动子驱动荧光蛋白表达的转基因株系，利用活体成像可以对消化道和其他组织中的细胞进行动态实时监控，这为消化系统疾病发病机制的研究提供了更好的视角。Silva 等利用中性粒细胞荧光报告基因斑马鱼及其幼体检测急性炎症反应，根据白细胞炎症指数对抗炎或者促炎化合物进行分类，筛选出两种具有良好抗炎作用的膳食酚酸（没食子酸以及阿魏酸）。
02低成本高效率
相对于小鼠动物模型，斑马鱼更易养殖，减少了实验支出。此外，斑马鱼三个半月即可达到性成熟，消化系统在受精5天后即可发育成熟并正常运作。一对斑马鱼一次可产200-300颗卵，间隔4-7天，又可进行下一次交配。这为消化系统疾病药物筛选和药物测试提供充足的实验动物，大大缩短了试验周期。同时，斑马鱼胚胎透明，体外受精，直接生活在水环境中，使鱼暴露在化学物质或者微生物的实验更易于进行。
03斑马鱼与哺乳动物消化系统的相似性
斑马鱼与人类基因的同源性达87%，且与人类有高度相似的消化系统，肝脏、胆囊、胰腺和肠道也具有类似的吸收和分泌功能。同时，斑马鱼的肠道发育在受精后18小时开始，内胚层细胞开始极化，随后是节段管腔的形成，上皮细胞和基质细胞的渐进式形态发生和分化，在受精后5天肠道发育完全。这与哺乳动物肠道发育时间顺序相同，都是先发育肠的吻侧部分，随后是后肠和中肠。此外，斑马鱼前中肠段在功能上类似于哺乳动物的小肠，后段则与哺乳动物大肠具有相同的特征。这都为利用斑马鱼模式生物研究人类消化系统疾病奠定了坚实的基础。
04斑马鱼作为消化道肿瘤研究模型的独特优势
斑马鱼肿瘤模型是近年兴起的一种活体脊椎动物模型，是目前最有前景的模式生物之一，能够自发产生与人类性质相似的肿瘤。斑马鱼具有独特的优势：胚胎透明，研究人员可实时观察和追踪癌细胞增殖、扩散、转移和血管生成；转基因斑马鱼casper及免疫缺陷斑马鱼成年后仍可保持透明状态，这使得斑马鱼肿瘤模型的应用不仅局限于其胚胎及幼鱼；可用于大规模基因筛选和活体高通量药物筛选；在人源性肿瘤异种移植（patient-derivedxenograft，PDX）中，斑马鱼 PDX（zPDX）成本低、实验周期短、所需样本数量小（通常每个斑马鱼胚胎需要100～200个细胞）。斑马鱼消化道肿瘤模型是一种适合从起始、进展、转移到移植的活体动物模型。目前通过转基因、基因组编辑技术、异种移植、药物诱导的毒性损伤等方法，已经建立了多种斑马鱼消化道肿瘤模型。
斑马鱼模型在消化系统疾病研究中的进展
斑马鱼模型在炎症性肠病中的研究进展
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn’s disease，CD）。近20年来的流行病学数据显示，全世界范围内IBD发病率呈现惊人的上升趋势。IBD病程漫长、易反复，严重者甚至会导致癌变。IBD发病原因复杂，其中主要包括遗传基因易感性、肠道共生菌群紊乱、免疫反应失调以及环境诱因等。随着对IBD发病机制的深入研究，其基础和临床研究都取得了长足的进展，但要根治IBD，还需对其发病机制进行更加深入的研究。在IBD发病机制、药物研发和靶向治疗研究中，疾病模型的建立是很重要的环节。
斑马鱼模型在IBD发病的遗传、分子机制以及药物筛选研究中展现出巨大的潜力，使之受到越来越广泛的关注与重视。根据模型的不同构建方式可以分为化学诱导模型、基因工程模型、细胞转移模型和基因突变模型。其中，化学诱导模型不需要进行基因筛选和繁殖传代，耗时少。处理方式主要是通过浸泡和肠道给药，易操作。所用药物易得，价格便宜，成本小。更重要的是，化学诱导模型模拟人类IBD典型临床症状的同时，也具备一些关键免疫学和组织病理学特征。因此，化学诱导模型是最常用并且应用最广泛的模型。按照处理的化学药物不同，斑马鱼IBD模型主要有三种：葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导的IBD模型、唑酮诱导的IBD模型和2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）诱导的IBD模型。
斑马鱼IBD模型在模拟重复肠损伤和修复方面具有突出优势，其中使用最广泛IBD模型就是由DSS诱导的。用DSS处理受精后三天的斑马鱼幼体，会导致细菌过度增长，中性粒细胞渗入肠道，促炎基因上调，以及细胞增殖整体被抑制，这与肠道菌群失调及DSS破坏肠黏膜屏障有关。此模型多用于溃疡性结肠炎病理机制及筛选治疗药物方面的研究。与DSS诱导慢性小鼠IBD模型需要几个月的建模周期不同，斑马鱼中重复性DSS损伤明显不能完全恢复、死亡率增加、黏液生成受损、自噬受损，这些都在两周之内发生。Huang等利用DSS诱导斑马鱼IBD模型探究了益生菌对IBD缓解和预防的积极作用，以及益生菌治疗IBD的有效性和安全性，建立了一种快速筛选益生菌候选菌的方法，并筛选出一株保护效果最好的菌——史密斯芽孢杆菌XY1。Di Paola等用DSS诱导的斑马鱼幼鱼肠炎研究表明，棕榈酰乙醇酰胺唑啉可降低DSS诱导的肠道损伤和黏液产生，并可以降低炎症和内质网应激相关基因的表达。
唑酮诱导的斑马鱼小肠结肠炎模型与相应的小鼠有很高的相似性，但是它的使用仅限于成年的、不透明的斑马鱼。TNBS诱导的模型具有造模时间短、可重复、易于诱导等优点，既可以模拟急性炎症反应，也可以模拟慢性炎症反应，是经典的IBD动物模型，主要用于克罗恩病的研究。TNBS可以诱导幼年斑马鱼，也可以诱导成年斑马鱼。处理斑马鱼幼鱼时，把受精后3天的斑马鱼幼鱼浸泡在TNBS中处理五天，则出现TNBS诱导小鼠结肠炎的特征；TNBS处理成年斑马鱼时，直肠内给药，6小时后，肠内有大量中性粒细胞浸润，造成肠血管系统破坏、中肠缩短、肠蠕动消失、肠道绒毛长度缩短等。可能由于TNBS为半抗原物质，可与大分子组织蛋白结合成为抗原，引发机体免疫反应，从而导致类似于IBD的症状。Uyttebroek 等使用TNBS诱导的IBD斑马鱼模型研究表明，斑马鱼的远肠段中胆碱能神经元比例显著降低，整个肠道中血清素能神经元的比例在炎症期间显著增加。
消化道肿瘤发病隐匿、早期诊断困难、缺乏有效的治疗手段，其发病率及死亡率均处于较高水平。截至2012年，全国恶性肿瘤发病率及死亡率位居首位的是肺癌，其次为胃癌、肝癌、结直肠癌和食管癌。因此，了解消化道肿瘤发生的分子机制、发现新的药物治疗靶点对其治疗具有重要意义。斑马鱼的肿瘤模型已被广泛应用于识别肿瘤生物标记物、寻找新的药物治疗靶点，其研究正开始为指导个性化的临床应用铺平道路。
斑马鱼在消化道肿瘤中的研究进展-肝癌
肝癌的发生是多因素（肝炎病毒感染、黄曲霉素中毒、过度饮酒、非酒精性脂肪肝病等）、多基因（抑癌基因TP53、抑癌基因PTEN等）、多信号转导途径（RB1、p53、Wnt 等途径）的复杂过程。在我国，乙型肝炎病毒慢性感染是原发性肝细胞癌发生的主要原因，乙肝病毒诱发肝癌的发生与染色体突变及特定致癌途径的激活有关。斑马鱼肝癌基因与人类有着高度的保守性。
研究表明，在p53转基因斑马鱼突变体模型中，乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X antigen，HBx）和酪氨酸激酶src的过度表达可导致斑马鱼肝脏组织癌变，与人类肝癌的形成机制相似。在原癌基因Myc转基因斑马鱼中，Myc表达升高能够导致肝细胞增殖、腺瘤形成及癌变。Myc转基因斑马鱼肝癌模型的分子特征与小鼠肝癌模型及人类肝癌分子特征相似。Nguyen等采用米非司酮诱导系统构建肝细胞癌转基因斑马鱼模型，实现了肝脏中致癌基因krasV12的表达。米非司酮诱导后可导致肝脏肿瘤的发生，而撤销诱导肿瘤则消退。分子检测结果表明，在krasV12介导的肝肿瘤过程中，Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR信号通路都被激活。使用ERKl/2特异性抑制剂PD98059联合PI3K特异性抑制剂LY294002或mTOR选择性抑制剂雷帕霉素阻断这两种信号通路后，转基因斑马鱼肝脏增殖受到明显抑制，此研究为针对Ras信号的分子靶向治疗提供了理论依据。
目前，基于肝癌发病机制尚未完全阐明且治疗方法有限，斑马鱼肝癌模型中分子信号通路的研究可为探索人类肝癌发病机制及开发新的治疗提供重要的参考依据。
斑马鱼在消化道肿瘤中的研究进展-结直肠癌
在斑马鱼的一生中，自发性肠道肿瘤并不常见。目前，斑马鱼肠道肿瘤模型多为异种移植。崔戈等利用骨形成蛋白和激活素跨膜抑制剂基因（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）过表达结肠癌细胞SW620，构建了一种人结直肠癌异种移植斑马鱼模型，发现BAMBI基因可显著促进此模型中人结直肠癌细胞发生肝转移。Fiors 等利用5例结直肠癌患者手术切除样本建立zPDX，发现结肠癌细胞能够在斑马鱼中增殖并生成新血管。根据国际结肠癌治疗指南，选用FOLFOX（奥沙利铂+亚叶酸钙+氟尿嘧啶）及FOLFIRI（伊立替康+亚叶酸钙+氟尿嘧啶）方案分别对患者及对应的zPDX进行药物干预，分析发现二者之间的相关性达4/5。该研究表明，zPDX可用于筛选治疗方案、制定个体化治疗。斑马鱼已成为研究肠道肿瘤的重要动物模型。
斑马鱼在消化道肿瘤中的研究进展-胰腺癌
在90%的胰腺癌中可发现K-RAS癌基因突变，Ras/Raf/MEK/ERK通路对癌细胞的增殖、凋亡和分化具有深远影响，该通路可被MEK抑制剂有效抑制。在由K-RAS引发的斑马鱼胰腺癌模型中，Gal4/UAS转基因体系被广泛应用。此系统能够评估K-RAS基因突变造成的不同影响，以及蛋白质改变对K-RAS 基因的影响，可精准识别肿瘤治疗策略的新靶点。利用Gal4/UAS系统能够研究参与胰腺癌发病过程的TGFβ、Wnt、Notch和Hedgehog等信号通路。
斑马鱼在消化道肿瘤中的研究进展-胃癌
胃癌是全球范围内威胁人类健康的主要疾病之一。我国癌症统计数据表明，胃癌在男性肿瘤中高居第二，女性肿瘤中位居第三，是我国癌症死亡的第二大原因。近年来，尽管靶向药物的应用在一定程度上改善了胃癌的预后，但晚期胃癌患者的平均存活时间仍不到12个月，5年生存率低至20%，这可能是由高异构性或其他未知机制导致的化疗不敏感或耐药所致。
斑马鱼没有胃及表达特定胃功能的基因，但在斑马鱼胃癌异种移植模型中，胃癌细胞在斑马鱼胚胎中的存活、血管生成、迁移及相关分子的表达都与人类有着较高相似性。有研究利用胃癌患者手术切除的胃癌组织成功建立了胃癌zPDX模型，14例组织样本中有9例成功移植到斑马鱼胚胎中，5例因组织细胞不易解离导致针状堵塞及移植失败，移植成功率达64%，比胃癌小鼠PDX模型中报告的（34%）要高得多，且所有胃癌组织样本在活胚胎中都表现出增殖、血管生成及转移潜力。
斑马鱼模型在肿瘤药物筛选中的研究进展
斑马鱼肿瘤移植模型已广泛应用于肿瘤细胞迁移相关基因功能的研究与抗肿瘤药物的筛选，可在短时间内为患者提供个体化精准治疗的信息，进而选择对患者最有效的治疗方法。
劳乔聪等分别应用胃癌、肝癌细胞株构建了zPDX模型，使用紫杉醇、伊立替康、羟基脲、顺铂和5-氟尿嘧啶干预胃癌zPDX模型，阿霉素、吉西他滨、羟基脲、顺铂和5-氟尿嘧啶干预肝癌zPDX模型，发现临床上效果显著的抗癌药物在zPDX模型中同样可抑制癌细胞的生长，同时显现出治疗效果的优劣之分。Wu等应用胃癌zPDX进行临床前药物敏感性研究，发现不同患者的胃癌细胞对5-氟尿嘧啶、多烯紫杉醇、阿帕替尼三种化疗药物的敏感性不。
zPDX能够直接观察到抗癌药物对肿瘤细胞的影响，可用于临床前药物筛选，甚至能够在临床中实时选择化疗药物，可能成为临床前实验的第一步，为筛选药物、制定个体化治疗方案、促进精准肿瘤学的发展提供一个很有前景的平台。
结语
通过斑马鱼体型小、产卵多、胚胎透明、试验周期短、成本低、基因操作技术应用方便等方面的优势，以及斑马鱼和人类在基因和免疫方面的相似性，使斑马鱼在消化系统疾病发病机制和治疗研究方面显示出巨大的价值，在药物筛选、开发新药、制定个体化治疗方案的研究方面也展现出广阔的应用前景。此外，zPDX消化道肿瘤模型的建立也有助于人类对消化道肿瘤的发病机制、靶向和个体化治疗有更深的见解，为精准肿瘤学的发展奠定基础。
以上内容参考自《生物学教学》发表的任玉平、张变红题为“斑马鱼模型在炎症性肠病研究中的应用”的文献，以及《肿瘤药学》发表的冀慧红、刘俊题为“斑马鱼在消化道肿瘤中的应用研究进展”的文献。
