前言
皮肤病是严重影响人民健康的常见病、多发病之一，如麻风、疥疮、真菌病、皮肤细菌感染等。且皮肤病的发病率很高，疾病类型从肿瘤到炎症，其后果可能严重到死亡和毁容。尽管体外实验和小鼠模型已经对皮肤病的发病机制和治疗方法的发展产生了重要的见解，但我们对这些疾病的理解仍然存在重大差距。
目前，将斑马鱼模型用于人类皮肤疾病的研究已经产生了令人鼓舞的结果，新的遗传工具的进化将增加可用模型的数量和质量，为人类皮肤病建模和开发未来的治疗方法提供了更大的机会。斑马鱼皮肤与人类皮肤的相似之处表明该模式生物特别适合研究肿瘤性和炎症性皮肤病，且斑马鱼良好的生物学特性使其非常适合活体高通量药物筛选。在过去的20年里，斑马鱼也越来越多地被用于模拟非肿瘤性皮肤病，如牛皮癣、白癜风、表皮大疱和慢性损伤等（表1）。接下来，本文将从斑马鱼皮肤的具体特征，以及斑马鱼模型在部分皮肤病研究中的应用对其进行介绍。
表1 斑马鱼类疾病模型中人类皮肤病的主要模型
斑马鱼的皮肤特征
在过去的二十年里，斑马鱼已经成为研究人类皮肤病的重要模式生物。斑马鱼具有高度同源的皮肤结构。与哺乳动物相似，斑马鱼的皮肤组织为两层：由多层角质形成细胞（KCs）组成的表皮，以及含有混合成纤维细胞、KCs、色素细胞和免疫细胞的真皮层。这些结构发育迅速，KCs最早在受精后1天出现，在受精后第6天形成表皮/真皮边界。大约在受精后25天，表达p63-的基底斑马鱼干细胞开始增殖，形成一层新的基底上瞬时扩增细胞。与人类皮肤类似，斑马鱼表皮干细胞的一个亚群在表皮增厚过程中参与不对称增殖并改变形状。在成年斑马鱼中，这种多层层状鳞状上皮被基底膜区与真皮分离。斑马鱼的黑素细胞与哺乳动物类似，是神经嵴来源的细胞，负责色素的产生。在成年斑马鱼中，黑色素细胞可以在两个位置发现：在鳞片顶部的表皮层和在皮下发现的高度组织化的条纹。
斑马鱼在皮肤结构上还有其他一些不同之处。作为水生动物，斑马鱼不需要哺乳动物角质层的不透水屏障功能。斑马鱼也没有毛囊，但是，斑马鱼身上覆盖着一排排重叠的鳞片，每个鳞片的底部都有一个类似于毛囊的功能。此外，斑马鱼也不存在皮脂腺。尽管存在这些差异，但斑马鱼皮肤的整体结构和细胞结构与哺乳动物皮肤还是相似的，非常适合研究人类皮肤疾病。
据统计，71.4%的人类蛋白质编码基因和82%的致病基因具有明确的斑马鱼同源物。其中包括与人类疾病相关的众多皮肤基因的同源基因，如表皮标记物BPAG1、PLEC1、角蛋（K）基因K1和K5，以及众多整合素和胶原编码基因。目前，遗传工具的发展和高效基因工程方法（如CRISPR/Cas9）的最新进展允许精确操纵致病基因和快速开发新的疾病模型。这些工具与保守性良好的遗传学相结合，可以直接创建新的组织特异性报告基因和疾病建模突变体。此外，斑马鱼还具有理想的光学特性，以及斑马鱼快速的体外发育和水媒药物给药优势使得高通量药物筛选成为可能。
斑马鱼模型在皮肤疾病研究中的进展
斑马鱼模型在先天性皮肤病中的研究进展
斑马鱼是研究先天性皮肤病的实用平台，特别适合研究遗传性色素沉着不足和色素沉着过度的疾病。色素沉着症，包括白化病、斑疹病和Waardenburg综合征等，是由控制黑素细胞功能基因的不同程度损伤引起的。控制黑素细胞发育的机制在斑马鱼中保守得很好，而在斑马鱼的直系物中发生突变色素产生基因显示低色素沉着表型。
Waardenburg 综合征是一种听觉色素障碍，由神经嵴形成和黑素细胞发育所必需的基因突变引起。斑马鱼和人类一样，sox10或mitfa的缺失会导致色素沉着缺陷和黑素细胞缺乏。同源基体的缺失导致黑素细胞存活和迁移的缺陷，这是在人类疾病中看到的模式的假设原因。以头发和皮肤缺乏色素沉着为典型的白化病，是由色素合成和转运基因如TYR和恰当命名的OCA2突变引起的。这些基因的斑马鱼同源基因突变导致斑马鱼色素脱色，反映了人类疾病的遗传/表型关系。
大疱性表皮松解症（Epidermolysis bullosa, EB）是一组罕见的遗传性皮肤病，其特征是皮肤易碎起泡。这些水泡是由构成皮表皮复合物并控制表皮粘连的结构蛋白缺乏引起的。由于其保守的表皮和真皮结构，斑马鱼是EB的合适模型。斑马鱼基底表皮结构缺陷的第一个模型是pen/lgl2突变体。这些丧失功能的突变体不能形成基底半粒，导致皮肤脱离基底膜和表皮过度增生，令人联想到人类EB。尽管该突变体表皮过度增生方面已被用于牛皮癣模型，但表皮/真皮粘附的破坏使该模型与EB最相似。随后的研究利用反向遗传学来靶向与人类EB相关的基因。随着利用斑马鱼建立EB模型开始，未来的研究可以将新的基因敲除模型与小分子上位实验相结合，以阐明EB发病机制。
此外，斑马鱼模型也有助于理解另外两种与mapk信号相关的疾病：Noonan综合征和LEOPARD综合征，以及被用来模拟先天性色素沉着症，并引出支撑其生物学的机制。2016年，Thomas 等人发现，眼部黑色素瘤驱动GNAQ和GNA11的嵌合表达驱动了色素血管斑状病中发现的先天性色素沉着。
斑马鱼模型在免疫介导和炎症性疾病中的研究进展
白癜风是一种以自身免疫介导的表皮黑素细胞破坏为特征的疾病，最近一直是斑马鱼建模尝试的主题。2018年，Zhou 等人研究了应激诱导的IL17和IL1β表达在促进白癜风中发生的黑素细胞破坏中的作用。IL-17治疗发育中的斑马鱼幼虫导致线粒体功能障碍和黑色素生成抑制，推测是通过kc衍生的IL1b表达。另一项研究开发了对γ分泌酶复合物亚基nicastrin的敲除。已经确定伽马分泌酶促进NOTCH信号传导，而NOTCH信号传导是正常色素沉着所必需的。与人类白癜风相似，这些nicastrin 缺乏的动物表现出皮肤炎症。然而，与免疫细胞可能导致黑素细胞死亡的白癜风不同，在这些突变体中，nicastrin缺乏导致黑素细胞坏死，这可能会招募免疫细胞。这些研究为KCs、细胞因子、免疫细胞和黑素细胞在皮肤炎症中的作用提供了有趣的见解。
银屑病与白癜风相似，是一种复杂的免疫介导疾病。银屑病的特征不是黑素细胞的破坏，而是KCs的过度增殖。KC增生导致红斑斑块鳞屑，全世界约有3%的人发生KC增生。2008年，Webb等人在描述atp1b1a突变体时，建立了最早的斑马鱼银屑病模型之一，该突变体是从乙基甲磺酸筛选中获得的。这些突变体丧失了atp1b1a的功能，表现出广泛的表皮过度增殖和KC分化缺陷，导致表皮细胞聚集，这是人类银屑病的所有关键特征。其他研究试图模拟银屑病的免疫成分。一系列研究建立了 spint1a缺失导致皮肤中性粒细胞浸润和KC-KC接触缺失的模型。中性粒细胞浸润引起慢性炎症和最终的KC增殖，都是人类银屑病的特征。这些研究建立了实时理解和可视化促炎和促增殖事件的模型，这对于更好地了解人类银屑病的发病机制将是非常宝贵的。
斑马鱼模型在伤口修复中的研究进展
伤口修复对于创伤、糖尿病、感染和许多其他疾病引起的伤口的恢复至关重要。修复需要复杂的细胞-细胞信号事件来恢复适当的组织功能和体内平衡。损伤检测、伤口闭合、急性瘢痕形成和亚急性伤口愈合的快速级联以精心安排的方式发生。这些过程需要KCs、成纤维细胞和常驻免疫细胞之间的协调。斑马鱼是一种高度再生的物种，能够再生它们的鳍、黑素细胞、皮肤、轴突，甚至心脏。由于其再生能力、光学透明度和保守的皮肤结构，斑马鱼模型对控制这些过程的机制产生了独特的见解。
第一个斑马鱼受伤模型使用尾鳍截肢，其中远端三分之二的鳍被剪断并在接下来的几周内再生。2009年，Niethammer 等人利用过氧化氢（H2O2）基因编码辐射传感器来可视化鱼鳍截肢后产生的动态ROS梯度。他们发现，需要Nox/duo介导的H2O2生产爆发才能将白细胞招募到伤口部位。其他研究证实，ROS的产生对于代偿性增殖和适当的鳍再生至关重要。类似的研究已经阐明了另一种先天免疫细胞巨噬细胞的作用。2014年，Petrie 等人发现巨噬细胞被招募到伤口部位，通过诱导的巨噬细胞特异性细胞杀伤来敲除巨噬细胞谱系会导致伤口愈合和尾鳍再生受损。四环素诱导工具（TetON）也被用于研究斑马鱼的尾鳍再生。Wehner 等人使用TetON系统证明 WNT 信号传导对再生至关重要。
最近的研究也试图将皮肤损伤和愈合的建模扩展到尾鳍截肢之外模型。Richardson等人开发了第一个真皮再生模型，当时他们用皮肤科激光创建了全层伤口。后来通过利用斑马鱼鳞片的脱毛来诱导斑马鱼皮肤的部分厚度伤口，对该模型进行了扩展。Chen等人设计了一种CreER-based系统，用于跟踪再生过程中的单个上皮细胞。这个强大的系统使得再生过程中个体迁移和增殖KCs的活体成像成为可能。
斑马鱼模型在黑色素瘤中的研究进展
黑色素瘤是一种致命的黑色素细胞恶性肿瘤，是大多数皮肤癌死亡的原因，全球每年有近6万名患者死亡。尽管大多数皮肤黑色素瘤在早期阶段被诊断和切除，但进展为转移性疾病的黑色素瘤的预后很差。新的小分子和免疫疗法改善了患者的预后，但仍有相当一部分患者死于黑色素瘤，这突显了对黑色素瘤形成有更深入了解的必要性。
为了建立第一个人类黑色素瘤的斑马鱼模型，Patton等人在肿瘤抑制因子p53功能丧失、p53（lf）突变体的黑色素细胞中表达人类癌基因BRAFV600E。这些Tg（mitfa：BRAFV600E）；p53（lf）斑马鱼产生的肿瘤在组织病理学上反映了人类黑色素瘤。自从这一具有里程碑意义的发现以来，其他人类基因，如NRASQ61K，已被用于设计斑马鱼皮肤黑色素瘤模型。通过比较人类黑色素瘤和斑马鱼黑色素瘤模型的遗传特征，还发现了对疾病进展至关重要的关键黑色素瘤修饰基因。这些研究和使用斑马鱼来模拟人类黑色素瘤已经得到了广泛的应用。
斑马鱼模型在异种移植和药物筛选中的研究进展
斑马鱼异种移植是了解皮肤癌疾病进展和治疗的关键工具（图1）。它们的透明性、可用的转基因报告者以及缺乏适应性免疫系统使得斑马鱼胚胎成为进行异种移植的方便系统。此外，它们的小体积、高繁殖力和高繁殖力有利于高通量药物筛选。除了在异种移植药物筛选方面的应用外，利用细胞特异性报告子对斑马鱼幼虫进行药物筛选已被用于发现癌基因（如 PRL3）的新功能或鉴定神经嵴的小分子调节因子。
已经开发出新的成年斑马鱼异种移植模型，可以在稳定的成年环境中长期植入和研究肿瘤生物学。这些工具允许为罕见的黑色素瘤亚型创建新的模型，并以快速的方式测试新的治疗方法。这些筛选可以与小鼠研究相结合，以进一步阐明疾病和治疗的保守机制。总之，这些模型为利用斑马鱼了解皮肤癌的发生、进展和治疗机制提供了一个全面的科研武器库。
图1 用于斑马鱼研究皮肤过程和病理的技术选择
结语
斑马鱼可以作为合适的动物模型以扩大我们对皮肤疾病的分子和细胞机制的理解并在皮肤病学中开发新的治疗策略。由于其低维护成本、高度保守的基因组和易于遗传操作，斑马鱼是皮肤科实验室临床前研究的优秀模型，填补了体外细胞培养和体内哺乳动物模型之间的空白，为人类皮肤病建模和开发未来的治疗方法提供了更大的机会。
以上部分内容参考自《Journal of Investigative Dermatology》发表的William Tyler Frantz、Craig J. Ceol题为“Research Techniques Made Simple：Zebrafifish Models for Human Dermatologic Disease”的文献。
