杂志：Molecular pharmaceutics

影响因子：4.9（2022-2023）

年份：2022

通讯作者：Carol S. Lim, and Kimberley J. Evason

通讯作者单位：Kimberley J. Evason-Department of Pathology and Huntsman Cancer Institute, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States;

Carol S. Lim-Department of Molecular Pharmaceutics, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States.

摘要

肝细胞癌（hepatellular carcinoma，HCC）的治疗方法很少，全球年死亡率超过80万，迫切需要新的治疗方法。尽管野生型p53基因疗法已被证明在HCC患者中是安全的，但尚未显示出足够的疗效。该研究旨在展示p53如何通过融合促凋亡BH3蛋白Bcl-2细胞死亡拮抗剂（Bad）来重新设计，以提高抗HCC活性，并可能产生一种新的HCC治疗药物p53-Bad*。p53-Bad*是p53和Bad的融合产物，有两个突变，S112A和S136A。我们通过荧光显微镜检测了不同p53突变状态的肝癌细胞系中p53- bad*的线粒体定位。我们用流式细胞术测定了p53-Bad*在4种肝癌细胞系中的凋亡活性。为了确定p53-Bad*在体内的作用，我们生成并分析了表达肝细胞特异性p53-Bad*的转基因斑马鱼。无论p53突变状态如何，p53-bad*都定位于线粒体，并且在早期、中期和晚期的凋亡实验中表现出优于WT p53的凋亡活性。通过肝体质量比和组织病理学检测，p53-Bad*可减轻斑马鱼HCC的肿瘤负荷。通过TUNEL染色检测，p53-Bad*在斑马鱼HCC中诱导了显著的细胞凋亡，而在非HCC鱼类中未诱导细胞凋亡。p53-bad*在斑马鱼体内可诱导不同p53突变状态的肝癌细胞系凋亡，诱导细胞凋亡/减轻HCC肿瘤负荷。p53-Bad*作为一种潜在的新型HCC治疗药物值得进一步研究。

关键词：肝癌，肿瘤抑制因子p53, Bcl-2细胞死亡拮抗剂，线粒体凋亡，p53-bad*融合 

前言

据估计，全球每年有80万人死于肝癌，不断上升的发病率（从1990年到2015年增加了75%）和高死亡率使肝细胞癌（HCC）成为最常见的肝癌类型，对全球健康构成巨大威胁。多年来，唯一被批准用于晚期HCC的系统性治疗是索拉非尼（sorafenib），这是一种酪氨酸激酶抑制剂，可将患者的总生存期提高2.8个月，但会引起明显的不良反应。治疗HCC迫切需要副作用更少的改进疗法，特别是对于疾病晚期和/或肝功能低下的患者。

HCC肿瘤具有独特的血管系统，75-80%的血液供应来自肝动脉。正常肝组织只有25%的血供来自肝动脉，大部分来自门静脉。这种二分法导致HCC特异性的自然机制，通常用于HCC治疗，如经动脉化疗栓塞或Y90放射栓塞，可缓解症状，延长无进展生存期，并使患者在更长的时间内保持移植资格。这种独特的HCC动脉内输送的特异性对基因治疗特别有利，因为基因治疗需要靶向给药才能成功。动脉内注射和瘤内注射均能有效地对肝癌进行基因治疗，虽然Gendicine显示出轻微毒性，并且成功地给药至HCC，但野生型（WT）p53基因疗法治疗HCC的疗效存在争议，而且尚未开展进一步试验，尽管几种p53再激活剂（APR-246和COTI-2）目前正在多种癌症类型中进行临床试验。

Gendicine p53基因疗法已在中国对许多癌症进行了试验虽然在某些癌症（如头颈部）比其他癌症（如卵巢癌）更成功，但WT p53基因治疗尚未被确定为成功的抗癌基因治疗方法。这种失败通常归因于癌细胞能够通过p53通路的替代突变、核p53效应的显性负抑制以及过去几代腺病毒载体的问题来克服WT p53的影响。

重新设计的p53融合结构显示出前景，将p53重定向到线粒体以增加凋亡潜能。WT p53主要定位于细胞核，在细胞核内四聚结合DNA，调节细胞代谢，控制糖酵解，诱导细胞周期阻滞、DNA修复、衰老、外源性凋亡和氧化磷酸化。WT p53也能定位线粒体——通常是微量的，凋亡细胞除外，在凋亡细胞中，单体p53刺激快速的内在凋亡。线粒体p53失活抗凋亡因子，激活促凋亡因子Bak和Bax，导致细胞色素C释放、凋亡体组装、caspase级联和细胞凋亡（图1）。线粒体p53诱导细胞凋亡的优点包括绕过核p53途径，增加凋亡诱导速度，减少癌细胞克服p53作用的可能突变池，并避免显性负作用。理论上允许强大的p53凋亡活性，无论肿瘤p53状态。这些作用可以通过p53与线粒体靶向信号（MTS）融合来实现，以增加线粒体定位，我们已经证明这可以诱导卵巢癌和乳腺癌的细胞凋亡。

图1 p53-Bad*与线粒体凋亡

(A)激活时，促凋亡蛋白Bak和Bax同质寡聚并诱导线粒体孔的形成，释放细胞色素c。这导致caspase级联激活，凋亡体的形成，并诱导凋亡。(B)抗凋亡因子如Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1与Bak和/或Bax结合，阻止同质寡聚。在线粒体，p53 (C)灭活抗凋亡因子，(D)激活Bak和Bax。(E)促凋亡的BH3-only蛋白如Bad与抗凋亡因子结合，释放Bak和Bax。(F) p53-Bad*定位于线粒体，使p53和Bad具有双重活性。

为了进一步增加凋亡活性，我们将p53融合到促凋亡的线粒体蛋白而不是mts中。细胞在抗凋亡因子和促凋亡因子的平衡下会导致线粒体凋亡。抗凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-W)可以隔离凋亡诱导剂Bak和Bax，而促凋亡的BH3蛋白(如Bad、Bid和Bim)具有BH3结构域，可以阻断抗凋亡因子上的Bak/Bax结合位点，阻止它们抑制细胞凋亡。癌细胞经常上调抗凋亡因子的水平，使这种平衡远离凋亡活性，在HCC中，Bcl-xL在三分之二的患者样本中高度上调。高Bcl-xL水平与患者中位生存时间减少31.4个月相关，并与Mcl-1水平升高相关(在51%的HCC患者样本中上调)。

由于p53同时抑制Mcl-1和Bcl-xL，预计通过与BH3蛋白融合，直接靶向这些抗凋亡因子中的任何一个，可以增加线粒体凋亡(除了p53线粒体定位的影响外)。我们选择Bad (Bcl-2细胞死亡拮抗剂)作为p53融合(p53-Bad)的理想候选者，因为它能强烈结合Bcl-xL, HCC中最高度上调的抗凋亡因子。Bad还能结合Bcl-W和Bcl-2。由于Bad与线粒体外膜结合而不是插入跨膜结构域，Bad也可能比其他BH3蛋白更有利，因为p53和Bad都需要结合不同的靶标来诱导细胞凋亡。

Bad在112和136位点含有两条丝氨酸，它们可以被磷酸化，导致支架蛋白14-3-3与Bad结合并随后被细胞质隔离将这些丝氨酸突变为丙氨酸消除了这些磷酸化位点，并产生了一种在文本中称为Bad*的蛋白质。我们之前的研究表明，p53-Bad*融合增加了线粒体在p53-Bad上的定位，并诱导卵巢癌细胞凋亡。本文详细介绍了线粒体定位、体外凋亡活性和p53-Bad*在斑马鱼体内抗肝癌的功效。

材料和方法

克隆：

构建体pCMV-EGFP、pCMV-EGFP-p53、pCMV-EGFP-bad、pCMV-EGFP-bad*、pCMV-EGFP-p53-bad、pCMV-EGFP-p53-bad*的克隆和突变与前作相同。

细胞系，维持和转染：

细胞系购自ATCC，在37℃和5% CO2条件下单层培养于烧瓶中。肝癌细胞系包括HepG2/C3A（C3A, HepG2衍生物，WT p53）、Hep3B2.1-7 （Hep3B, p53无效）、PLC/PRF/5（PP5，显性阴性p53）和Snu398（p53无效）。细胞保存在DMEM（C3A、Hep3B和PLC/PRF/5）或RPMI 1640（Snu398）中。培养基中添加1% L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和10% FBS（Atlanta Biologicals）。细胞以40万/孔的速度接种于六孔板（Sigma Aldrich）进行检测或两孔观察室（Thermo Fisher）进行显微镜观察。24小时后，按照制造商的说明，使用JetPrime试剂（PolyPlus Transfection）转染每孔1pmol DNA。所有实验均在细胞传代5至20代之间进行。

线粒体染色、显微镜和图像分析：

转染24小时后，细胞与之前一样染色，然后使用荧光尼康A1R共聚焦显微镜（Cell Imaging Core Facility，University of Utah）的60X Plan Apo油浸物镜成像。与之前一样，使用NIS软件进行图像可视化，并使用ImageJ中的JACoP插件进行Pearson’s correlation coefficient (PCC)共定位分析和post-Costes’自动阈值算法重复实验，每个构建物/细胞系≥30个细胞。

TMRE化验：

四甲基罗丹明乙酯(TMRE)测定方法如前所述。简单地说，细胞在转染24 h后成球，在100nM的TMRE（Invitrogen）中重悬，在37°C下孵育20-40m。孵育后，流式细胞仪分析细胞（FACS-canto-ii，使用FACS Diva软件，流式细胞仪核心设施，犹他大学）。实验重复3次，每3次独立转染，然后将最低的线粒体试验外膜通透性（MOMP）值设为0%，最高的MOMP值设为100%归一化，以结合实验。

Annexin V检测：

转染24 h后，收集培养基和细胞，制粒，在冷PBS中洗涤2次，然后悬浮在100 μL冷膜联蛋白结合缓冲液（Biolegend）中。每个样品加入5μL apc偶联膜联蛋白V（Biolegend），然后加入5μL 7-AAD（Biolegend），每次加入后，样品在室温下涡流孵育5 min。每个样品加入300 μL膜联蛋白结合缓冲液，旋流保存，在LSRFortessa（BD-BioSciences, Flow Cytometry Core Facility）上进行分析。检测细胞形态和EGFP（绿色荧光蛋白）表达（激发488 nm/检测507 nm），然后检测annexin V（激发640 nm/检测660 nm）和7-AAD（激发496 nm/检测785 nm）。每个结构在三个单独的实验中进行三次分析，并将膜联蛋白V数据归一化，最低（GFP）结构为0%，最高为100%。

7-AAD化验：

7-氨基放线菌素D测定方法同前。简单地说，转染后将细胞制成颗粒24h（PLC/PRF/5和Snu398）或48h（C3A和Hep3B2.1-7），然后在1.25μg/mL 7-AAD（Invitrogen）中重悬。细胞冰冻后，流式细胞术（FACS-Canto-II）对细胞进行分析每个实验重复3次，每3次独立转染，将7-AAD最低值设为0%，最高值设为100%归一化，将3次实验合并。

斑马鱼品系和Tg(fabp10a：p53-Bad*)斑马鱼的生成：

斑马鱼的所有护理和安乐死均按照犹他大学IACUC指南（21-09009）进行。雌性和雄性Tg（fabp10a：pt-β-cat）和野生型AB和TL保持不变。对于Tg（fabp10a：p53-Bad*），用引物5 ' -CTAGTTAGATCTATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3'和5' -TAAATTGCGGCCGCTCACTGGGAGGGGGCGGAG-3 '从pcpv-egfp-p53-Bad*中扩增出p53-Bad*，含有BglII和NotI位点。在fabp10a启动子之后，将p53-Bad*插入到含有晶状体特异性启动子晶体蛋白αa (cryaa)的质粒中，随后是mCherry荧光蛋白编码序列。该质粒还具有I-SceI限制性内切酶位点，可以产生转基因斑马鱼，简而言之，在奥林巴斯SZ51显微镜下，将单细胞期的胚胎同时微注射fabp10a：p53-Bad*质粒和I-SceI酶（New England Biolabs）。将受精后3~4天红眼睛的胚胎饲养至成年，并与野生型斑马鱼进行异交。将红眼睛的后代指定为F0个建立者，培养F0个在3−4 dpf表达cryaamCherry的后代，以维持p53-Bad*F1B系。

qRT-PCR：

使用Direct-zol RNA迷你试剂盒（zimo Research）对每个细胞系、转染细胞系和斑马鱼肝脏样本进行RNA提取。对于斑马鱼肝脏，切片在解剖后立即在- 80°C冷冻，研磨，然后在TriReagent（zimo Research）中涡流，然后提取RNA。提取RNA前，在TriReagent中涡流1x106个细胞/样品。在使用Superscript III第一链合成系统试剂盒（ThermoFisher）制备cDNA之前，将样品稀释至相同的RNA浓度。预先设计的Taqman探针（ThermoFisher）靶向人18S（Hs99999901_s1）、人Bad（Hs00997773_m1）、人p53（Hs01034254_g1 TP53）、人Mcl-1（Hs01050896_m1 MCL1）、人Bcl-2 （Hs01048932_g1 BCL2）、人Bcl-xL（Hs00236329_m1 BCL2L1）和斑马鱼β-actin （Dr03432610_m1 actb1）。使用Taqman Universal PCR Master Mix（ThermoFisher）在StepOnePlus实时荧光定量PCR机（Applied Biosystems）上在96孔板（Genesee Scientific）上运行qRT-PCR。每个样本的数据一式两份，根据标准曲线和18S（人细胞系样本）或β actin（斑马鱼样本）在Microsoft Excel中的表达进行归一化。

肝脏解剖与组织学：

将Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼（绿色眼睛）与Tg（fabp10a：p53-Bad*）基因F1B（红色眼睛）杂交，分析幼鱼和成年斑马鱼的组织学和肉眼变化。用荧光解剖显微镜观察受精后3天（dpf）或之后的眼睛颜色，将卵分为四组：(−)pt-β-cat/(−)p53-Bad*，(−)pt-β-cat/(+)p53-Bad*，（+）pt-β-cat/(−)p53-Bad*和(+)pt-β-cat(+)p53-Bad*。对于幼虫实验，斑马鱼被安乐死、解剖，和以前一样分析。成虫实验中，饲养3只p53-Bad* f1bxβ-cat，并将其饲养在平行箱中（每箱4只）。受精后6个月（mpf），斑马鱼被快速冷却安乐死。通过检查眼睛颜色来确定基因型。称重斑马鱼，用奥林巴斯SZ51显微镜解剖肝脏，PBS冲洗，称重。计算肝脏与身体的质量比。肝脏样品在4%多聚甲醛中固定24-48 h，然后在70%乙醇中保存。样品涂上蓝色或黑色组织标记染料（StatLab医疗产品），喷洒3%醋酸，干燥5-10 s，用70%乙醇冲洗，包装在盒中，然后提交给ARUP实验室进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（H&E）染色。完成的载玻片经盲法处理，由专业病理学家K.J.E.和以前一样分析组织学变化标本被划分为(1)HCC，(2)轻度改变，或(3)正常/轻微改变。在GraphPad Prism 9.2.0中对(+)pt-β-cat/(−)p53-Bad*组和(+)pt-β-cat/(+)p53-Bad*组进行Fischer精确检验。实验进行了三次（三个独立的离合器），每次都看到类似的趋势。图4是这些实验的汇总结果。

TUNEL检测：

未染色的石蜡包埋肝切片切片重新水化。对于TUNEL实验，载玻片用ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒（Millipore）处理，片段DNA DAB染色和甲基绿反染。使用尼康Eclipse TE2000-U显微镜捕获每个肝脏横切面的10个代表性框架（远离组织边缘和其他潜在的伪影）。对图片进行盲法处理，计数阳性染色（凋亡）细胞。阳性对照，在非转基因载玻片上进行DNaseI处理，显示肝细胞核弥漫性染色。采用Olympus BX53显微镜、DP73相机和cellSens Entry 1.16软件拍摄具有代表性的H&E和tunel染色切片。

统计数据：

除特别说明外，所有数据均采用GraphPad Prism 6.01或9.2.0的Tukey事后检验进行单因素方差分析，其中ns=不显著，*p< 0.05， **p<0.01， ***p< 0.001， ****p< 0.0001。

结果

荧光显微镜检测不同p53突变状态的肝癌细胞系中p53-bad*的线粒体定位

为了确定p53-bad和/或p53-bad*是否能够成功地使p53定位到线粒体，我们用三种不同p53状态的肝癌细胞系——c3a（p53 WT）、Hep3B（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）进行了实验。p53的细胞状态有两个问题：首先，我们的p53-bad结构体被假设会诱导细胞凋亡，而不管p53的状态如何；其次，细胞中的p53可能与p53-bad结构体四聚，导致p53-bad定位的改变和失活。r249s显性负p53突变是特别有趣的，因为在过去，WT p53基因治疗的显性负抑制一直是成功治疗癌症的障碍。

在显微镜研究中，Hoechst和MitoTracker染料分别表明细胞核和线粒体位置，并且通过GFP融合荧光定位构建体（图2A）。正如预期的那样，所有细胞系均未显示GFP对照的特异性定位模式，也未显示WT p53构建体的核定位模式13所有细胞系也显示了p53-Bad的细胞核和线粒体定位，这很可能是由于p53的细胞核定位信号和Bad的MTS之间的相互作用。S112A和S136A突变使Bad MTS能够如预期那样压倒p53的核定位信号。这种效应在不同细胞系中强度不同，这可能是由于p53状态不同。PLC/PRF/5 (R249S p53突变)似乎具有最强的p53-bad核内定位，低于0.6阈值的线粒体共定位PCC被认为是线粒体共定位(图2B)。这可能是由于p53-bad与突变的细胞p53结合，从而增加细胞核定位。Hep3B2.1-7是p53缺失的细胞，没有p53与p53 bad结合的能力。Hep3B2.1-7细胞核定位最少，被认为是线粒体共定位(PCC>0.6)。野生型p53细胞系C3A为中间核定位。所有三个细胞系的p53-Bad*均显示PCC>0.6，表明定量线粒体共定位，并且与p53-Bad相比线粒体定位更多(图2B)。

图2 HCC细胞系显微镜下测定线粒体定位抗

(A)转染CMV-GFP、CMV-GFP- bad、CMV-GFP- bad、CMV-GFP-p53- bad、CMV-GFP-p53- bad、CMV-GFP-p53- bad *的C3A (WT p53)、Hep3B2.1-7 (p53 null)和PLC/PRF/5 (p53 R249S)的代表性细胞。细胞核显示为蓝色(Hoechst)，线粒体显示为红色(MitoTracker)，每个结构体显示为绿色(GFP)。(B)红色(线粒体)和绿色(结构体)的PCC共定位分析。

细胞系凋亡检测p53-Bad*在4种肝癌细胞系中的凋亡活性

为了评估p53-Bad和p53-Bad*构建体是否诱导肝癌细胞凋亡，我们对C3A、PLC/PRF/5、Hep3B和Snu398细胞系进行了三种不同的凋亡检测。TMRE评估早期凋亡的MOMP变化，膜联蛋白V探索中期凋亡膜的变化，7-AAD监测细胞膜通透性的晚期凋亡转移。为了确保凋亡的差异不是由构建体的表达水平引起的，我们评估了每个细胞系，发现p53-bad *的表达与WT p53相比一致（图S2）。因此，与WT p53相比，p53-Bad*的凋亡作用可能被低估了，在表达水平相同的情况下，p53-Bad*的凋亡作用可能会进一步增强。

图S2 肝癌细胞系中p53 WT和p53-bad*蛋白表达水平直方图

与WT p53相比，p53-bad/p53-bad*在所有四种细胞系中都增加了MOMP活性（TMRE测定）（图3A）。这种效应在Hep3B细胞中最为显著，从WT p53到p53-bad和p53-bad*，MOMP增加了4倍以上。PLC/PRF/5和C3A细胞系显示从WT p53到p53- bad/p53-bad*的MOMP增加2-3倍。Snu398细胞显示，从WT p53到p53-bad，MOMP仅轻微增加，但从WT p53到p53-bad*，MOMP增加了约两倍（图S1）。p53-Bad*在PLC/PRF/5和Snu398细胞中引起的MOMP明显高于p53-Bad（图3A和S1）。在任何细胞系中，Bad和Bad*单独治疗的疗效都不如p53-Bad*强（p<0.0001）。

图S1 Snu398细胞的早、中、晚期凋亡测定

图3肝癌细胞系C3A、Hep3B和PLC/PRF/5的早、中、晚期凋亡测定对于早期凋亡的TMRE检测(左)，描述了MOMP阳性细胞的相对百分比。对于中期凋亡膜联蛋白V检测(中)，描绘了膜联蛋白V阳性细胞的相对百分比。对于晚期7-AAD检测(右)，描述了7-AAD阳性细胞的相对百分比。

annexin V测定的凋亡在所有四种细胞系中p53-Bad*结构中最为普遍（图3B）。与WT p53相比，C3A和Hep3B细胞中p53-bad*的膜联蛋白V凋亡均增加了约4倍，而PLC/PRF/5细胞也增加了约1.5倍。对于Snu398细胞，p53-bad*与WT p53相比，凋亡增加了约1.5倍，但通过膜联蛋白V测量，WT p53比p53-bad更有效地诱导凋亡（图S1）。Hep3B、PLC/PRF/5和Snu398细胞显示p53-Bad*诱导的凋亡量高于Bad和Bad* （p<0.0001）。

7-AAD，一种晚期凋亡的测量方法，也显示p53-Bad*是所有四种细胞系中最有效的凋亡诱导剂（图3C）。在C3A、PLC/PRF/5和Hep3B2.1−7细胞中，p53-bad*显示7-aad凋亡比WT p53增加2-3倍。在Snu398细胞中，p53-bad再次不如WT p53有效，但p53-bad*显示7-AAD凋亡活性比WT p53增加了1.5倍（图S1）。p53-Bad*在诱导凋亡方面均优于Bad和Bad*（p<0.0001）。

细胞系中mRNA基因表达的qRT-PCR分析显示，与其他三种细胞系相比，Snu398细胞中Bcl-xL的表达明显减少（图S3）。Hep3B细胞比其他细胞系表达更多的Mcl-1, PLC/PRF/5细胞比C3A或Snu398细胞表达更多的Mcl-1（图S3）。C3A细胞表达的Bcl-2明显高于Hep3B和PLC/PRF/5细胞，而Snu398细胞表达的Bcl-2明显高于PLC/PRF/5细胞。经WT p53、p53-bad或p53-bad*处理后，C3A细胞Bcl-xL mRNA水平升高（图S4）。与WT p53相比，Hep3B2.1-7在p53-bad或p53-bad*处理后显示出这种增加，PLC/PRF/5和Snu398细胞在p53-bad处理后显示出与WT p53相比Bcl-xL mRNA水平的增加（图S4）。

图S3 Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-2在肝癌细胞系中的表达

图S4 WT p53、p53-bad、p53-bad*治疗后Bcl-xL mRNA表达水平

斑马鱼的体内研究

作为确定p53-Bad*在活体脊椎动物中的作用的第一步，我们在肝细胞特异性fabp10a启动子的控制下产生了表达p53-Bad*的转基因斑马鱼。通过qRT-PCR，在Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑马鱼的代表性队列中证实了p53-Bad*的表达，同时使用靶向人类Bad和人类p53的探针（图S5）。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑马鱼可育，无明显表型。在6 dpf时，Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑马鱼和对照兄弟姐妹之间的肝脏大小没有显著差异（图S6）。总之，这些数据表明p53-Bad*不会破坏非癌性肝组织，至少不会超出斑马鱼肝脏的再生能力。

图S5 p53-Bad*在斑马鱼中的表达

图S6 斑马鱼受精后6天的幼虫肝脏大小

为了确定p53-Bad*对斑马鱼肝癌发生的影响，我们将Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑马鱼与Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼杂交，它们表达肝细胞特异性活化的β-catenin，并在6个月大时以约80%的外显率发展为HCC。我们分析了四个实验组：(1)非转基因(NT)；(2) Tg（fabp10a：p53-Bad*）；(3) Tg（fabp10a：pt-β-cat）；(4)Tg（fabp10a：p53-Bad*）；Tg（fabp10a：pt-β-cat）。所有四组均增加至6 mpf，称重，然后解剖计算肝脏与身体的质量比，这是肝脏肿瘤负荷的指标（图4A）。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑马鱼的肝脏与身体质量比与非转基因对照兄弟鱼相比无显著差异（平均0.025 vs 0.034，p= ns）。与之前一样，Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼的肝脏与身体质量比显著高于非转基因斑马鱼（平均值0.085 vs 0.034，p < 0.0001）。Tg（fabp10a：p53Bad*）、Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼表达肝细胞特异性p53-Bad*和pt-β-catenin的肝体质量比显著低于单独表达pt-β-catenin的Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼（平均0.044 vs 0.085， p < 0.0001）。

每个肝脏由委员会认证的病理学家K.J.E.进行组织学分析，并将其分为正常/轻微变化，轻度变化或HCC27（图4B，C）。与之前一样，27条表达肝细胞特异性激活β-catenin的斑马鱼比非转基因的对照兄弟鱼明显显示更多的HCC（图4B, 87.5% vs 0%;Fisher精确检验，p < 0.0001）。肝细胞特异性p53-Bad*的共表达导致表达肝细胞特异性活化β-catenin的斑马鱼的HCC水平显著降低（图4B，67.4 vs 87.5%；Fischer精确检验，p = 0.04）。

图4 p53-Bad*对F1B p53-Bad*斑马鱼HCC肿瘤影响的表征

(A) p53-Bad*对肝-体质量比测定的肝癌肿瘤负荷的影响。(B) p53-Bad*对p53-Bad*的肝脏组织学影响。(C)未见明显病理异常的雄性斑马鱼(上图)-细胞核均匀、圆形、间隔规律，结构正常，包括分散的胆管(插图)；轻度改变(中图)-结构正常，包括胆管分散(箭头)，但偶见核增大(插图)；HCC(下图)-结构紊乱，核增大，多形性，不规则(插图)。

为了确定p53-Bad*在体内诱导的细胞凋亡活性，我们对斑马鱼肝脏切片进行TUNEL染色。非转基因、仅p53-Bad*和仅pt-β-cat斑马鱼每10个高倍场（HPF）分别显示0.83、1.33和1.60个凋亡小体（图5，p = ns，三种比较）。经p53-Bad*处理的pt-β-cat鱼平均每10 HPF有14个凋亡小体（图5，P < 0.01）。综上所述，这些数据支持p53-Bad*诱导细胞凋亡，导致β-catenin驱动的肝癌斑马鱼肝脏肿瘤负荷降低的假设。

图5 p53-Bad*/pt-β-cat斑马鱼的细胞凋亡

(A)斑马鱼肝脏横断面TUNEL法检测凋亡小体。(B) TUNEL染色代表性图像;箭头指向凋亡小体。

讨论

在这里，我们证明在p53状态可变的肝癌细胞系中，与p53-bad和WT p53相比，p53-bad*的线粒体定位和凋亡诱导增加。将这些结果扩展到斑马鱼体内肝癌模型，我们发现肝细胞特异性p53-Bad*减少了肝脏肿瘤负荷并促进了细胞凋亡。

无论p53状态或其他突变如何，我们的p53-bad*融合构建在所有肝癌细胞系和凋亡检测评估中均能显著诱导更多的细胞凋亡，最高可达WT p53的4.5倍。这一发现不是由于蛋白表达增加，因为在所有细胞系中，WT p53的表达水平始终高于p53-bad*（图S2）。尽管p53-Bad在大多数情况下被证明是一种强大的凋亡诱导剂，但对Snu398细胞的凋亡实验（图S1）表明，至少一些细胞系对p53-Bad*的反应明显高于p53-Bad。

尽管p53-bad*在四种细胞系中均能有效诱导凋亡，但不同细胞系中p53-bad*、p53-bad和WT p53的凋亡活性差异令人感兴趣，例如不同细胞系对WT p53的反应性存在差异，这可能与p53的突变状态有关。在C3A中，WT p53的存在需要癌细胞进化才能破坏p53的促凋亡作用。增加WT p53的表达可能不足以克服这些颠覆性机制。完全缺乏p53的Snu398细胞更容易受到WT p53过表达的影响（图S1）。单独使用Bad和Bad*的反应也存在差异，在C3A中，Bad和Bad*诱导细胞凋亡的效果始终高于WT p53（WT p53），在Snu398中，Bad和Bad*诱导细胞凋亡的效果低于WT p53（p53 null），在Hep3B2.1-7（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）中，不同检测方法之间存在差异。Bcl-xL和Bcl-2水平在细胞系之间的差异至少可以部分解释这一现象；C3A对Bad和Bad*最敏感，与其他细胞系相比，Bcl-xL和Bcl-2 （Bad的主要和次要结合伴侣）的表达水平也较高（图S3）。Hep3B2.1-7和PLC/PRF/5细胞在Bad和Bad*的作用下表现出中等水平的凋亡活性（图3），与其他细胞系相比，它们的Bcl-xL水平相对较高，但Bcl-2水平非常低（图S3）。对Bad/Bad*最不敏感的Snu398细胞Bcl-2水平有所升高，但Bcl-xL水平相对较低（图S3）。就与p53-Bad*的相互作用而言，Bcl-xL可能是这些因子中最关键的，因为Bcl-xL是Bad的主要结合伙伴；Bcl-xL水平似乎比Bcl-2对Bad/Bad*疗效的影响更大，而Snu398细胞是唯一Bcl-xL水平显著降低的细胞系，在WT p53和p53-Bad*之间，其凋亡活性的改善最小（图S1）。

基于这一想法，我们简要探讨了我们的构建物对细胞中Bcl-xL表达水平的影响（图S4）。Hep3B2.1-7细胞经p53-Bad或p53-Bad*处理后，与未处理和WT p53处理的细胞相比，Bcl-xL mRNA增加（图S4）。一种可能的解释是，癌细胞对治疗的反应是增加Bcl-xL水平，试图从凋亡中恢复过来。这种效应可能被略微高估了，因为在这个时间点仍然存活的细胞自然会比已经发生凋亡的细胞平均表达更多的Bcl-xL。有趣的是在PLC/PRF/5细胞中，转染p53-Bad后Bcl-xL水平升高，而转染p53-Bad*后Bcl-xL水平升高（图S4）。这可能是由于p53-Bad*杀死癌细胞的速度更快，使癌细胞对这种结构做出反应的时间更少。正如在所有细胞系中看到的p53-Bad*的强凋亡作用所证明的那样（图3），这些反应似乎不足以通过p53-Bad*阻止细胞凋亡，这可能是由于p53-Bad*融合与线粒体凋亡相关因子的相互作用比单独的Bad更多（图1）。

在Hep3B2.1-7中，WT p53诱导的凋亡比在Snu398中少，尽管这两种细胞系都是p53均为零。这种差异的一个可能解释是这些细胞系之间关键基因如Bcl-xL、Mcl-1和/或β-catenin的不同表达。我们发现，与Hep3B相比，Snu398中Bcl-xL和Mcl-1的表达较低（图S3）。由于单独表达p53不足以诱导Hep3B细胞凋亡，必须通过抑制Bcl-xL来补充，因此Bcl-xL在Snu398细胞中的低表达可能使其比Hep3B更容易被p53诱导凋亡。同样，Hep3B细胞比Snu398细胞具有更高水平的活性β-连环蛋白。p53已被证明可促进β-catenin的降解，因此，β-catenin含量高的细胞（如Hep3B）可能比β-catenin含量低的细胞（如Snu398）需要更多的p53才能成功中和额外的β-catenin。

接下来，我们探讨了p53-Bad*在脊椎动物HCC模型中的疗效。我们产生了一种转基因斑马鱼品系Tg（fabp10a：p53-Bad*），在肝脏细胞中表达p53-Bad*，并将其与Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼杂交，其中活化的β-catenin的肝细胞特异性表达导致约80%的斑马鱼发生6 mpf的HCC。我们发现p53-Bad*基因在β-catenin驱动的HCC模型中显著降低了肝脏肿瘤负荷，增加了细胞凋亡。这一令人信服的发现表明，p53-Bad*在脊椎动物模型中抑制肝癌的发生，而不会引起实质性的毒性。

我们观察到p53-Bad*没有显著增加非癌性斑马鱼肝脏的细胞凋亡，至少有三种可能的解释。首先，p53-Bad*在斑马鱼肝细胞中的表达水平可能不足以导致细胞死亡。这种解释不太可能，因为(a) p53-Bad*是由一种强的肝细胞特异性启动子fabp10a驱动的；(b)通过qPCR检测斑马鱼肝脏中p53-Bad*的显著表达；(c)在p53-Bad*转基因存在的情况下，斑马鱼HCC的肝脏更小，细胞凋亡更多，支持p53-Bad*凋亡活性。其次，p53-Bad*可能在大多数斑马鱼肝细胞中诱导细胞死亡，但p53-Bad*转基因沉默发生在一小部分肝细胞中，这些细胞能够重新填充肝脏。完全转基因沉默似乎不能解释p53-Bad*在非hcc斑马鱼中的低毒性，因为我们在Tg（fabp10a：p53-Bad*）和Tg（fabp10a：p53-Bad*）；Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼中检测到类似的p53-Bad*表达。尽管如此，转基因沉默和随后的再生可能至少是低毒性的部分原因，特别是如果至少一些斑马鱼肝细胞中的p53-Bad*水平低到足以使细胞逐渐凋亡。第三，p53-bad*可以保留部分WT p53的癌特异性。这种可能性是出乎意料的，因为大多数p53的癌症特异性是通过其作为核转录因子的作用发生的，因此p53-bad*应该在线粒体中丢失。总的来说，我们假设在表达p53-bad*的非hcc斑马鱼中观察到的低毒性涉及部分转基因沉默、肝细胞再生和可能保留的一些p53癌症特异性的组合。

斑马鱼HCC模型的两个局限性是其体积小，这阻碍了局部递送方法，以及缺乏建立的斑马鱼HCC特异性启动子，如甲胎蛋白，甘聚糖-3和白蛋白。我们实验室未来的研究旨在探索基于甲胎蛋白的启动子在HCC小鼠模型中的癌症特异性递送。在更大的动物模型和人类患者中，在p53-Bad*构建体中加入动脉内或肿瘤内递送和/或hcc特异性启动子可以进一步增强p53-Bad*的有效性，同时限制毒性。

结语

综上所述，p53-bad*在所有测试的肝癌细胞系中都能持续诱导有效的细胞凋亡，并且无论p53的突变状态如何，它都能大大提了WT p53的凋亡活性，这表明它有望成为未来癌症基因治疗的一种方法，可以克服WT p53的许多缺点。在脊椎动物肝癌模型中，p53-Bad*有效地降低了肿瘤负荷和HCC发病率，并诱导了细胞凋亡，且毒性很小。这项研究是首个针对肝癌的同类研究，也是首个在体内证明p53-Bad*对任何癌症有效的研究。特别有趣的是，与我们的预期相反，p53-Bad*在斑马鱼中表现出最小的体内毒性，尽管在该模型中缺乏癌症特异性。这是令人鼓舞的证据，表明该基因结构可能保留了WT p53的一些癌症特异性，同时获得了增加的细胞凋亡功效，表明p53-bad*具有进一步开发用于各种HCC患者治疗的潜力。

基金：本项目由5R21CA241015-02基金会、ALSAM基金会、R01CA222570基金会等资助。

原文：Bowman K E R, Ahne L, O’Brien L, et al. p53-Bad*  Fusion  Gene  Therapy  Induces  Apoptosis  In  Vitro  and  Reduces  Zebrafish  Tumor  Burden  in  Hepatocellular  Carcinoma[J]. Molecular Pharmaceutics, 2022, 20(1): 331-340.

原文地址：https://pubs.acs.org/10.1021/acs.molpharmaceut.2c00665