杂志：Cell Death and Disease

影响因子：9.685（2022）

年份：2022

通讯作者：Francesca Maradonna, Camilla M. Fontana.

通讯作者单位：Department of Fisheries,Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.

摘要

背景：结肠癌是世界范围内的主要死亡原因之一。近年来，大麻素因其潜在的抗癌作用和症状管理而被广泛研究。一些体外研究报道了anandamide(AEA)阻断癌细胞增殖和迁移的能力，但体内研究的证据仍然缺乏。

方法：本研究评估了AEA暴露对移植HCT116细胞的斑马鱼胚胎的影响。将48hpf异种移植物分别暴露于10nMAEA、10nM大麻素1受体(CB1)拮抗剂/逆激动剂之一AM251和AEA+AM251，以验证AEA治疗的特异性效果。

结果：通过共聚焦显微镜评估AEA的有效性，结果表明这些异种移植物的肿瘤大小较小，肿瘤血管生成减少，并且没有微转移形成。为了获得AEA作用的更深入证据，通过分子分析完成了显微镜观察。对斑马鱼转录组进行的RNA测序报告了与细胞增殖、血管生成和免疫系统有关的基因的下调。相反，HCT116细胞转录不受AEA处理的影响。事实上，体外HCT116培养证实了AEA暴露不影响细胞增殖和活力，这表明肿瘤大小的减小主要取决于对鱼的直接影响，而不是对移植癌细胞的影响。AEA可通过socs3和pcnpmRNA及Vegfc蛋白水平降低细胞增殖和肿瘤血管生成，并可通过il-11a、mhc1uba和csf3bmRNA的降低发挥抗炎作用。值得注意的是，在暴露于AM251的群体中获得的结果，其存在抵消了AEA的有益作用。

结论：本研究通过促进肿瘤生长和转移的能力，促进了AEA在个性化癌症治疗中的功效，并强烈支持将斑马鱼异种移植作为癌症研究的新兴模型平台。

关键词：结肠癌，斑马鱼，大肠癌细胞系HCT116细胞，显微注射，转化研究

前言

在过去的几十年里，大麻素被广泛用于姑息治疗，以缓解癌症患者的疼痛、缓解恶心和刺激食欲。然而，迄今为止的几项研究强调了使用大麻素时安全措施的重要性，以避免认知功能损害。另一方面，以大麻素为基础的药物在氧化应激过程的调节中的作用是认知障碍的基础，并认识到内源性大麻素系统(ECS)是这种神经保护活性的主要参与者。然而，在过去的几年里，大部分的兴趣指向增加大麻素抗肿瘤活性的知识，这取决于它们与ECS网络或其他细胞途径相互作用的能力，影响疾病的发生/进展。具体来说，越来越多的报道强调了大麻素在癌症扩散、侵袭、血管生成、迁移和转移机制中的作用。ECS激动剂通过与大麻素受体结合，激活Gi/o蛋白偶联受体，触发信号级联，下调促血管生成因子，包括血管内皮生长因子(vegf)和血管生成素-2(ang2)。此外，大麻素类化合物抑制血管生成和侵袭，诱导基质金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂的释放，而TIMP-1反过来又作为内源性基质金属蛋白酶2(MMP2)抑制剂。此外，大麻素能够影响Wnt通路，从而改变上皮-间质转化和化疗耐药的证据已经在不同的肿瘤类型中得到证实，并与β-catenin靶基因和间质标记物的减少有关[9]。以n-花生四烯酰基乙醇胺，anandamide(AEA)为研究对象，先前的体外实验结果证明了其在抑制乳腺肿瘤诱导的血管生成以及改变转移性黑色素瘤细胞的代谢、糖基化特征和迁移方面的作用。

以此为出发点，本研究旨在探讨AEA对人大肠癌细胞系HCT116细胞的抗肿瘤作用，了解其作用机制斑马鱼异种移植模型的体内作用。与患者来源的异种移植物(PDX)和类器官不同，它们具有显著的缺点，包括长时间的生长会给肿瘤带来遗传和表观遗传变化，而斑马鱼异种移植物试验具有几个优点。年轻的胚胎缺乏有效的免疫系统，因此，注射的癌细胞不会被排斥，原发肿瘤和微转移的形成很快。此外，对小而透明的异种移植物的成像可以捕捉到AEA对HCT116移植细胞或鱼本身的宏观变化。所有这些宏观证据都将与更深入的分子工具研究相结合，例如RNA测序和Westernblot，这将为理解AEA对肿瘤细胞增殖的作用机制提供基础，并有望成为未来研究的起点，将考虑使用这种大麻素进行体内癌症治疗。

方法

实验模型

使用野生型Tuebingen (WT)、Tg(fiT:EGFP[70]和Tg(mpeg1:EGFP)22[71]转基因斑马鱼系进行不同的分析。Tg(fli1:EGFP) y[70]在内皮细胞标志物fli1基因启动子的控制下表达EGFP[72]，而Tg(mpeg1:EGFP)922系呈现绿色荧光巨噬细胞群体。按照标准程序对鱼进行养护。0.17 mM KCl;0.33 CaCl;0.3 mM MgSO pH=7)。所有饲养和实验程序均符合意大利和欧洲保护科学用动物立法(指令2010/63/EU)。所有实验数据均以受精后小时数(hpf)、注射后小时数(hpi)和受精后天数(dpf)表示胚胎年龄。

细胞培养和标记

HCT116细胞的选择考虑了其去分化表型、侵袭和转移潜力以及临床意义。对细胞进行支原体检测(VenorGeM Classic,MinervaBiolabs GmbH，#11-1025)，并在含有glutamax-1的RPMI培养基1640中培养(赛默飞世尔科学公司，威瑟姆，USA，#61870036)，补充10%胎牛血清(赛默飞世尔科学公司，威瑟姆，USA，#10270106)，在37°C含5%CO2的湿化气氛中培养。对于异种移植，将细胞洗涤、trypsinized，并在含有Dil Vybrant红色荧光染料(赛默飞世尔科学,威瑟姆，USA，#V22885)的RPMI培养基中重新悬浮20分钟，温度37°C。然后将细胞以1200 rpm离心5 min，丢弃上清，用PBS洗涤细胞2次。最后，将细胞重新悬浮在PBS中注射到斑马鱼蛋黄中。

异种器官移植

将野生型(WT)、Tg(fi1:EGFP)和Tg(mpeg1:EGFP) 922斑马鱼胚胎在48 hpf时用0.04%的三卡因(Merck KGaA, Darmstad, Germany， #E10521)固定，并将其放置在含有2%琼脂糖的鱼水厚膜上。为了研究肿瘤体积以及与宿主和治疗分子的相互作用，将大约200-400个Dil标记(VybrantTM Dil)的HCT116细胞注射到卵黄囊的下段(补充图1)。为了研究肿瘤的转移潜力，将相同数量的细胞直接注射到居维叶静脉中。注射后，将异种移植物保持在35℃，直到实验结束。在3 hpi时，注射失败的异种移植物被丢弃。

体内和体外给药

花生四烯基乙醇酰胺（Anandamide-AEA）（Merck KGaA，达姆斯塔德，德国，#94421-68-8）和 1-(2,4-二氯苯基)-5(4-碘苯基)-4-甲基-N-1-哌啶基-1H -吡唑-3-甲酰胺 (AM251)（Merck KGaA，达姆斯塔德，德国，#183232-66-8），在100%乙醇中溶解，在鱼水中进一步稀释，并在10 nM下使用。

体内暴露

6 hpi时，将斑马鱼异种移植物随机分为4个实验组:

●对照(Ctrl):暴露于乙醇(乙醚)AEA:暴露于10nM AEA

●AM251:暴露于10nM AM251

●AEA+AM251:暴露10 nM AEA+10 nM AM251

每日更换化学药品，直至4 dpf。对照组接受了等量的用于溶解化学物质的乙醚。

体内实验的样本量在整个手稿的图例中显示。斑马鱼实验中使用的样本大小由alpha误差为0.05，统计力为95%确定。6个对照和6个突变/处理样本的最小数量由样本总体所需的大小暗示(sample size Calculator,ClinCalc.com)。荧光筛选后每个实验可获得的个体胚胎数量也对样本量有影响。

通常会影响卵窝5-10%的严重先天性异常被排除在分析之外。数据排除的目的仅是收集由特定治疗引起的具有生物学意义的表型，而不是来自野生动物中常见的零星变化。

体外暴露

采用细胞计数Kit-8比色法(CCK-8,Bimake，USA，#B34304)测定细胞活力。将HCT 116细胞用RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，USA，#61870010)和10%胎牛血清(FBS)以5个×10-3细胞/孔的密度接种于96孔板中。37℃孵育24 h后，取出培养基，加入含有0.5%FBS和AEA的新培养基。将AEA在EtOH中直接溶解于细胞培养基中至50µM溶液，然后依次稀释至最终测试浓度为5、10、100 nM和1、5µM。浓度的选择是基于先前在不同细胞系中评估AEA抗癌特性的体外研究。细胞在37°C下处理72小时，每天更换培养基，之后测量细胞活力。简单地说，在每孔中加入10µl CCK-8试剂，在37°C下孵育30 min，然后使用酶标仪(Infinite F200 PRO,Tecan,Männedorf，瑞士)测量450 nm处的吸光度。以对照组吸光度为100%细胞活力。存活率的计算公式为:“[处理细胞的OD(光密度)背景吸光度/未处理细胞的OD(对照)-背景吸光度]×100”。所有对照和样品均通过4个独立实验进行测量，每个浓度重复5次。数值以平均值±SD表示。

实时成像

用0.04%的三卡因麻醉3 dpi WT、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22异种移植物，包埋在1%的低熔点琼脂糖中，置于压片上，用共聚焦显微镜分析。尼康C2共聚焦系统(尼康，Minato，日本)，连同软件NIS ELEMENTS，被用来记录图像。在3 dpi时，注射于居维叶静脉的WT异种移植物用0.04%三卡因麻醉，包埋于1%低熔点琼脂糖中，置于凹载玻片上，使用徕卡DMR荧光显微镜(徕卡，Wetzlar，德国)和尼康DS-Fi2数码相机进行分析。

肿瘤体积、血管生成、转移势量化

使用尼康C2共聚焦系统获得的WT、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22异种移植物的所有图像使用Fiji成像软件(https://imagej.net/software/fiji/)进行分析。通过计算每个Z堆叠的肿瘤面积(红色荧光结构)获得肿瘤大小，同时使用图像计算器过程进行血管生成量化。为了仅识别内皮细胞，从fli1-eGFP信号中减去HCT116荧光信号。根据前人的工作计算总信号强度。使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22异种移植物进行巨噬细胞分析，通过计算肿瘤周围区域存在的巨噬细胞数量。为所有样本选择一个相等的区域。

通过计算在所有不同处理条件下发生微转移的3-dpi幼虫的数量来计算微转移动物的百分比，尽管只在蛋黄中注射。用Fiji成像软件分析动物居维叶静脉直接注射转移瘤的总荧光，观察治疗分子对转移瘤增殖的影响。

RNA提取，cDNA合成，实时荧光定量PCR

采用RNAzol RT(Merck KGaA，达姆斯塔，德国，#R4533)，从每组5池±20只幼虫中提取总RNA。基因组DNA通过DNase I酶切去除(Merck KGaA，达姆斯塔德，德国，#AMPD1)。RNA浓度测定采用P330纳米光度计(Implen,mnchen，德国)，完整性测定采用生物分析仪(Agilent,CA，USA)。总RNA的一部分用于cDNA合成，一部分用于建立RNA-seq文库。用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosys-tems，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，USA)从1μg总RNA中进行反转录。如前所述，qrt-pcr在CFX热循环器(Bio-rad，米兰，意大利)中用SYBR绿色法进行。对于每个实验组，重复(N=5)重复运行。最终引物浓度为10 pmol/μL。同时使用核糖体蛋白13(rpl13)和核糖体蛋白0(rplp0)mrna对CFX Manager软件3.1版(Bio-Rad)分析的靶基因表达水平进行归一化，包括GeneEx Macro Conversion和GenEx Macro文件，结果用条形图表示，并给出标准差。使用primer-blast设计靶基因的特异性引物对(Supplementary Table 1)。

智人/D RNA-seq分析及差异表达分析-鱼类异种移植

起始数据集包括来自四个实验组(Ctrl、AEA、AM251和AEA+AM251)的12个样本的RNA-seq reads。使用FASTQC软件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评估读取的质量，然后进行修剪步骤，以从读取中去除适配器和低质量碱基。使用以下参数:最小长度设置为35 bp，质量评分为25。TRIMMOMATIC软件[81]用于该范围。平均而言，每个样本获得了1.4亿个过滤读数。使用STAR aligner(version 2.7.9a)将高质量的reads与智人基因组(GRCh38-104)和D.rerio基因组(GRCz11-105)进行比对[82]。平均而言，0.74%的总reads可以在人类基因组上唯一定位，81.76%的reads可以在斑马鱼基因组上唯一定位。为了在这两个物种之间进行消歧，使用了disambigate软件。Feature-Counts(version 2.0.0)[83]用于计算作为原始片段计数的基因表达值。此外，通过使用m值的修剪平均值和每千基百万次归一化的片段，对原始片段计数进行归一化。

Western blot分析

从3个不同的池中取出全幼虫匀浆，每组15-20只幼虫，电泳并转移到PVDF上，如前所述。简单地说，每种蛋白质样品采用4%堆叠和10%分离的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离7 mg，并使用微型反式印迹电泳转移细胞(Bio-Rad，米兰，意大利)将其电印迹到过滤器上。使用Trans-Blot TurboTM transfer System进行30分钟的转移。阻断2%牛血清白蛋白(BSA;Merck KGaA,Darmstad,Germany，#A2153)在PBS中。以下初选抗体使用:LC3A/B(细胞信号，Beverly,MA，USA，#BK4108S)，Caspase 3(细胞信号，Beverly,MA，USA，#BK9661S)，IL6(Abcam，剑桥，英国，#ab208113，)和VEGFC(细胞信号，Beverly,MA，USA，#BK2445S，)抗体在含有2%BSA和0.1%TWEEN 20的PBS溶液中稀释1:1000，在4°C下孵育过夜。β-肌动蛋白抗体(细胞信号传导，Beverly,MA，USA，#BK4967S)作为内标。用ECL-PLUS(GE Healthcare,Milano,Italy)化学发光试剂进行Western blotting观察反应。使用Fiji Windows软件进行密度分析。

统计分析

RNA-seq统计分析用R和edgeR包进行。edgeR包确定差分表达式使用经验贝叶斯估计和基于负二项模型的精确测试。所有样本中没有表达的基因，即零计数被丢弃。显示FDR低于或等于0.05的基因被认为具有统计学意义。使用graphpad Prism V9.0.1进行qPCR、Western blot和成像统计分析。(GraphPad Software,Inc.，San Diego,CA，USA)采用Shapiro-Wilk检验评估各组数据均为正态分布(p>0.05)，采用Levene方差相等检验评估各组数据均为方差齐性(p>0.05)。数据以均数±SEM或±SD表示，并采用单向ANOVA和Dunnett多重比较检验进行分析。当收集到的数据以百分比表示时，在ANOVA之前进行arcsin变换。直方图柱上的星号(*)或不同字母表示组间变化具有统计学意义。p值设为p<0.05。使用Metaboanalyst 5.0在线平台(University of Aberta,Edmonton,AB,Canada)对数据集进行中位数、对数变换和Pareto标度归一化后，对p值<0.05的一组基因执行无监督PCA。为了可视化各组之间的分离，生成了一个2D评分图，绘制了前两个主成分，并计算了一个双标图，以获得有关投影中变量重要性的信息。

结果

移植最佳细胞数的优化

初步实验确定用于移植实验的HCT116细胞的最佳数量。根据先前的研究，胚胎注射200-400或500-1000个细胞(1-3)。结果表明，只有在移植200-400个细胞的鱼中，AEA浓度才能显著降低肿瘤细胞的增殖，因此以该细胞数为实验对象。

 补充图1 注射200-400个细胞和500-1000个细胞的WT异种移植物的HCT116肿瘤大小(3 dpi)以总Dil亮红色荧光测量

每个试验包括一个Ctrl组和一个AEA暴露组。取Ctrl中肿瘤大小的平均值为100%。误差条表示SEM (200-400 cells, Ctrl N = 17 AEA N = 12;500-1000个细胞，按Ctrl N= 11 AEA N=15)。统计学分析采用t检验分析。*， p < 0.05。

实验性治疗对HCT116斑马鱼异种移植肿瘤生长的影响

用共聚焦显微镜观察HCT116细胞荧光，测定肿瘤体积。有趣的是，在暴露于AEA的异种移植物中，肿瘤大小明显小于Ctrl(图1A,B)。这一结果表明，AEA可以通过影响正常细胞增殖来影响肿瘤生长。这一假设进一步得到了暴露于1-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-n-1-哌啶基-1h-吡唑-3-羧酰胺(AM251)，大麻素1(CB1)受体1逆激动剂/拮抗剂[16]/或AEA+AM251的异种移植物的证据的支持，其中肿瘤大小与Ctrl幼虫相似(图1B)。转移性沉积是癌症治疗的主要问题之一，在异种移植物中得到了进一步的研究。在所有实验组中都观察到HCT116细胞微转移，但在暴露于AEA的鱼中，与Ctrl鱼(28%)相比，显著减少(4%)，表明AEA对这一病理过程有积极作用。在Ctrl(28%)、AM251(28%)和AEA+AM251(24%)实验组中，出现转移的鱼的比例相似(图1C)。

图1AEA暴露控制异种移植物的肿瘤大小和转移发生

5dpf(3dpi)幼虫的代表性共聚焦z叠图像，肿瘤细胞被红色荧光标记(Dilvivid红色染色)。比例尺100µm。B定量总Dilvivid红色荧光。取Ctrl键下肿瘤大小的平均值为100%。误差条表示SEM。C四种实验条件下出现微转移的幼虫百分比。(按Ctrln=66;AEAn=73;AM251n=63;AEA+AM251n=69(5个独立实验)。采用单因素ANOVA进行统计分析。*p<0.01。用Biorender.com创建的图像。

实验处理对肿瘤血管生成的影响

使用Tg(fli1:EGFP)y1转基因异种移植物可以可视化鱼的血管形成(图2A)。特别是，在这些异种移植物中，重点关注靠近肿瘤区域的血管，直接参与其支持和生长。在暴露于AEA的鱼中，肿瘤周围的血管生成(图2B)比其他实验组更不发达。特别是，与肠下区域产生的血管相关的信号强度低于Ctrl组。同时，Ctrl组与单独使用AM251组或与AEA联合使用组之间无差异。此外，使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22转基因异种移植物获得的更深入的研究提供了证据，证明血管化的减少不是由肿瘤区域周围巨噬细胞募集的不同引起的，因为在所有实验组中都发现了相似的数量(补充图2)。

图2 AEA减少了fl1-gfp阳性异种移植物的血管化

5dpf(3dpi)幼虫的代表性共聚焦z叠图像，肿瘤用红色荧光(Dilvivid染色)突出，血管用绿色荧光(Tg(fli1:EGFP)y1线)标记。比例尺100µm。白框表示选择用于量化血管化的感兴趣区域(ROI)。B定量ROI的总绿色荧光与斐济分析。Ctrl键中的平均值设为100%。误差条表示SEM。采用单因素ANOVA进行统计分析*p<0.05;(Ctrln=18;AEAn=18;AM251n=19;AEA+AM251n=16(三个独立实验)。用Biorender.com创建的图像。

巨噬细胞量化

补充图2 HCT116细胞注射后mpeg1:EGFP幼虫(3 dpi)的巨噬细胞分析

定量巨噬细胞(gfp阳性细胞)在相似感兴趣区域(ROI)大小的数量。每个个体的荧光被归一化以表示其肿瘤体积。对照组中巨噬细胞的平均数量设为100%。误差条表示SEM (Ctrl N = 10;AEA N = 9;AM251 N = 8;Aea + am251 n =11)。样本量来源于三个独立的实验。

异种移植物中HCT116细胞转移潜能的评估

这些结果为更详细地分析AEA对转移发生的影响奠定了基础。因此，HCT116肿瘤细胞被直接注射到居维叶静脉，从而迫使转移出现。由于AEA作用特异性的证据是通过其抑制剂AM251进行实验获得的，因此本实验只考虑两个实验组:Ctrl和AEA。此外，由于精确控制居维叶静脉注射的HCT116细胞数量有时非常具有挑战性，因此在注射后3小时(3hpi)，根据注射的循环细胞数量将动物分为两个亚组:小组和大组(图3A)。各组异种移植物随机分为按Ctrl处理和AEA处理两种实验条件。在3dpi时，动物体内存在的转移细胞数量(以可检测到的红色荧光数量为单位)。如图3C和D所示，当肿瘤细胞直接进入血液循环时，AEA治疗可以减少转移的生长。

图3 AEA暴露降低HCT116转移能力

将HCT116细胞直接注射到48hpfWT幼虫的居维叶静脉中。图中显示了考虑到HCT116循环细胞数为3hpi的实验过程和异种移植物的分裂。图片由Biorender.com制作。B立体显微镜3dpiCtrl-(左)和AEA暴露的异种移植物(右)的代表性图像。白色箭头指向转移中的HCT116细胞。C,D注射少量(C)和大量(D)细胞的3dpi斑马鱼幼鱼HCT116转移瘤细胞的综合密度。Ctrl键下的综合密度均值设为100%。误差条表示SEM。

斑马鱼和HCT116RNA-seq和RT-PCR验证

从上述共聚焦显微镜研究获得的结果开始，进行RNA测序分析，揭示参与肿瘤细胞增殖、血管生成和免疫反应的分子标记。由于观察到重复之间存在很强的可变性，因此每个实验组一个重复被丢弃。丢弃样本的选择是基于主成分分析后所有样本的总体聚类，而不仅仅是特定比较中的聚类。在Ctrl组中，AEA组中有38个差异表达基因(DEGs)，8个上调，30个下调;AEA+AM251组中有6个DEGs,2个上调，4个下调。AM251与Ctrl幼虫之间未发现DEGs(见热图，图4)。对于智人基因组，不同实验组之间没有发现DEGs。RNAseq数据可通过NCBIBioproject-IDPRJNA911178获取。然而，RNA测序结果的准确性和可靠性得到了一系列Real-Timepcr的支持，无论是DEGs，假发现率(FDR)<0.05，还是考虑到它们在细胞增殖，血管生成和免疫系统中的作用(vegfaa,vegfab,vegfd,mep1b,socs3,csf3b,il11a,mhcIuba,pcnp,casp3)选择不具有统计学意义的基因(FDR≥0.05)。有关所选基因描述的详细信息见补充表1。不同实验组间的PCR结果见补充资料。如补充图3和4所示，逆转录定量的相对丰度聚合酶链反应(RT-qPCR)结果与RNA-Seq结果一致，表明两种技术的转录物鉴定和定量高度一致。从RNASeq分析中选择的基因与RT-qPCR的表达强度一致。

图4 热图显示了暴露于AEA和AEA+AM251的斑马鱼异种移植物中DEG的列表

AEAvsCtrl。BAEA+AM251vsCtrl。颜色刻度表示两组之间的折叠变化，如所述(绿色=下调，红色=上调)。仅纳入显著DEGs(FDR<=0.05)。箭头表示本研究中分析的DEGs。

补充表2 引物列表

补充表1基因鉴定、描述及相关Kegg通路

RT-PCR验证rna序列通过Real Time PCR对感兴趣的基因进行定量，以验证RNA测序结果。在AEA处理的异种移植物中，csf3b、il11、socs3、mhcluba和pcnp mRNA的表达显著下调。AM251组和AEA+AM251组的mRNA水平与对照组相似。在所选择的基因中，只有meplb的表达在AEA暴露的鱼中显著上调(补充图3 a-f)。根据RNA序列分析，casp3 (Supplementary Figure 4a)、vegfaa、vegfab和vegfc mRNA水平没有明显变化。然而，尽管没有统计学意义，AEA处理导致vegfs mRNA下调(补充图4 b-d)。

补充图3所选基因的实时PCR分析

Soc3 (a)， csf3b (b)， mhcluba (c)， meplb (d)， pcnp (e)， illa (f)mRNA水平异种移植物，对rplp0和rpll3a归一化。数据以平均SD (N-5)表示。各列上方星号*表示实验组间差异显著(P<0.05)，采用单因素方差分析，并进行Tukley多重比较检验。

补充图4异种移植物中casp3 (a)， vegfaa (b)， vegfab (c)， vegfd(d) mRNA水平，与rplp0和rpll3a归一化

数据以平均SD (N-5)表示。各列上方星号表示各实验组间差异显著(P<0.05)，采用单因素方差分析后再进行Tukey多重比较检验。

参与肿瘤细胞存活/生长的生物标志物分子分析

Westernblot分析Lc3A/B和Casp3WT异种移植物在实验组间无明显变化。相反，Vegf-C和Il6蛋白分析显示，暴露于AEA的异种移植物显著减少。单独暴露于AM251或与AEA联合暴露的异种移植物没有引起明显的变化(图5)。

图5AEA对血管生成和炎症相关分子靶点的影响

插图显示了不同实验组中具有代表性的Il6、Vegf-C、Casp3、Lc3A/B和β-ActWesternBlot。三个独立实验的密度分析，a.u(任意单位)aIl6,bVegf-C,cLc3A/b,dCasp3。每列上方不同字母表示组间统计差异(单因素方差分析，P<0.05)。

体外AEA对HCT116细胞增殖的影响

为了研究AEA暴露对细胞活力和增殖的影响，将HCT116细胞培养在0.005~5μM范围内的5种不同浓度的AEA中。体外试验在低血清浓度(即0.5%血清)下进行，以限制细胞生长并增加细胞对该化合物的反应性。事实上，大麻素的作用是细胞环境依赖的，受生长因子的存在调节。72h后使用CCK-8测定法评估细胞活力，但与之前在动物模型中观察到的结果相反，所有AEA浓度都没有抗增殖活性。下图为不同浓度AEA对细胞体外活力的影响(补充图5)

补充图5 AEA不影响HTC116细胞的体外活力

条形图显示不同AEA浓度下HCT116细胞的增殖情况。各列上方同字母(a)表示实验组间差异有统计学意义(P>0.05)。

多变量统计分析

计算PCA以可视化整个基因表达数据集。该技术允许将组内样本可视化为单个点，绘制在用计算的PC1构建的二维空间中。PC分数用于确定样本在二维空间中的位置。PC的顺序表明它们在数据集中的重要性，PC1占最大的变化量。从PCA中发现Ctrl与AM251和AEA+AM251基团重叠，而AEA基团单独聚集(图6A)，总的累积解释方差(68.8%)令人满意，表明AM251在与AEA联合给药时能够恢复Ctrl状态。生成双标图，显示加载分析和PCA(图6B)。该分析允许理解变量在构建模型中的贡献。每个变量的加载显示为红色箭头，并显示每个变量的名称(图6C)。箭头的长度与模型中的贡献成正比，箭头点与中轴线的距离反映了它们对PC1或PC2的贡献。为该模型提供最大变异的两个基因是soc3和mhcluba，前者对两种PC1的贡献几乎相同，而后者对PC1的贡献大于PC2。csf3b和il11a对PC1的贡献几乎相同，对PC2的贡献很小，而pcnp对PC1的贡献从图中可以看出，对PC2的贡献很小。此外，vegfc和mep1b仅显示出对PC1的轻微影响，同时IL-6对PC1内部构建的模型的贡献很小。

图6PCA显示AEA异种移植物明显分离，Ctrl、AM251和AEA+AM251基团重叠

Ctrl(红色)、AEA(绿色)、AM251(蓝色)和AEA+AM251(浅蓝色)的评分图A有95%置信区域或B没有95%置信区域。坐标轴显示PC1(63%)和PC2(19.3%)的分数。CBiplot显示了加载分析，红色箭头表示变量。下轴和左轴表示PC1和PC2的得分，上轴和右轴表示加载值。

讨论

从宏观证据出发，AEA暴露使异种移植物肠道亚血管化减少，从而影响肿瘤生长，综合本多学科方法获得的结果，强烈提示AEA能够改变肿瘤环境，使肿瘤细胞增殖条件变差，其生存能力不受直接影响。在这些异种移植物中，RNAseq确实揭示了这一点无论治疗方式如何，HCT116细胞转录本之间没有差异，这一证据通过体外癌细胞暴露于AEA进一步观察到。事实上，AEA暴露在每个测试浓度下都不影响细胞活力，更深入的分析，集中在10nM浓度下，显示暴露不影响细胞增殖和凋亡(数据未显示)。

RNAseq分析可以鉴定出一组转录本，这些转录本合作创建适合HCT116细胞增殖和肿瘤血管化的适当微环境。在DEGs中，考虑到socs3蛋白在结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌中的致癌作用，我们选择了细胞因子信号3的抑制因子socs3蛋白。一些研究描述了它通过激活Il-6/Jak/Stat3通路，在调节炎症、血管生成和细胞存活的关键蛋白，包括Vegf、Il-6和Bcl-2中的作用。因此，本研究的结果表明，AEA通过下调斑马鱼社会mRNA可能导致暴露于AEA的异种移植物中Il6和Vegf蛋白的减少，通过Westernblot分析，可能影响Il6/Jak/Stat3信号传导。该信号在观察结果中的关键作用也得到了PCA的证实。然而，RNA-seq显示jak1和stat3mRNA呈下降趋势，尽管不显著，这与报道AEA抗增殖作用的研究一致。对于Vegf家族成员，研究报道Vegf因子的低表达与影响血管生成的肿瘤体积减小一致。因此，正如之前在体外观察到的那样，在小鼠异种移植模型中，可以假设AEA可能通过降低VEGF水平来调节肿瘤增殖，从而影响内皮细胞和HCT116细胞之间VEGF/VEGFR2-的结合。此外，肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,tam)在缺氧条件下也能产生VEGF，分泌VEGF。因此，虽然没有观察到巨噬细胞数量的变化，但可以认为，AEA可能不会影响TAM的迁移，从而增加了它们的数量，而只是VEGF的分泌，从而造成了对肿瘤细胞生长不利的环境。事实上，已知HCT116细胞表达高水平的VEGF，通过旁分泌/自分泌血管内皮信号保证其生长。

事实上，在结直肠癌中，Vegf的高表达与预后不良相关，Vegf-c的下调导致肿瘤启动细胞减少和转移抑制，这支持了我们在异种移植中观察到的无转移。在aea诱导的DEGs中，集落刺激因子3(粒细胞)b(csf3b)是一种促进单核细胞和巨噬细胞活化的多效细胞因子，通过合成VEGF促进血管生成，特别是在原始内皮小管形成的早期。因此，其下调可能导致观察到的Vegf-C蛋白减少。

一些研究报道，AEA治疗可以通过调节炎症靶基因和激活炎性小体成分来减轻炎症。在这项竞赛中，RNA-seq分析和Westernblot数据均报告Il6水平下降，支持AEA抗炎活性。Il6的高产量确实会导致丰富的炎症环境，并能促进癌细胞的恶性转化，支持癌细胞的增殖、存活和转移传播。已知IL6通过作用于抗凋亡、血管生成、增殖和免疫反应因子，包括BCL-2、BCL-xL、VEGF和MMP2/9的转录，导致STAT3磷酸化和二聚化。

在这方面，在本研究中，人类和斑马鱼的转录组均显示bcl-2下调，尽管没有统计学意义，但可能与Il6减少有关，这与先前在IL6−/−小鼠中的研究结果一致。本研究中观察到的bcl2水平缺乏显著变化，表明细胞凋亡在肿瘤生理或幼虫生长中的作用都很微弱。这一结果得到了Caspase3分析的支持，实验组之间的mRNA和蛋白水平没有变化，这表明细胞凋亡在异种移植物生理的这一特定阶段起着边缘作用。

最近，一种新的参与细胞周期调控、转录和凋亡的核因子被发现，即含有pest的核蛋白(PCNP)。该因子以组织特异性的方式降解与肿瘤细胞生长和分化相关的残留蛋白。因此，我们测量的斑马鱼pcnp的下调可能与stat3和stat5的减少(尽管不显著)有关，影响了上述Il6/Jak/Stat3信号传导。

除了Il6,AEA处理也影响il11转录水平。Il11是与Il6细胞因子家族相关的细胞因子，控制抑制核因子NF-kB的释放，NF-kB是促炎细胞因子的转录激活因子。它已在包括胃肠道和肝脏在内的许多器官中被检测到，并已被证明可促进CRC和前列腺癌的进展。第一次，在我们的模型中，Cel结果表明，AEA诱导il-11显著下调，可能影响Il11/Stat3通路。这一结果与先前的数据一致，这些数据描述了内源性大麻素对JAKs和STAT家族成员以及白细胞介素的抑制作用，并表明其作为一种具有强大抗肿瘤潜能的分子实体的作用。另一个分析的过程是自噬，自噬被认为是一把双刃剑，因为它可以调节肿瘤抑制和肿瘤细胞存活。

在本研究中，LC3蛋白水平在实验组之间没有明显变化。然而，在我们的异种移植物中，可以假设自噬调节的两种可能情况:在对照组和暴露于AM251的组中，自噬调节代谢物摄取，有利于HCT116增殖，正如之前在不同的癌细胞系中观察到的那样。而在暴露于AEA的异种移植物中，可以假设自噬发挥细胞保护、组织保护和抗炎作用，这得到了促炎趋化因子减少的支持，并与暴露于AEA的人角质形成细胞的结果一致。此外，主要组织相容性复合体(MHC)是所有有核细胞的免疫反应和非自我表达的膜识别的主角之一。MHC-I的主要功能是向CD8+T细胞呈递肽抗原，触发其分化，从而辅助免疫应答。对斑马鱼转录组的RNA-seq分析显示mhcIuba转录下调，其与哺乳动物MHC具有高度的同一性，表明AEA处理激活了自然杀手介导的免疫反应，从而促进肿瘤细胞死亡。然而，由于AEA对MHC-I对非自体识别的控制有待深化，因此还需要进行一些研究。根据我们的转录结果，我们可以推测其减少可能与il11mRNA水平的降低有关，正如最近在HD11细胞系中所证明的那样。研究内源性大麻素如何减轻抗原免疫反应可能会很有趣，不仅关注炎症的控制，还关注自我和非自我之间的调节。

我们的研究结果证实了金属蛋白酶家族基因表达的变化。金属蛋白酶(ADAMs)是参与结缔组织稳态、肠道屏障功能和免疫过程的细胞外蛋白酶。其中，meprins具有特殊的结构和功能特征:meprinα是一种促血管生成酶，促进肿瘤进展，而meprinin主要与某些疾病有关。金属蛋白酶的底物是许多跨膜蛋白，如TNF-a、IL6R等促炎细胞因子。此外，meprins通过调节IL1B、IL18和IL6的活性来平衡免疫环境，IL1B、IL18和IL6是组织损伤和炎症反应中释放的主要产物。当细胞因子和单核细胞在机械应力或ROS产生的反应中发生不平衡时，meprins也参与ECM重塑。令人惊讶的是，在本研究中，RNA-seq分析显示mep1b基因表达增加，据一些研究报道，mep1b基因表达增加可能与白细胞内流促进和肿瘤细胞迁移导致细胞因子增加有关。相反，在DEG中，Ils导致下调，这表明在我们的异种移植物模型中，mep1b可能仅参与幼虫发育，可能控制早期幼虫典型的活跃细胞进展。

结论

总的来说，我们的数据表明，AEA在细胞间肿瘤-内皮细胞通讯的抗血管生成、抗增殖和抗炎过程中起着关键作用，从而抑制肿瘤，并证明斑马鱼幼虫异种移植物是一种有前途的精准医学快速检测方法，在体内环境中弥合了基因型和表型之间的差距。

基金：该项目由泰国国家研究委员会资助，并在清迈大学(HVD)和马尔凯理工大学(OC)“内源性大麻素系统对癌症治疗的操纵:以斑马鱼为模型”的资助协议下实现。

本文章原文 Sella F, Giommi C, Facchinello N, ;   Cell Death Dis (2022);   PMID: 36564370

详细网址https://www.nature.com/articles/s41419-022-05523-z