杂志：Frontiers in Cell and Developmental Biology

影响因子：5.5（2022-2023）

年份：2023

原文：Ma M, Brunal A A, Clark K C, et al. Deficiency in the cell-adhesion molecule dscaml1 impairs hypothalamic CRH neuron development and perturbs normal neuroendocrine stress axis function[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2023, 11: 1113675.

通讯作者：Y. Albert Pan

摘要

下丘脑中表达促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的神经元是神经内分泌应激反应途径(即下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴)的关键调节因子。由于CRH神经元的发育脆弱性会导致应激相关的神经和行为功能障碍，因此确定CRH神经元正常和异常发育的机制至关重要。在斑马鱼中，我们发现唐氏综合征细胞粘附分子like-1 (dscaml1)是CRH神经元发育的完整介质，也是建立正常应激轴功能所必需的。在dscaml1突变动物中，与野生型对照相比，下丘脑CRH神经元具有更高的crhb(斑马鱼中的CRH同源物)表达，细胞数量增加，细胞死亡减少。生理上，dscaml1突变动物具有较高的基线应激激素(皮质醇)水平和对急性应激源的反应减弱。总之，这些发现确定dscaml1是应激轴发育的重要因素，并表明HPA轴失调可能有助于人类DSCAML1相关神经精神疾病的病因学。

关键词：下丘脑-垂体-肾上腺轴，斑马鱼，CRH神经元，下丘脑，发育

前言

下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)表达神经元是神经内分泌应激反应通路的中枢调节器，在哺乳动物中被称为下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴或在鱼类中被称为下丘脑-垂体-肾间(HPI)轴。当暴露于环境干扰(即压力源)时，与压力相关的神经输入汇聚到下丘脑CRH神经元上，激活激素级联，最终导致糖皮质激素的释放，从而广泛影响认知、情感、代谢和免疫功能。

CRH神经元的发育对HPA和HPI轴(统称为应激轴)的功能有深远的影响。CRH神经元的发育扰动，特别是在生命早期，会导致CRH神经元功能的长期变化。此外，啮齿动物模型表明，CRH神经元的失调会增加焦虑和抑郁样表型。这些研究强调需要识别介导CRH神经元发育的基因和分子，并确定发育扰动如何影响应激轴功能。

在发育早期，下丘脑CRH神经元由腹侧间脑的祖细胞产生。分泌因子包括FGF10、SHH、bmp和Nodal首先定义下丘脑前背区域;在这个区域内，CRH神经元逐渐由一系列关键转录因子组合指定，包括Fezf2、Otp、Sim1、Arnt2和Brn2。一旦被指定，CRH神经元将经历进一步的分化，如神经元形态发生、突触发生、表观遗传编程和细胞死亡，以建立一个功能性的应激反应神经回路。这些神经元分化的后期阶段是由膜定位的细胞粘附分子介导的细胞间相互作用形成的。然而，介导CRH神经元发育信号的特定细胞粘附分子尚不清楚。

为了解决这一知识缺口，我们使用斑马鱼作为模型。哺乳动物HPA轴和硬骨动物HPI轴的结构和功能高度保守。在哺乳动物中，主要参与hpa轴激活的CRH神经元位于下丘脑室旁核(PVN)中。在硬骨鱼(鳐鱼)中，神经内分泌视前区(NPO)与PVN具有同源性，NPO内的CRH神经元与其哺乳动物的对应区域具有相似的作用。斑马鱼其他下丘脑区域(如中间下丘脑)的CRH神经元也可能调节HPI轴。斑马鱼的一个独特优势是其快速的外部发育。HPI轴的发育开始于受精后1-2天(dpf)，应激诱导的皮质醇信号和行为可以在4-5 dpf观察到。斑马鱼的快速发育和半透明使得在完整的、发育中的动物中直接观察CRH神经元的发育成为可能。

在这项研究中，我们研究了一个保守的神经元信号分子-唐氏综合征细胞粘附分子样1(斑马鱼基因:dscaml1;小鼠基因:Dscaml1;人基因:DSCAML1;蛋白质:DSCAML1)。DSCAML1是脊椎动物中两个DSCAM家族成员之一，另一个是DSCAM。与无脊椎动物的DSCAMs不同，脊椎动物的DSCAMs没有明显的选择性拼接。在哺乳动物视网膜中，DSCAML1阻止细胞之间的过度聚集并促进发育中的细胞死亡。DSCAML1还可以改善突触特异性和突触数量。在人类中，DSCAML1的罕见变异与几种神经发育障碍有关，包括自闭症谱系障碍、皮质异常和癫痫。遗传学和表观遗传学研究也表明DSCAML1与暴力经历的应激反应有关。然而，DSCAML1与应力轴之间的关系尚不清楚。

我们之前利用斑马鱼研究了DSCAML1如何影响神经通路和系统功能。我们发现dscaml1缺乏会导致各种生理和行为缺陷，包括色素沉着变深、光适应变慢和眼球运动(扫视)变慢。有趣的是，正如斑马鱼糖皮质激素受体(gr)突变体所见，色素沉着变深和光适应变慢也可能是由异常的糖皮质激素受体信号引起的，这表明应激轴可能在dscaml1突变体中功能失调。

在这里，我们报道了斑马鱼的dscaml1缺乏会扰乱下丘脑CRH神经元的发育并损害HPI轴的正常功能。这些发现表明DSCAML1是应激轴发育所必需的，并提高了应激功能障碍导致人类DSCAML1相关疾病的可能性。

斑马鱼饲养：

所有年龄的斑马鱼在28.5°C的14/10光照/黑暗周期下饲养。胚胎和幼虫在E3缓冲液(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)中饲养。本研究使用的斑马鱼均为AB和TL野生型混合背景(斑马鱼国际资源中心)。在本研究中使用的阶段(0-6 dpf)，性别不是一个相关变量，因为实验室斑马鱼在2周龄之前性别未分化。

转基因和突变斑马鱼系：

dscaml1vt1功能缺失等位基因包含7个碱基对缺失，导致帧移位和过早停止密码子。用于活体成像的动物是纯合子珠层(mitfa)突变背景，以防止色素的形成。小胶质细胞RFP细胞系[Tg(mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry)]由杜克大学John Rawls博士提供。crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP系使用CRISPR介导的敲入产生，如Kimura等人所述。crhb敲入位点的sgRNA序列为AGCTCGCGTCTGCGCAGAG。所有组间比较(突变体与对照组)均在兄弟姐妹之间进行。

RNA-seq和差异基因表达分析：

杂合dscaml1突变亲本的后代在3.5-4 dpf时麻醉并收获。使用RNA Miniprep Kit(Zymo)对动物前半部分进行RNA制备。后半部分用于基因分型。每组分析3个生物重复，每个重复含有6-11只动物的RNA。所有样品的RIN≥8.0，使用Illumina的TruSeq mRNA HT样品准备试剂盒(rs -122 - 2103;Illumina的NextSeq 75测序仪进行后续的聚类生成和测序。序列数据处理、比对、读取计数、映射和质量控制如前所述进行。使用R-package DESeq2中的错误发现率(FDR) (Benjamini-Hochberg)校正似然比检验(LRT)检验差异表达的显著性。在FDR<0.01和0.001时，238个和116个基因的reads计数差异显著。原始序列数据已存储在NCBI的基因表达Omnibus中，可通过GEO系列登录号GSE213858访问。

荧光原位杂交和免疫组织化学：

采用前面描述的方法进行了单次和双次全载荧光原位杂交(FISH)。探针使用DIG和荧光素RNA标记混合物(Roche)进行体外转录合成。DIG和荧光素标记探针采用抗DIG或抗荧光素pod共轭Fab片段(Roche)和Cy3或荧光素TSA-plus试剂(Akoya Biosciences)进行检测。crhb的质粒模板由加州理工学院的David Prober博士提供。dscaml1探针是按照前面的描述生成的。

如前所述进行免疫组化。小鼠抗ERK1/2(4696S;细胞信号技术)。活化的caspase 3用兔抗裂解caspase 3 (559565;BD生物科学)。细胞核用TOTO-3碘染色(ThermoFisher)。RFP用鸡抗RFP (600-901-379S, Rockland)或兔抗RFP (PM005, MBL Life Science)染色。用rabbit anti-GFP (598, MBL Life Science)染色。CRH采用Salk研究所P. Sawchenko和J. Vaughan提供的兔抗CRH (PBL rC68)染色。所有FISH和免疫组化样品均在1.5%低熔琼脂糖溶液中置于玻璃底培养皿中(P50G-1.5-14-F;MatTek)，并使用尼康A1直立共聚焦显微镜成像。

皮质醇提取及ELISA：

皮质醇提取和ELISA的详细方案在线提供(补充数据表S4)。在4.5 dpf时，根据dscaml1-/-动物较深的色素沉着，将dscaml1−/−和对照动物分开。每个培养皿中放置30-35只动物进行皮质醇提取。上午基线(无应激)样本采集时间为光照后15-30分钟(08:15-08:45)，下午样本采集时间为14:30-16:00。高渗应力和搅拌应力实验时间为14:30-15:30。针对每种基因型(dscaml1-/-和对照)和应激条件(上午基线、下午基线、搅拌应激、渗透应激)，收集了6个生物重复，每个重复包含30只动物。每次实验都对突变体和对照动物进行并排测试。

用自旋磁搅拌棒制造涡流水流，产生搅拌应力。将一个小磁性搅拌棒放入100 mm培养皿中，培养皿中含有35只动物和20 mL E3培养基。搅拌棒在微孔板上以300转/分的转速旋转5分钟。通过增加培养基中的盐浓度诱导高渗应激。30只动物置于8ml E3培养基中。然后，在培养基中加入2 mL预热好的1.25 M NaCl，使终浓度为250 mM，静置20 min。

按照Yeh等人的描述进行样品均质和皮质醇提取。简单地说，用冰冷的E3培养基快速固定5只dpf幼虫，然后在−80°C下快速冷冻。收集完所有样品后，用乙酸乙酯(33211-1L-R;Sigma-Aldrich)。使用商用ELISA试剂盒测量皮质醇浓度，遵循制造商的说明(500360;开曼群岛化学)。用微孔板阅读器(FilterMax F3;MicroDevices)初始开发后90-120分钟。

CRH神经元的实时成像：

通过在胚胎1细胞期注射Cre mRNA诱导crhb:LRLG转基因重组。为了实现CreER介导的部分重组，在1细胞期注射~30pg CreER mRNA，在6 hpf (10 μM)的胚胎培养基中加入4-羟基他莫昔芬(4-OHT)，然后在24 hpf的E3培养基中冲洗。为了实现Cre介导的完全重组，约50pg体外转录Cre。将zf1 mRNA (#61391, Addgene)注射到胚胎中。

为了进行共聚焦实时成像，3只dpf动物用0.01%三卡因甲磺酸钠(MS-222, Sigma)麻醉，包埋在1%低熔点琼脂糖中，背侧放在玻璃底培养皿内的玻璃表面(P50G-1.5-14-F;MatTek)。然后用含有0.01%三卡因甲磺酸盐(MS-222, Sigma)的E3培养基填充培养皿。在尼康A1共聚焦显微镜上每隔15或30分钟采集共聚焦z堆栈，持续12小时。

双光子实时成像是在定制的布鲁克双通道双光子显微镜上完成的。可调谐钛蓝宝石激光器(变色龙视觉II;调到980 nm，同时激发RFP和GFP。78只HPF动物被麻醉并以与共聚焦活体成像相同的方式植入，但背部远离覆盖玻璃。分别在78、84、96、108和120 hpf下成像(图6A)。每个时间点后，将成像的幼虫轻轻从琼脂糖中取出，在正常昼夜循环下，在28.5°C的E3培养基中恢复。在最后一个时间点之后，为所有成像动物制备基因组DNA并进行基因分型。

图像处理和统计分析：

使用开源图像处理软件fiji对图像进行处理。对于FISH图像，对图像进行卷积(kernel = 12)以增强细胞边界，并使用ROI manager工具手动标记每个细胞的中心。细胞数量等于每只动物的roi数量。每个细胞的信号强度定义为给定动物中所有roi信号强度的中位数。使用ROI manager工具对crhb:LRLG动物的RFP+细胞数量进行计数，不进行卷积。对于共聚焦实时成像，使用降噪对图像进行预处理。尼康元素软件中的AI功能。对于双光子成像，使用“正确3D漂移”功能对来自不同时间点的z堆栈进行对齐。RFP和GFP通道之间的光谱重叠线性未混合。在斐济，使用MTrackJ插件跟踪单个细胞。

所有统计分析均在GraphPad Prism (Version 9)软件中进行。对于正态分布的数据，采用参数检验(t检验或方差分析)。对于非正态分布的数据，采用非参数检验(Mann-Whitney)。采用Holm-Sidak后验法对多重比较进行校正，并显示调整后的p值。除非另有说明，所有数值均以平均值±标准误差表示。当p < 0.05时，认为统计学检验显著。

凋亡细胞(AC3+)的定量采用MAP-map定量和Z-Brain注释法，但使用Anti-AC3代替抗磷酸化的ERK1/2。所有MAP-map处理程序(如CMTK、MATLAB脚本)均按照Randlett等人的描述执行。NPO在Z-Brain中没有这样的注释，但“间脑- Otpb集群2”ROI符合NPO的定义，因为它描绘了表达Otpb的视前区背侧区域。

dscaml1缺乏导致神经内分泌因子过度表达

为了获得dscaml1缺失导致的分子变化的公正观点，我们使用RNA测序(RNA-seq)比较了dscaml1纯合突变(dscaml1−/−)和对照(野生型)组之间的转录组学特征。利用Illumina下一代测序仪对受精后3.5-4天(dpf) dscaml1−/−和对照幼虫的cDNA进行测序。使用至少两倍变化的阈值和小于0.01的调整p值，我们确定了25个上调基因和79个下调基因(图1A, 补充数据表S1)。

在dscaml1−/−动物中上调的25个基因中，有7个是下丘脑或垂体中表达的分泌神经肽/激素:促肾上腺皮质激素释放激素b(crhb)、甲状旁腺激素2 (pth2)、生长肌动素β (smtlb)、可卡因和安非他明调节的转录物3 (cart3)、黑素原皮质激素a (pomca)、精氨酸加压素(avp)和spexin激素(spx)。其中三个(crhb, avp, pomca)是HPI轴的核心调节因子。crhb编码斑马鱼的CRH;avp编码控制渗透压、血压的神经肽AVP，并与CRH协同促进皮质醇释放;pomca编码促肾上腺皮质激素(ACTH)，这是触发糖皮质激素释放的主要垂体激素。此外，两个参与细胞凋亡的基因:BCL2凋亡调节因子b (bcl2b)和phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐诱导蛋白1(pmaip1/noxa)上调。用PANTHER进行蛋白质类分类分析，发现“细胞间信号分子”是最大的一类(4个基因，16%)(图1B)。

与上调基因相比，dscaml1−/−动物中下调的79个基因在功能上更加多样化。用PANTHER进行蛋白质分类分析，发现最大的蛋白质类别是代谢物相互转换酶(12个基因，15.19%)、蛋白质结合活性调节剂(9个基因，11.39%)、转运蛋白(8个基因，10.13%)和防御/免疫蛋白(6个基因，7.59%)(图1C)。我们注意到79个下调基因中有30个(38%)在肝脏中高表达，其中10个基因参与先天免疫和补体级联(图1A, 补充数据表S2)。这些结果表明，dscaml1突变体可能会抑制肝功能和先天免疫。

为了确定受dscaml1缺失影响的信号通路，我们使用统计富集检验(PANTHER Classification System, version 17.0)分析了所有差异表达基因(p <0.01, 210个定位基因)。所有显著富集(FDR < 0.05)的基因个体发生(GO)分子功能项都与亲本GO项激素活性相关(图1D)。PANTHER通路分析还发现了另一个显著的应激调节神经肽，腺苷酸环化酶激活多肽1b (adcyap1b，也称为PACAP)显着上调(0.66倍变化，调整后p < 0.0001)。

总之，我们的转录组学分析表明，dscaml1缺乏导致神经肽/激素信号的上调以及肝脏和先天免疫功能的下调。肝脏和免疫功能的抑制是应激轴激活的标志，这与参与应激轴的主要神经肽(crhb、avp、pomca和adcyap1b)的过度表达一致。

图1 dscaml1缺陷斑马鱼的差异基因表达分析。(A)与对照动物相比，dscaml1−/−相对基因表达的火山图。每个点代表一个单独的基因，彩色点代表图表上显示的基因组。虚线表示显著性水平(调整p < 0.01)和倍数变化(增加或减少2倍或更多)阈值(B, C)。上调(B)和下调(C)基因的蛋白类分类分析。(D)分子功能显著富集(p < 0.05)氧化石墨烯项表。

dscaml1缺失改变了NPO中CRH神经元的发育

为了进一步研究dscaml1突变体的应激轴是否受到干扰，我们首先检测了NPO中CRH神经元的发育(CRHNPO神经元)(图2A)，这些神经元位于背视前区，以crhb的表达为特征。我们重点研究了三个发育阶段(2、3和5 dpf)，它们跨越了NPO中crhb+神经元首次出现(2 dpf)和应激轴反应(4-5 dpf)之间的时期。所有比较均采用同胞对照。

使用荧光原位杂交(FISH)，我们发现在2 dpf时，dscaml1−/−和野生型(WT)动物之间的crhb表达模式最初相似(图2B, B ')。在3 dpf时，我们开始在dscaml1−/−动物的NPO中看到较高的crhb表达(图2C, C′)，并且在5 dpf时，dscaml1−/−动物的NPO中crhb表达仍然较高(图2D, D′)。CRHNPO神经元中crhb FISH信号强度的量化显示，与WT动物相比，dscaml1−/−动物中的crhb表达更高(图2E)。每个细胞的信号强度因发育阶段和基因型而有显著差异，并且发育阶段和基因型之间存在显著的交互作用(双向方差分析，补充表SI)。配对与Holm-Sidak校正比较发现，在3和5 dpf处显著增加，但在2 dpf处没有增加(图2E)。

除了crhb表达水平的变化，dscaml1缺失也增加了表达crhb的CRHNPO神经元的数量。在WT动物中，CRHNPO神经元的数量随着时间的推移而增加，从14.78个细胞(2 dpf)到18.85个细胞(3 dpf)到26.60个细胞(5 dpf)(图2B-D, F)。在dscaml1−/−动物中，CRHNPO神经元的数量以更高的速度增加，从12.67个细胞(2 dpf)到19.46个细胞(3 dpf)到36.39个细胞(5 dpf)(图2B '，C '，D '，F)。分期和基因型之间存在显著的交互作用(双向方差分析，补充表SI)。采用Holm-Sidak校正的两两比较发现，dscaml1−/−和WT动物在5 dpf时细胞数量显著增加，但在2和3 dpf时没有增加(图2F，调整后的p值如图所示)。

总的来说，我们发现与WT相比，dscaml1−/−突变体中crhb表达和CRHNPO神经元中细胞数量显著增加。这些表型不是由于dscaml1−/−动物的视觉缺陷，因为在黑暗中饲养的动物中也观察到类似的表型(补充数据表S1)。总之，这些发现表明dscaml1对CRHNPO神经元的正常发育轨迹至关重要。

图2 dscaml1缺失改变了CRHNPO神经元的发育。(A)斑马鱼幼体大脑示意图(侧视图)，吻侧向左。NPO用蓝色突出显示。用于CRHNPO神经元分析的成像平面显示(浅蓝色平面)(B-D’)CRHNPO神经元的发育轨迹，用crhb FISH(绿色)标记，并与抗erk1/2(洋红色)共染色。在每个发育阶段，显示了包含NPO的代表性共聚焦子堆栈，NPO(框状区域)扩大，显示在右图中，没有ERK1/2共染色。野生型(WT)动物如图B、C和(D)所示。dscaml1−/−动物如图B’、C’和D’所示(E-F)每个细胞的信号强度(E)和细胞数量(F)的量化。多重比较校正后的p值如图所示。WT: n = 9 (2 dpf)， 13 (3 dpf)， 15 (5 dpf)。dscaml1−/−:n = 9 (2 dpf)， 13 (3 dpf)， 18 (5 dpf)。标尺尺寸为20μm。显示了平均值、标准误差和校正后的p值。

dscaml1缺乏会损害下丘脑中部和吻侧CRH神经元的发育

为了测试其他下丘脑CRH神经元是否受到与CRHNPO神经元相似的影响，我们检查了另外两个表达CRH的下丘脑区域。在斑马鱼中，中间下丘脑(IH) CRH神经元(CRHIH神经元)调节应激反应和对光的情绪效价的感知(图3A)。在5 dpf的IH中，我们没有观察到dscaml1−/−和WT动物之间的crhb表达水平(FISH强度)有任何显著差异(图3B-D)。然而，dscaml1−/−动物的CRHIH神经元数量明显更高(未配对t检验，图3E)。

除了IH，我们还在下丘脑吻侧(RH)发现了一致的crhb表达(图3F)。CRH神经元在RH (CRHRH神经元)中的作用尚不清楚，但它们可能参与了吻侧下丘脑-视顶盖通路。在5 dpf的RH中，与WT相比，dscaml1−/−动物的CRHRH表达水平和CRHRH细胞数量都更高(未配对t检验，图3G-J)。因此，dscaml1在调节发育中的下丘脑CRH神经元细胞数量方面是广泛需要的，但dscaml1缺乏仅影响RH和NPO中crhb的表达。

图3 dscaml1缺失改变了下丘脑中部和吻侧CRH神经元的发育。(A)幼虫大脑示意图，IH以橙色突出显示。用于CRHIH神经元分析的成像平面(浅蓝色平面)所示。(B, C)用crhb FISH(绿色)标记CRHIH神经元，并与抗ERK1/2(洋红色)共染色。显示含有IH的代表性共聚焦亚层，IH(框状区域)扩大，显示在没有ERK1/2共染色的右图中。图B显示WT脑，图c显示dscaml1−/−脑。(D - E)每个细胞信号强度(D)和细胞数量(E)的量化。(F)幼虫脑示意图，RH以粉红色突出显示。用于CRHRH神经元分析的成像平面为(浅蓝色平面)。(G-H)用crhb FISH(绿色)标记CRHRH神经元，并与抗ERK1/2(洋红色)共染色。显示含有RH的代表性共聚焦亚层，RH(框状区域)放大，显示在没有ERK1/2共染色的右图中。图G显示的是WT脑，图h显示的是dscaml1−/−脑。(I-J)每个细胞的信号强度(I)和细胞数量(J)的量化。Dscaml1−/−:n = 18。标尺尺寸为20μm。显示了平均值、标准误差和p值。

dscaml1突变体减少了下丘脑的程序性细胞死亡

已知DSCAM家族蛋白通过促进哺乳动物视网膜PCD减少神经元细胞数量。此外，我们的转录组学分析显示，dscaml1突变体表达更高水平的凋亡调节基因bcl2b和pmaip1(图1A)。因此，我们假设dscaml1缺失可能损害发育中的下丘脑的PCD。

为了验证这一点，我们使用抗活化的caspase 3 (AC3)抗体来标记凋亡细胞。在野生型动物中，我们看到神经系统中广泛存在细胞凋亡，在3 dpf处达到峰值(图4A-A”)，与先前使用TUNEL的结果一致。我们发现，与野生型同胞对照相比，dscaml1−/−动物在3和5 dpf时ac3阳性细胞减少(图4B-B”)。为了量化特定下丘脑区域的细胞死亡数量，我们使用Map-map计算和Z-Brain解剖图谱。在这种方法中，单个共聚焦图像堆栈被注册到Z-Brain参考大脑;然后按基因型分组，使用Mann-Whitney u统计量(WT n = 14;dscaml1−/−n = 21)。具有显著z分数的体素，要么在WT中较高(WT over dscaml1)，要么在dscaml1−/−中较高(dscaml1 over WT)，被映射到感兴趣的区域(ROI)，每个ROI中的平均体素值被计算并使用绿-品红色标度显示(绿色:在WT中较高;品红色:dscaml1−/−较高(图4C)。

总的来说，与dscaml1−/−(即许多绿色区域和很少的品红roi)相比，整个大脑的WT中AC3信号更高。在Z-Brain中注释的293个roi中，178个具有显著的dscaml1信号WT(平均信号=1,384.90)的体素(WT over dscaml1 sheet，补充数据表S3)。相比之下，只有65个roi的体素在WT信号上具有显著的dscaml1(平均信号= 84.23)(dscaml1 over WT sheet, 补充数据表S3)。

在下丘脑crhb表达区对应的ROI中，NPO (Z-Brain ROI:间脑- otpb Cluster 2) (dscaml1信号上的WT = 5688.06;dscaml1 over WT信号= 0)，IH(间脑-中间下丘脑)(WT over dscaml1 signal = 673.56;dscaml1信号比WT = 36.40)， RH(间脑-下丘脑吻侧)(dscaml1信号比WT = 916.95;dscaml1 / WT信号= 0.70)与dscaml1−/−相比，在WT中都有更高的AC3信号(图4D-F)。总之，这些结果表明，dscaml1-/-动物的PCD降低可能导致下丘脑中CRH神经元数量增加。

dscaml1对正常的CRHNPO神经元细胞死亡至关重要

为了进一步确定dscaml1是否会影响下丘脑CRH神经元的存活，当dscaml1−/−和WT动物之间的细胞数量开始分化时，我们使用体内延时成像技术在3至5 dpf时追踪了单个CRHNPO神经元的命运。为了可视化活斑马鱼中的CRHNPO神经元，我们使用crispr介导的基因组插入生成了CRHNPO敲入荧光报告系(图5A)。在crhb的第一个外显子上游35个碱基对处插入一个可切换的hsp-LoxP-RFP-LoxP-GFP盒，以RFP(默认)或GFP(直接重组)的表达来标记内源性表达crhb的细胞(图5B)。由此获得的转基因品系crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP (crhb:LRLG)的RFP和GFP表达模式与其他报道的内源性crhb转录物表达模式相匹配(图5C, D)。为了验证荧光报告基因表达的保真度，我们检测了NPO中crhb:LRLG标记的细胞是否表达CRH蛋白。在未暴露于Cre(默认RFP表达)的动物中，我们发现大多数RFP+神经元呈CRH免疫阳性(84.71%±2.19%，补充图2a - b)。总之，这些结果表明，crhb:LRLG系可靠地标记了CRHNPO神经元。

在crhb:LRLG动物中，dscaml1缺失增加了RFP标记的CRHNPO神经元的数量(图5E-F’)。发育阶段和基因型之间存在显著差异，无显著相互作用(双向方差分析，补充表SI)。dscaml1突变体在5 dpf时RFP阳性神经元数量明显增加，而在3 dpf时则没有(图5G，采用Holm-Sidak校正的多重比较检验)。这一结果证实了我们的crhb FISH结果，即dscaml1突变体中CRHNPO神经元数量增加(图2F)。

利用crhb:LRLG线，我们首次对麻醉动物进行了延时成像。我们在1细胞期将CreER mRNA注射到crhb: LRLG动物中，并加入4-羟基他莫昔芬(4-OHT)在6-24 hpf下激活CreER，从而诱导CreER部分介导重组(图5B)。在3-4 dpf处，共聚焦成像可以在NPO中看到混杂的GFP+和RFP+细胞(图5H-H”和补充视频S1)。随着时间的推移，一些被标记的细胞离开了CRHNPO神经元簇。正如之前在斑马鱼研究中看到的那样，这些细胞很可能是被小胶质细胞带走的垂死细胞。为了证实这一点，我们在所有crhb: LRLG标记的细胞中诱导GFP表达(通过注射密码子优化的Cre mRNA)，并用mpeg1:mCherry转基因标记小胶质细胞(图5-i-i”和补充视频S2)。事实上，mCherry+小胶质细胞向GFP+细胞簇迁移，吞噬GFP+CRHNPO神经元，并带走被吞噬的细胞。在小胶质细胞内的一个大液泡内可以看到被吞噬细胞的残余(图5J, J′)。这种类型的吞噬事件发生在3.5-4 dpf之间的5只动物中有3只。这些结果表明，CRHNPO神经元经历了PCD，死亡细胞被小胶质细胞迅速移除。

图5 CRHNPO神经元的荧光标记和实时成像。(A) CRISPR介导的hsp-Lox-RFP-Lox-GFP盒在位于crhb外显子1上游35bp的sgRNA靶点上的敲入示意图。插入的方向和连接结构尚未确定。(B) crhb:LRLG表达示意图。每个圆圈代表一个荧光细胞。没有Cre(默认)，RFP在所有细胞中表达。完全重组后，所有细胞均表达GFP。部分重组导致了马赛克RFP和GFP标记。(C)部分重组的固定5 dpf crhb:LRLG幼虫的背视图，用抗rfp(品红色)和抗gfp(绿色)染色。框内区域标记NPO。(D) NPO的高倍图像。RFP和gfp阳性神经元均可见。(E-F’)未重组的抗rfp染色crh:LRLG动物图像。图中显示了代表性的WT (E-E ')和dscaml1−/−(F-F ') NPO神经元。(G) rfp阳性细胞在3和5 dpf时的定量。WT: n = 5 (3 dpf)， 16 (5 dpf)。dscaml1−/−:n = 11 (3 dpf)， 17 (5 dpf)。显示了平均值、标准误差和校正后的p值。(H-H”)部分重组的crhb:LRLG活幼虫在72 ~ 84 hp成象。这里显示了三个时间点。两个细胞(箭头，一个绿色，一个洋红色)随着时间的推移而消失。(I-I ")活体crhb:LRLG;mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry幼虫，带有GFP(绿色)标记的CRH神经元和mCherry(品红)标记的小胶质细胞。在这个图像系列中，一个CRH神经元(箭头)被小胶质细胞吞噬(I ')，然后被移除(I ')。图像是共聚焦光学切片。(J, J ')显示(I ')中框框区域的放大视图的面板，有(J)或没有(J ') mCherry通道。小胶质细胞内仍能看到CRH神经元的残余(箭头)。比例尺尺寸为100 μm (C图)或20μm(其他图)。

接下来，为了追踪单个CRHNPO神经元的命运，我们对部分cre介导重组的crhb:LRLG动物进行了3至5 dpf的双光子成像(图6A)。为了尽量减少应激对PCD的潜在影响，我们在成像期间对动物进行麻醉和固定。在成像期间，允许每只动物在正常的光暗循环下，在12孔板的单个孔中恢复。在第一个时间点(78 hpf)出现的细胞在随后的四个时间点(84、96、108和120 hpf)被跟踪，并被分类为持续(在最后一个时间点出现)或丢失(在以下任何时间点丢失)(图6B-B“)。总体而言，我们观察到dscaml1+/−和dscaml1−/−动物中细胞损失减少的趋势(卡方检验趋势，p = 0.0398)(图6C，所示的跟踪细胞总数)。在WT动物中，16.41%的细胞丢失，而dscaml1+/-和dscaml1-/-分别为10.91%和7.53%。

最后，考虑到细胞丢失的时间，我们绘制了每种基因型CRHNPO神经元的存活曲线。同样，在细胞丢失的趋势上存在显著差异(Logrank检验趋势，p=0.0098)， dscaml1−/−动物一致显示出更高的存活率(图6D)。综上所述，这些结果表明dscaml1缺失降低了CRHNPO神经元的PCD。

图6 CRHNPO神经元细胞命运的实时跟踪。(A)延时双光子(2P)成像实验时间轴。4-OHT在6-24 hpf下诱导crhb:LRLG部分重组，并在78、84、96、108和120 hpf下进行成像。动物在成像期间被短暂麻醉，并在成像期间恢复。(B-B”)单个CRHNPO神经元的跟踪。下面给出了三个时间框架示例。单个荧光细胞可以随时间跟踪，并分为两类:持续(白色箭头)或丢失(粉红色箭头)。标尺尺寸为20μm。(C)保留和丢失的CRHNPO神经元百分比的量化。每种基因型的样本量(细胞数)。(D)各基因型组CRHNPO神经元个体存活曲线。

应激轴功能在dscaml1突变动物中受到干扰

考虑到下丘脑CRH神经元的发育扰动以及与应激轴激活相关的基因表达的全局变化，我们接下来确定应激轴的激素输出-皮质醇-是否被改变。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对5只dpf动物(每个样本30只动物，每种条件6个样本)的匀浆进行皮质醇水平测定。所有动物均在标准化条件下，以相同的密度饲养，并具有正常的昼夜周期(14 h昼/10 h夜)。在这种昼夜节律周期下，dscaml1突变动物表现出与野生型动物相似的昼夜运动节律。

在5 dpf时，对基线和应激条件进行测试，以评估对照组(WT和dscaml1+/−)和dscaml1−/−组中皮质醇的潜在变化。为了测量基线皮质醇，我们在光照后30分钟(授时时间0,ZT0)和下午(ZT6-8)收集了未受干扰的动物。为了测量应激诱导的皮质醇，将动物暴露在ZT6-8的搅拌应激(旋转水，5分钟)或高渗应激(250 mM NaCl, 20分钟)中。这些急性应激源具有良好的特征，可与斑马鱼幼虫在自然栖息地中经历的水流和盐度变化相媲美。

在基线时，dscaml1−/−动物的皮质醇水平明显高于对照动物(多重曼-惠特尼检验，霍尔姆-西达克校正)。调整后的p值如图7A所示。在ZT0时，dscaml1突变体的基线皮质醇水平比对照组高2.7倍(中位数为350.06 pg/mL对129.80 pg/mL)。在ZT6-8时，皮质醇的差异不太明显，但dscaml1突变体在基线时的皮质醇水平仍比对照组高2倍(中位数为238.51 pg/mL对118.52 pg/mL)。

在急性暴露于应激源后，我们发现dscaml1突变动物表现出减弱的皮质醇诱导。我们通过将皮质醇水平正常化到相同基因型在相同昼夜时间(ZT6-8)的基线皮质醇水平来评估应激诱导皮质醇产生的程度。在对照组中，搅拌应激和高渗应激分别使皮质醇比对照基线增加1.88倍和1.95倍(灰色条形图，图7B)(未归一化的皮质醇数据见补充图S3)。对高渗胁迫的响应(p = 0.0113, Multiple Mann-Whitney test with Holm-Sidak correction)比搅拌胁迫产生的响应更强(p = 0.0546)。在dscaml1−/−组中，搅拌应激和高渗应激分别仅使皮质醇比dscaml1−/−基线增加1.29倍和1.4倍(红条，图7B)。这些增加无统计学意义(搅拌胁迫p >0.9999，高渗胁迫p = 0.9768)。

总之，这些结果表明，dscaml1缺乏会提高皮质醇的基线水平，损害对急性应激源的反应。这些发现表明dscaml1对于建立应力轴的正常功能至关重要。

图7皮质醇水平和对外源性糖皮质激素的反应。(A-B) 5只dpf幼虫的皮质醇谱。对于每个样本(点)，皮质醇是从30只动物的池中提取的。各组N=6。显示了中位数、四分位数范围和校正后的p值。(A)对照组(黑色)和dscaml1−/−(红色)动物的基线皮质醇。(B)对照(黑色)和dscaml1−/−(红色)动物基线标准化皮质醇折叠变化。(C)定量CRHNPO神经元中每个细胞的crhb信号强度。载体:n=10 (WT)， 11 (dscaml1−/−)。Dex: n=7 (WT)，11 (dscaml1−/−)。显示了平均值、标准误差和校正后的p值。

dscaml1突变体对糖皮质激素有反应

dscaml1突变体中应激轴相关表型的某些方面类似于斑马鱼糖皮质激素受体(gr)突变体。特别是，gr和dscaml1突变体都表现出升高的基线皮质醇和crhb。这种相似性提出了一种可能性，即dscaml1突变表型可能是由于糖皮质激素受体介导的信号传导不足造成的。为了验证这一点，我们研究了dscaml1突变体是否能对外源性糖皮质激素产生转录反应。我们检查了crhb在NPO中的表达，因为它受到糖皮质激素-糖皮质激素受体信号的反馈控制。野生型组作为对照。

将合成的糖皮质激素受体激动剂地塞米松(dexamethasone, Dex)以2 μM的终浓度添加到胚胎培养基中，从4到5 dpf (24 h)。用载体(0.02%乙醇)处理的兄弟姐妹进行比较。对于CRHNPO神经元中crhb转录水平，我们发现Dex处理和基因型导致了显著差异，两者之间存在显著的相互作用(双向方差分析，补充表SI)。多次比较试验发现，Dex显著降低了dscaml1−/−动物的crhb转录物水平，但在野生型动物中没有(Holm-Sidak校正，图7C, p值如所示)。这些结果表明，dscaml1缺乏不会导致CRHNPO神经元糖皮质激素反应性的丧失。相反，dscaml1缺乏可能使动物对糖皮质激素的抑制作用更敏感。

讨论

本研究证明dscaml1调节下丘脑CRH神经元的发育，是正常应激轴功能所必需的。在转录组水平上，斑马鱼的dscaml1缺乏导致基因表达变化，表明应激轴过度激活。在细胞水平上，我们发现dscaml1−/−下丘脑CRH神经元增加应激轴相关神经肽(crhb)表达，增加细胞数量，减少细胞死亡。在生理上，dscaml1缺乏会损害正常的神经内分泌应激轴功能，这可能是由下丘脑CRH神经元发育缺陷以及激素/神经肽信号的全身性改变引起的。总之，这些发现将DSCAML1与压力轴的发展联系起来，并为人类DSCAML1相关精神健康状况的潜在病因学提供了新的线索。

DSCAML1是一种新的CRH神经元发育的细胞间信号分子

本研究的一个主要发现是DSCAML1是下丘脑CRH神经元发育所必需的。据我们所知，DSCAML1是第一个与CRH神经元发育有关的细胞间信号分子。我们的发现也提供了DSCAML1和下丘脑发育之间的第一个联系。我们发现，与视网膜神经元类似，PCD对下丘脑CRH神经元细胞数量的调节是一个dscaml1介导的过程。需要进一步的研究来确定DSCAML1功能的其他方面，如细胞间距和突触发生的调节，是否参与CRH神经元的发育。此外，考虑到dscaml1在神经系统中广泛表达，包括CRH神经元和非CRH神经元(补充图S4)，解决DSCAML1是否在CRHNPO神经元中细胞自主作用将是重要的。

DSCAML1对CRH神经元细胞死亡的调控

在发育过程中，PCD对于消除瞬态细胞类型、匹配输入和输出细胞种群以及保持细胞间距至关重要。据推测，下丘脑的PCD可能指定神经回路组装和形状输出活动。与这一观点一致的是，早期生活压力导致的下丘脑PCD降低与成年后对急性压力源的敏感性增加有关。

作为细胞间信号分子，DSCAML1可能转导PCD的细胞外信号。一个潜在的线索是突触活动，这对神经元在发育过程中的存活至关重要。在培养中，DSCAML1定位于兴奋性突触，当过表达时抑制兴奋性突触发生。在CRH神经元中，DSCAML1缺失是否会增加兴奋性突触传递并激活活性依赖性细胞存活通路仍有待确定。

值得注意的是，CRH神经元细胞死亡可能不是dscaml1影响CRH神经元数量的唯一机制。我们在dscaml1突变体中观察到，神经祖细胞数量或增殖能力的变化可能有助于CRH神经元数量的增加。此外，dscaml1缺失导致的crhb高表达可能导致更多的细胞被鉴定为CRH神经元。需要进一步的工作来确定这些因素在发育过程中如何控制CRH神经元数量。

DSCAML1缺陷动物的应激轴功能障碍

dscaml1−/−动物在基线时表现出应激轴激活的多种迹象，包括皮质醇升高和免疫相关基因的抑制。基线皮质醇水平升高可能导致对急性应激源的反应减弱，类似于慢性皮质醇管理下的动物。这些表型的一个可能原因是crhb的过度表达。在小鼠中，CRH的广泛过度表达导致皮质酮(啮齿动物的应激糖皮质激素)升高，并产生与库欣综合征相似的表型，库欣综合征是一种由皮质醇过量产生引起的人类疾病。

除了下丘脑神经元和CRH信号的功能障碍外，更广泛的神经失衡也可以激活应激轴。例如，癫痫发作已被证明会激活下丘脑轴，从而增加未来癫痫发作的可能性。据报道，Dscaml1突变大鼠和DSCAML1功能丧失变异体的人类患者表现出神经元过度激活和癫痫发作。因此，在斑马鱼dscaml1突变体中，下丘脑外区域的兴奋-抑制不平衡可能导致下丘脑CRH神经元放电增加。需要进一步研究dscaml1的细胞类型特异性功能，以了解dscaml1−/−动物应激轴过度激活的确切原因。

皮质醇信号与CRH神经元发育之间的相互作用

促进和反馈是应力轴的特征。当CRH神经元控制皮质醇水平时，皮质醇信号也影响CRH神经元的发育。斑马鱼基因突变体具有与dscaml1-/-动物相似的表型，包括缓慢的视觉背景适应、缓慢的光起反应、升高的皮质醇和增加的crhb表达。令人惊讶的是，dscaml1-/-动物的糖皮质激素受体信号并没有减少(如在突变体中)，而是具有完整的糖皮质激素受体信号，地塞米松对NPO中的crhb表达有很强的抑制作用。因此，尽管表面上的表型相似，潜在的信号机制在dscaml1和gr突变体之间是不同的。

鉴于DSCAML1在调节突触形成中的已知作用，crhb表达的增加可能是由上游应激相关神经输入的过度激活引起的。在啮齿类动物中，各种慢性应激模式通常会导致PVN中CRH的上调。应激相关突触活动引起的转录激活可能克服了糖皮质激素受体信号介导的负反馈。需要进一步的工作来澄清皮质醇紊乱和发育缺陷之间的关系。一种可能的方法是通过基因消融肾间细胞(即，基因肾上腺切除术)和补充恒定水平的外源性皮质醇来使皮质醇水平正常化。

结语

总之，本研究表明DSCAML1在调节神经内分泌应激轴的下丘脑神经元的发育中是不可或缺的。我们将斑马鱼作为应激轴发生的脊椎动物模型，发现dscaml1的缺失会导致CRH神经元缺陷和应激轴功能障碍,进而导致人们承受及调节压力的能力失衡，导致抑郁和焦虑的发生。这项研究不仅揭示了压力诱发抑郁焦虑的潜在机制途径，也为多种精神疾病的治疗带来新的探索方向（包括智力障碍、自闭症谱系障碍、精神分裂症、癫痫和应激障碍等疾病中均发现了DSCAML1缺陷，这些疾病的发生可能同样和应激轴的发育缺陷有关）。

基金：本项目由联邦研究商业化基金(ER14S-001LS to YAP)、弗吉尼亚-马里兰兽医学院校内研究基金、联邦卫生研究委员会拨款(# 208-06-21 to YAP)、美国国立卫生研究院(R01MH131820)和弗吉尼亚理工大学资助。