杂志：Translational Psychiatry

影响因子：6.8（2022-2023）

年份：2020

通讯作者：Robert J. Bryson-Richardson

通讯作者单位：School of Biological Sciences, Faculty of Science, Monash University, Clayton,

Australia

摘要

前言

注意缺陷多动障碍(ADHD)是一种非常普遍的神经发育障碍，影响了约5%的学龄儿童，并在30-60%的病例中持续到成年。脑容量的减少也常常与这种疾病有关。

据估计，遗传因素占ADHD病因的约80%。基因组全关联研究(GWAS)的荟萃分析发现了几种可能与ADHD有关的DNA变异，包括rs2294123，它映射到带电多泡体蛋白7 (CHMP7)。此外，最近的大规模GWAS表明，rs2294123处于显著LD状态，其中几个snp显示与ADHD有名义上的关联(补充图1，补充表1)。然而，缺乏对这些相关基因对ADHD发展贡献的功能验证。通过候选基因和GWAS方法检测到的大多数变异都映射到基因组的非编码区域。考虑到非编码区在基因表达中发挥的广泛作用，将中性ADHD相关变异与致病/致病变异分离仍然是一个主要挑战。

为了解决这个问题，Tong等人开发了一个芯片管道，优先考虑与ADHD相关的一组非编码单核苷酸多态性(snp)，用于功能分析。他们发现了一个SNP (rs2294123, G→T)，映射到CHMP7的5个UTR，这与ADHD显着相关。风险等位基因(T)的纯合子与ADHD个体较低的神经认知功能、较高的ADHD症状特征以及与纯合子G个体相比，CHMP7转录水平降低33%显著相关。这些发现表明，CHMP7表达的减少有助于ADHD表型，值得进一步研究。

CHMP7在内体分选、核膜形成中起重要作用，最近被认为与脊髓和球性肌萎缩有关。它与运输所需的内体分选复合体(ESCRT)家族成员ESCRT-III相互作用。几个CHMP家族成员是ESCRT-III的一部分，与神经发育过程有关，并且已知有助于神经精神疾病的发展。这支持了进一步研究CHMP7在ADHD中的作用的必要性。

为了研究CHMP7与ADHD的功能相关性，我们使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术生成了一个chmp7斑马鱼突变系，并假设chmp7杂合(chmp7+/-)动物会模仿与ADHD相关SNP (rs2294123)相关的转录本减少。我们证明chmp7+/-鱼比野生型(chmp7+/+)更活跃，并且总脑容量减少，类似于ADHD病例的报道。此外，我们还表明，通过应用通常用于治疗多动症的哌醋甲酯，可以显著降低chmp7+/-鱼的多动症。总的来说，我们已经提供了实验验证CHMP7作为ADHD的危险因素。

材料和方法

根据MARP/2015/004/BC繁殖群体许可证，鱼在莫纳什大学鱼核心设施中饲养。创建转基因品系获得生物科学学院动物伦理委员会(BSCI/2015/07)批准。实验以野生型(t<s:1> bingen, TU)胚为背景进行。

chmp7突变系的产生及基因分型：

为了创建chmp7突变斑马鱼系，根据Gagnon等人的研究，生成了靶向chmp7 (ENSDARG00000041362)外显子2的引导RNA。将单细胞期胚胎注射含有150 ng/µL引导RNA、5µg/µL Cas9蛋白(PNA Bio, Newbury Park, CA, USA)、20µM STOP cassette、0.25µL Phenol Red、0.25µL Cascade Blue (Molecular Probes, Waltham, MA, USA)和超纯H2O的混合物，最终体积为2.5µL。选择胚胎进行Cascade Blue，表明注射成功，在24 hpf下饲养至成年。通过与TU鱼的异交鉴定F0个建立者，收集15~20个后代的DNA，并将汇集的DNA作为靶位点周围区域PCR扩增的模板。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对异二聚体进行可视化分析。将创始人与野生型鱼进行异交，并利用PCR和凝胶电泳技术筛选F1个体是否存在突变。使用Sanger测序确定突变。实验采用F3及其后代。引导rna和引物序列见补充表2。采用等位基因特异性KASP荧光法(LGC Biosearch Technologies, Teddington, Middlesex, UK)进行基因分型。

整胚原位杂交：

为了生成检测chmp7表达的探针，使用引物从基因组DNA中扩增出chmp7片段(补充表2)，并将其克隆到pGEM-T Easy (Promega,Madison,WI,USA)中。使用chmp7和M13引物组合通过PCR确定序列方向(补充表2)。使用chmp7原位模板反向和pGEM-T Easy M13正向引物从质粒中扩增探针模板，并使用前面描述的T7 RNA聚合酶生成双氧合核糖探针。按照Ruparelia等人的方法进行全载原位杂交。

PT-PCR：

RT-PCR检测chmp7何时表达。cDNA合成是在野生型胚胎的8和16体期(1、1.5、2、3、4和5 dpf)提取的RNA上进行的。使用制造商(Sigma,St.Louis,MO,USA)描述的TRIzol®试剂分离总RNA，并用DNAse(Promega)处理以去除可能的DNA污染。使用Superscript III第一链合成试剂盒(Invitrogen, Waltham, MA, USA)逆转录1µg总RNA。RT-PCR引物见补充表2。PCR周期为:96°C初始变性周期2 min, 96°C、57°C、72°C 30个周期，各30 s;最后在72°C下延长5分钟。25µL PCR产物在1% Tris-acetate-EDTA琼脂糖凝胶上进行可视化。

qPT-PCR：

采用qRT-PCR比较不同基因型间chmp7 mRNA的表达水平。在6 dpf时从chmp7+/+、chmp7+/-和chmp7−/−胚胎中提取RNA，并在每个生物重复中与每个基因型的固定数量的鱼(20-25)混合。cDNA的制备方法如上所述。采用Lightcycler 480 (Roche, Basel, Switzerland)和SYBR Green混合试剂(Roche)进行qRT-PCR。以肌动蛋白(actin)、β 1 (actb1)、18s核糖体RNA (18SrRNA)和真核翻译延伸因子1α1 (eef1α1)的平均表达值为参考。引物见补充表2。每个生物重复进行3次技术重复。使用广义混合线性模型来检查mRNA水平的差异。基因型检验为固定效应，生物复制检验为随机效应。使用Satterthwaite估计自由度进行F检验。

24小时运动试验:6 dpf：

斑马鱼的活动水平在6 dpf时使用运动试验来检查幼虫阶段表现出自主运动的活动，同时仍然使用高通量行为试验。在09:00-10:00之间收集胚胎，在培养皿中培养14小时(09:00-23:00,300勒克斯±20勒克斯)和10小时(23:00-09:00，全黑暗)循环，直到6 dpf。第5、6天09:00 ~ 10:00饲喂浓缩草履虫0.5 ml, 14:00~16:00每日更换培养基。第6天14:00-16:00，将幼虫转移到24孔板上，每孔含有1.5 ml E3胚培养基(5 mm NaCl,0.17 mm KCl,0.33 mm CaCl,0.33 mm MgSO4)，以适应环境。在第6天22:30至22:50之间，将板转移到Zebraboxes (Viewpoint,Lyon,France)。22:50关闭斑马箱，让鱼适应黑暗10分钟，23:00开始录像。实验在全黑暗条件下进行24小时30分钟，之后处死胚胎并进行基因分型。

24小时运动试验:6 dpf时给药：

为了检验哌醋甲酯的作用，如上所述进行了运动试验。然而，在第6天22:00时，将150µL的dH2O(对照)或100µM的盐酸三甲基哌醋酯(Tocris Bioscience, Bristol，英国)添加到含有1.35 ml E3培养基和鱼的孔中，得到每个孔1.5 ml和10µM哌醋酯的最终体积，如Lange等人所述。升高的盖子用于防止蒸发，任何显示冷凝的孔都从分析中移除。在每个实验中，哌醋甲酯和载体随机分布在整个培养皿中，研究者对第三方治疗不知情。在初始混合模型试验后去除盲板。

24小时运动试验:受精后6周和12周：

运动测定法用于检测幼鱼和成鱼的活动水平。用50 mM NaOH和1 M Tris-HCl (pH 7.5)从鱼鳍剪片中提取DNA，在3 dpf处进行基因分型，然后进行基因分型。饲养周期为白天12 h，夜间12 h(分别为08:00-20:00和20:00-08:00)。在第41天和第83天的12:00-14:00之间，将鱼转移到单独的水箱中适应环境。在第41天和第83天的19:00到19:50之间，坦克被转移到Zebracubes (Viewpoint，每个系统9辆坦克)。19:50关闭斑马灯，让鱼适应黑暗10分钟，20:00开始跟踪。基因型的位置随机化，研究者对基因型不知情。视频跟踪在完全黑暗的情况下运行24小时30分钟，之后将鱼放回鱼缸。

视频分析：

使用Ethovision (Noldus, version 14, Wageningen, Netherlands)分析视频。阈值为:移动，1毫米/秒;停止，0.75 mm/秒;检测阈值，动态减法，深色，9。使用体素平滑去除6 dpf分析中的误差，排除了每帧<0.04 mm和> 12 mm的运动。

运动试验统计分析：

使用Microsoft Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA)处理数据，使用SPSS Statistics 26 (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。数据按时间顺序按10分钟的顺序排列。不包括长度小于300秒的视频的结尾时间点。每条鱼的活动数据按小时汇总。通过将每条鱼每小时的活动与来自各自重复的所有鱼每小时的平均活动值进行比较，确定每条鱼每小时的标准化值。然后将基因型分配给单个鱼，并将基因型不明确的鱼从分析中删除。排除最初24小时后30分钟的数据点。使用GraphPad Prism Version 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)中的线形图对数据进行可视化。

为了检查活动的差异，使用了混合线性模型。在6、42和84个dpf运动实验中，使用了时间和基因型的主要效应，以及时间与基因型的交互效应。时间(h)的重复测量使用一阶自回归方差结构对6 dpf试验进行建模，对42 dpf和84 dpf试验使用对角方差结构。采用斑马箱跟踪系统的随机效应，以及按基因型分组的个体动物。对归一化数据应用自然对数变换，以满足通过残差检查来检查的正态性假设。使用最大似然模型进行F检验，使用Satterthwaite估计自由度。药物治疗试验采用时间、治疗和基因型的主要效应，以及时间、基因型和治疗的相互作用效应。所有时间点的两两比较均为双尾比较，采用Bonferroni校正进行多重比较。

共聚焦显微镜实时成像：

将chmp7+/-鱼与绿色荧光蛋白(GFP)标记的HuC报告基因(HuC:eGFP)转基因(Tg)系杂交，饲养至成年。Tg (HuC: eGFP);将chmp7+/-鱼与chmp7+/-鱼杂交，胚胎在含有200µM N-苯硫脲(PTU, Sigma)的E3中培养6 h以抑制黑素细胞的形成，每48 h更换一次培养基。胚胎在2 dpf下进行荧光分选。在3 dpf时，用0.0016%的三卡因甲磺酸(Sigma)在E3中麻醉鱼，剪断鱼尾，提取DNA，按基因型对鱼进行分类。为了检查幼虫期的脑容量，与运动试验一致，在6 dpf时，胚胎再次麻醉，并将其置于含三卡因的E3中1%低熔点琼脂糖中，置于0.8 mm氟化乙丙烯(FEP)管中(Bola, gr<s:1>斯菲尔德，德国)。基因型随机化，研究者对基因型不知情。使用Thorlabs共聚焦显微镜(Newton, NJ, USA)， Olympus 20倍水浸1.0 NA物镜(Tokyo, Japan)，针孔25µm, 2.005µm/pixel，步长= 1µm，平均16帧。

大脑图像配准和分析：

使用Advanced Normalization Tools (ANTs)配准软件(3.0.0.0)实现了实时共聚焦堆栈的图像配准，该软件运行在莫纳什大学的MASSIVE计算集群上。使用Gupta等人描述的cobraZ脑容量分析软件分析配准图像。除了总体积外，还使用广义混合线性模型检查了与已知ADHD个体中具有体积差异的人类大脑区域(端脑(pallium, pallium下，前连合)，丘脑和丘脑腹侧)相似的脑区域。基因型检测为固定效应，生物复制检测为随机效应。采用Satterthwaite估计自由度进行F检验。多次比较的Bonferroni校正应用于每个测试。

chmp7在整个发育早期都有表达

斑马鱼拥有人类CHMP家族基因所有成员的同源基因(补充图2，补充表3)。更重要的是，斑马鱼的Chmp7蛋白与人类的序列同源性为51%，相似性为70%。为了确定chmp7在斑马鱼中的表达位置和时间，对野生型胚胎进行了原位杂交和RT-PCR。我们观察到，chmp7在受精后1天(dpf)在胚胎中普遍表达，在大脑中表达水平较高，到2 dpf时更局限于头部。在6 dpf时，仅在头部和肾脏可见(图1A)。RT-PCR显示，chmp7在8-somite阶段表达到至少5dpf(图1B)。

chmp7杂合子mRNA水平降低

在确认在斑马鱼早期发育过程中可以检测到chmp7表达后，使用CRISPR-Cas9基因组编辑对该基因进行突变，导致外显子2缺失7bp (补充图3A)。这导致增加了20个氨基酸，并在第142个氨基酸后面添加了一个终止密码子(补充图3B)。预计这将去除蔗糖非发酵蛋白7 (Snf7)结构域，该结构域是CHMP7的主要催化结构域，负责与CHMP4B和ESCRT-III相互作用。

据预测，这种突变会触发无义介导的衰变和蛋白质的损失，而不是产生截断的异构体。为了确定chmp7+/-鱼是否减少了chmp7 mRNA，从而模仿ADHD相关SNP的ADHD风险等位基因(T)纯合个体的减少，对来自chmp7+/+， chmp7+/-和chmp7−/− 6dpf鱼的cDNA进行了定量实时PCR (qRT-PCR)。混合线性模型显示mRNA水平显著降低(F=71.41 (2,4)， p=0.001，图2)，与chmp7+/+相比，chmp7+/-鱼的chmp7 mRNA总量为53% (t=-5.13 (4)， p=0.007)，支持使用chmp7+/-鱼作为与rs2294123纯合子ADHD风险等位基因相关的CHMP7 mRNA水平降低模型(T)。

图2 chmp7+/+、chmp7+/-和chmp7−/−胚胎的qRT-PCR。混合线性模型显示基因型之间存在显著差异(p = 0.001)。数据来自三个生物重复，并归一化为chmp7+/+值。中线=平均值，误差柱=平均值的±标准误差(SEM)。

chmp7杂合幼虫表现出多动表型

鉴于chmp7+/-鱼具有与CHMP7 ADHD风险等位基因纯合的个体相似的chmp7 mRNA水平降低，我们研究了chmp7 mRNA水平降低是否会导致胚胎(6 dpf)、幼年(42 dpf)和成年(84 dpf)阶段的多动表型。

chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)在6 dpf时的斑马鱼活性被跟踪了24小时，从受精后14小时(hpf)的第6天开始(图3)。混合线性建模分析显示了基因型的显著主要影响(F=4.70 (1,287.06)， p=0.031)。基因型与时间无交互作用(F=0.77 (23, 3543.20)， p=0.78)。这表明，在24小时内，chmp7+/-鱼始终比chmp7+/+鱼更活跃。

为了确定过度活跃的表型是否持续到幼鱼和成鱼阶段，研究人员在24小时内跟踪了chmp7+/+和chmp7+/-鱼的活性，从幼鱼41天11hpf开始，到成鱼83天11hpf开始。在整个实验期间，幼鱼(chmp7+/+， n = 41, chmp7+/-，n=50, F=0.29 (1,61.52)， p=0.59，补充图4A)或成鱼(chmp7+/+，n=30, chmp7+/-，n=36, F=0.008 (1,60.55)，p=0.93，补充图4B)的基因型之间没有显著差异，这表明过度活跃的表型不会持续到幼虫期。

图3 chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)斑马鱼6 dpf胚胎24小时内的活性分析。y轴显示的是每个基因型每小时移动的平均时间，单位是秒。数据来自三个生物复制。误差条=±SEM。

chmp7杂合子的脑容量明显更小

鉴于一贯报道的ADHD个体脑容量减少，在泛神经元荧光Tg(HuC:eGFP)背景下，使用共聚焦显微镜在6 dpf下对chmp7+/+ (n=12)和chmp7+/-(n=12)斑马鱼头部进行活体成像(图4A)。我们观察到，与chmp7+/+鱼相比，chmp7+/-鱼的总脑容量减少了9.2% (F=11.49 (1,20)，p=0.018，单尾，图4B)。然而，我们没有观察到在特定选定的大脑区域有显著差异(补充表4)。

图4 chmp7杂合子在6 dpf时总脑容量减小。(A)Tg(HuC:eGFP)、chmp7+/+ (n=12)和Tg(HuC:eGFP)、chmp7+/-(n=12) 6 dpf鱼的全脑最大强度投影。(B)与chmp7+/+鱼相比，chmp7+/+鱼的总脑容量显著减少。数据来自三个生物复制。中线=平均值，误差柱=±SEM。

哌醋甲酯可显著降低chmp7杂合子的过动性

为了确定哌醋甲酯是否可以改善chmp7+/-鱼的过度活跃，我们对chmp7+/++ dH2O (n=179)、chmp7+/-+ dH2O (n=160)、chmp7+/++10µM哌醋甲酯(n=171)、chmp7+/-+10µM哌醋甲酯(n=166)斑马鱼进行了为期24小时的追踪，从第6天开始，14 hpf。与chmp7+/-+dH2O鱼相比，chmp7+/++dH2O鱼在10小时夜间表现出过度活跃(图5)。然而，chmp7+/-+哌醋甲酯鱼的这种影响减弱。混合线性模型显示基因型、药物治疗和时间之间存在显著的相互作用(F=1.60 (69, 8038.37)，p=0.001)。鉴于基因型和治疗随时间的显著相互作用，我们调查了不同时间组间的差异。

与chmp7+/++ dH2O的鱼相比，chmp7+/++ dH2O的鱼在夜间大部分时间表现出显著的多动症(第3小时，p=0.002;第4小时，p=0.007;第5小时，p=0.013;第6小时，p=0.020;第7小时，p=0.025;第8小时，p=0.014)。施用哌甲酯逐渐降低chmp7+/-+哌甲酯鱼的活性，直至显著低于chmp7+/-+ dH2O鱼(第8小时，p=0.045)。此外，chmp7+/-+哌甲酯鱼与chmp7+/++ dH2O鱼在夜间大部分时间无显著差异。这表明，施用哌甲酯足以显著减少chmp7+/-鱼的过度活跃，其水平与野生型相当。

图5 chmp7+/+和chmp7+/-斑马鱼6 dpf胚胎在10µM盐酸甲酯(MpH)或dH2O处理下24小时的活性分析。Y轴显示的是每个基因型每小时移动的平均时间，单位是秒。数据来自六个生物复制。误差条=±SEM。

讨论

斑马鱼正在成为一种有前途的神经精神疾病模型。我们在这里首次展示了斑马鱼模型的实用性和多功能性，通过分析游泳活动和脑容量作为ADHD的表型来验证ADHD遗传关联。在6条dpf chmp7+/-鱼中观察到的多动症并没有持续到成年，这证明了斑马鱼用于测试ADHD表型的时间进展。斑马鱼也可以用来检查ADHD患者通常观察到的脑容量变化，为ADHD相关性提供解剖学证据。最后，对哌醋甲酯的反应表明多巴胺(或去甲肾上腺素)信号的失调可能导致观察到的多动症。此外，考虑到哌甲酯的有效性在ADHD个体之间存在差异，使用斑马鱼来测试ADHD相关基因模型对药物的反应可能有助于了解药物反应的变异性。

chmp7+/-鱼过度活跃的分子机制需要进一步研究。考虑到chmp7+/-鱼对哌甲酯治疗的阳性反应，这提示多巴胺或去甲肾上腺素信号异常。虽然我们在chmp7+/-鱼中看到的表型可能与其他神经递质途径有关，但异常的多巴胺能信号传导，尤其是多巴胺能信号传导，一再与多动症相关。因此，研究CHMP7在多巴胺信号传导中的作用需要进一步的研究。此外，在ESCRT-III蛋白的敲低、功能丧失和显性负突变中可以看到神经元修剪缺陷。鉴于CHMP7与ESCRT-III蛋白已知的相互作用，当CHMP7 mRNA水平降低时，神经元修剪也可能被破坏。因此，chmp7+/-鱼的过度活跃表型可能是由于缺乏有效的神经修剪，导致神经网络成熟延迟，神经网络对冲动控制或运动控制/协调至关重要。这与多动症患者的神经发育迟缓是一致的。

图3和图5所示的实验表明，与chmp7+/+相比，chmp7+/-的鱼明显过度活跃。然而，在哌甲酯实验中，chmp7+/-+ dH2O对照组基本上重复了之前的活性实验，多动症仅限于夜间。这可能表明chmp7 mRNA的减少对睡眠模式而不是清醒时的认知有更强、更一致的影响。这与多动症患者经常出现的睡眠障碍，以及受试者之间和体内昼夜节律的可变性是一致的。此外，在果蝇中，多巴胺转运蛋白或嗜乳蛋白的泛神经元敲低中观察到夜间过度活跃，这被认为是多巴胺信号失调的特征。这强调了多巴胺失衡可能导致了chmp7+/-鱼中观察到的多动表型。这与应用甲基苯乙烯对表型的改善是一致的(图5)。

结语

这项研究是同类研究中首次使用动物模型对CHMP7作为ADHD风险基因进行功能检测。这也是通过GWAS鉴定的ADHD相关基因首次在斑马鱼中进行功能验证。我们在这里证明了chmp7+/-鱼是CHMP7 ADHD相关等位基因的合适模型，并且chmp7 mRNA水平的降低与多动症表型和脑容量减少有关。此外，这种多动症可以通过哌甲酯治疗得到缓解，这有助于我们了解药物反应性变异的特定ADHD危险因素。更广泛地说，我们提倡使用斑马鱼来模拟最近从大规模GWAS中出现的大量ADHD候选基因。