杂志：Ecotoxicology And Environmental Safety

影响因子：6.8（2022）

年份：2023

通讯作者：Wenzhu Wu , Guixiang Ji

摘要

帕罗西汀（PRX）是一种广泛存在于自然环境中的常见抗抑郁药物。在过去的几十年里，许多研究都集中在PRX对抑郁症的有益作用上，但其毒性特性和潜在的机制尚不清楚。在这项研究中，斑马鱼胚胎从受精后4到120小时（hpf）暴露于1.0、5.0、10和20 mg/L PRX表明，PRX暴露在斑马鱼胚胎造成不利影响，包括减少体长、血流速度、心脏频率、心输出量和增加爆发活动和心房面积。同时，用Tg（myl7：EGFP）和Tg（lyz：DsRed）转基因斑马鱼检测PRX的心脏毒性和炎症反应。此外，PRX刺激后，心脏发育相关基因（vmhc、amhc、amhc、hand2、nkx2.5、ta、tbx6、tbx16和tbx20）和炎症基因（IL-10、IL-1β、IL-8和TNF-α）表达上调。此外，阿司匹林还被用于缓解PRX诱导的心脏发育障碍。总之，我们的研究证实了PRX诱导斑马鱼幼鱼的炎症相关心脏毒性。同时，本研究表明了PRX对水生生物的毒性作用，并为PRX的环境安全提供了依据。

关键词：帕罗西汀；斑马鱼；心脏毒性；炎症反应

引言

帕罗西汀（PRX）是一种由葛兰素史克公司（GSK）于1991年发明，被广泛使用的抗抑郁药物，近30年来也被用于治疗强迫症（OCD）、社交焦虑症（SAD）。PRX作为一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），通过阻断5-HT转运体（SERT）来增加5-HT水平，与过去20年广泛使用的三环类药物相比，具有更低的生物毒性。PRX被广泛用于精神疾病，包括抑郁、焦虑障碍和创伤后应激障碍。约97 %的PRX通过尿液排出，因此PRX及其代谢物很容易排入污水处理系统。因此，PRX广泛存在于自然环境中（主要是在地表水中）。

目前，药物残留正在成为水生环境的主要污染途径。加拿大一家制药厂的一项研究显示，直接污水排放的PRX浓度高达3380 ng/L。另一项研究表明，加拿大下游河流（约17公里）污水处理厂的PRX浓度低于0.1 μg/L。意大利北部的一项研究显示，在医院附近、污水处理厂（WWTP）和远离医院的其他废水中的PRX浓度分别为0.067、0.041、0.013 μg/L。

研究了PRX在水生生物中的多种毒性作用。Maria·安东诺普卢等人先前的研究表明，在环境相关浓度（约0.067 μg/L）下，PRX可对藻类物种产生毒性作用，而另一项研究证实，PRX的大水蚤（一种水生模式生物）的EC50约为6.24 mg/L。在啮齿类动物中，有三种类型的5-HT SSRIs（包括PRX）可以显著降低大鼠的心率；在藻类和细胞中也显示了类似的毒性作用。然而，迄今为止，鱼类体内的毒性信息还很少。研究表明，抗抑郁药物的使用与心血管疾病呈正相关。值得注意的是，炎症反应是过去几十年来最显著的毒性作用之一（特别是在急性毒性方面）。因此，深入解读PRX诱导炎症的机制是至关重要的。斑马鱼与人类具有70 %的遗传相似性，被广泛用于水生环境污染物的毒理学评价。此外，我们还利用Tg（myl7：EGFP）和Tg（lyz：DsRed）转基因斑马鱼幼鱼来研究PRX的心脏毒性和炎症反应。在机制上，我们在转基因斑马鱼幼虫中检测了心脏发育相关和炎症基因的表达，阿司匹林靶向通过炎症改善PRX诱导的心脏发育障碍的保护作用强烈支持。

材料和方法

帕罗西汀（PRX）（纯度：97 %，CAS：61869-08-7）购自上海Acmec生化公司，二甲亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich公司。用DMSO稀释PRX，DMSO浓度低于0.1 %（v：v）。乙酰水杨酸（阿司匹林）购自MACKLIN（纯度：99 %，CAS：50-78-2）。阿司匹林的浓度（10 μM）的选择是基于Wang等人（2021）的研究。TRIzol、反向试剂试剂盒和SYBR-GREEN RT-PCR试剂盒均购自Takala（Takala，大连，中国）。

斑马鱼繁殖和产卵

本研究中使用的转基因斑马鱼Tg（myl7：EGFP）、Tg（lyz：DsRed）和野生型斑马鱼（TU菌株）均来自中国科学院水文生物学研究所。选择4个月大的转基因和野生型斑马鱼提供胚胎。所有实验均按照《中国实验动物护理和使用指南》和南京环境科学研究所《实验动物护理和使用指南》（IACUC-20,200,126）进行。健康的成年斑马鱼每天定期喂食两次盐水虾。水温保持在28 ± 1◦C。照明时间为每天光照14小时，黑暗10小时。实验前一天，将成雄和雌雄斑马鱼分别以2：1的比例放置在饲养箱中过夜。第二天早上6点30分，雄性和雌斑马鱼被刺激交配产卵。采集斑马鱼卵进行后续实验。

暴露情况

为了研究PRX对孵化率、存活率和体长的毒性影响，4 hpf斑马鱼卵分别连续暴露于4种PRX浓度（1.0、5.0、10.0.0和20.0 mg/L）中5天。平行测试了溶剂对照（0.1% DMSO）。每个处理组和对照组有60个卵，分为3个重复。PRX溶液每天都在更新。在实验中，每24 h用立体显微镜（尼康，SMZ18，日本）记录孵化率和死亡率。在72 hpf时，通过EthoVision®XT（Noldus信息技术公司，瓦赫宁根，荷兰）测量体长。

斑马鱼幼鱼运动、心功能指标及血流速度的检测

选择10个斑马鱼胚胎，用PRX或不用PRX处理。然后在24 hpf检测斑马鱼胚胎的胎体运动。使用EthoVision®XT（诺尔德斯信息技术公司，瓦赫宁根，荷兰）在72 hpf评估幼鱼的心跳和血流速度。从1 min视频文件中找到心室舒张末期和心室收缩末期。在图中测量心室长轴(a)和短轴(b)。心室体积采用椭球形公式测量：V = 4 π/3×（a /2）×（b /2）2，心搏出量=V舒张-V收缩期，心输出量=心搏出量×心率，射血分数=V（舒张-收缩期）/V舒张期。在每个实验中，一组放置10只斑马鱼。每个实验至少重复三次，以确保可靠性。

转基因斑马鱼检测

使用立体显微镜（尼康，SMZ18，日本）在PRX和阿司匹林治疗后72h分析转基因斑马鱼Tg（myl7：EGFP）（n=10）（标记心肌细胞）和RFP表达强度（lyz：DsRed）（n=10）（标记中性粒细胞粒细胞）的GFP表达强度。然后使用Image J软件（马里兰州贝塞斯达，马里兰州）测量两只转基因斑马鱼（n = 10）的相对荧光强度。每个实验至少重复三次。

实时RT-PCR（qRT-PCR）

每组收集30只斑马鱼幼鱼，用Trizol按照制造商的说明提取总RNA。总RNA浓度用纳米滴分光光度计检测。然后，应用SYBR Green PCR试剂盒（Takara，大连，中国）进行qPCR。以β-actin作为内参基因，所有数据均采用2−ΔΔcT法进行分析。每个实验至少重复三次。

统计分析

所有实验均重复三次，以保证实验的可靠性。统计学差异采用单因素方差分析和Dunnett多重比较（平均SEM±SEM）。所有统计分析均采用GraphPad Prism软件（8.0版）和SPSS软件（25.0版）进行。P<为0.05，视为差异有统计学意义。

结果

PRX诱导了斑马鱼幼鱼的急性毒性

为了评估PRX对斑马鱼幼鱼的急性毒性，我们检测了PRX处理后的孵化率、存活率和体长。如图1所示，在3dpf时与对照组相比，1、5、10、20 mg/L PRX暴露组的体长分别显著降低了96 %、95 %、92 %和92%（图1A、B），在20mg/L处理组中，96 hpf的存活率显著降低了43.33 %。而在120 hpf中，PRX在10 mg/L组时引起了显著差异，存活率降低了56.67%（图1 C）。在孵化率方面，PRX暴露并没有引起明显的变化（图1 D）。综上所述，PRX急性暴露降低了斑马鱼幼鱼的体长和存活率。因此，PRX诱导了斑马鱼幼鱼的一般发育毒性作用。

图1 PRX对斑马鱼幼鱼体长和存活率的影响。 (A)3dpf斑马鱼的典型体长图。(B)体长统计图（与对照组比较*** P < 0.001，**** P < 0.0001）。(C)存活率后24、48、72、96和120 hpf斑马鱼幼鱼（96 hpf与对照组比较*** P < 0.001，120hpf与对照组比较**P < 0.01，***P<0.0001）。(D) 48、72和96 hpf斑马鱼幼鱼在PRX暴露后的孵化率。每组n=10。

PRX诱导斑马鱼幼鱼心功能障碍

与对照组相比，PRX可分别显著提高1、5、10和20 mg/L PRX暴露组斑马鱼胚胎的24 hpf爆发活性（图2A，C）。然而，5、10和20 mg/ L PRX治疗组的心跳活动和心跳频率降低（图2B、D），且呈剂量依赖性。72 hpf斑马鱼在5、10和20 mg/L PRX处理组的背动脉（DA）血流活动（红色圆圈标记）也分别降低（图2 E）。同时检测每搏量、心输出量和射血分数等指标。如图2f所示，5、10、20 mg/L PRX暴露组的心排血量明显降低。总的来说，PRX暴露增强了斑马鱼幼鱼的胎儿运动，降低了心跳频率、血流活动和心输出量。

由于PRX暴露有助于斑马鱼幼鱼的心跳和血流速度的降低，因此我们检测了PRX引起的心脏毒性。在这里，我们用标记心肌细胞特异性表达基因的转基因斑马鱼Tg（myl7：EGFP）来标记斑马鱼的心脏。暴露72 hpf PRX后，测量斑马鱼心脏心室面积（图3a白色箭头）、心房面积（图3A红色箭头）和动脉球窦（SV-BA）距离。结果显示，与对照组相比，20 mg/L PRX暴露组的心房面积显著增加（约210%）（图2A、B），同样，5、10和20 mg/L PRX治疗组的SV-BA距离显著增加（分别约为119 %、115 %和110%）（图2A、C）。这些结果表明，PRX诱导了斑马鱼幼鱼的心功能障碍。暴露72 hpf PRX后，测量斑马鱼心脏心室面积（图3a白色箭头）、心房面积（图3A红色箭头）和动脉球窦（SV-BA）距离。结果显示，与对照组相比，20 mg/L PRX暴露组的心房面积显著增加（约210%）（图2A、B），同样，5、10和20 mg/L PRX治疗组的SV-BA距离显著增加（分别约为119 %、115 %和110%）（图2A、C）。这些结果表明，PRX诱导了斑马鱼幼鱼的心功能障碍。

图2 PRX暴露对斑马鱼幼鱼突发活性和心功能指数的影响。(A)在24 hpf中，PRX治疗后胎儿运动的典型图。(B) 在3 dpf中，PRX治疗后的典型心跳图。(C) 幼鱼运动统计图。(D )心跳的统计图。(E) 斑马鱼DA血管的流量活动统计图。(F) 每博量量、心输出量和射血分数统计图（与对照组比较*P < 0.05，**P <0.01，*** P <0.001，**** P < 0.0001）。每一组n=10。

图3 PRX暴露诱导了Tg（myl7：EGFP）转基因斑马鱼的心脏毒性。(A)  PRX暴露后Tg（myl7：EGFP）转基因斑马鱼的典型形象（V：白色箭头心室；A：红色箭头心房）。(B) 心房面积和心室面积统计图。(C) SV-BA距离统计图（与对照比较*P <0.05，**P 0.01）。每一组n=10。

PRX提高了斑马鱼幼鱼心脏发育和炎症基因水平

为了进一步分析PRX介导的心脏毒性的潜在毒性机制，我们检测了PRX暴露后的炎症相关基因和心脏发育相关基因。结果显示，炎症相关基因，包括白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-1-（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子（TNF-α）显著增加（图4A)，同时，心脏发育相关基因如心室肌凝蛋白重链（vmhc）、心房肌凝蛋白重链（amhc）、心脏和神经嵴衍生物表达2（手2）、NK2同源盒5（nkx2.5）、近距离同源物a（ta）、T-box 6、T-box 6（tbx6）、T-box16）（tbx16）和T-box 20（tbx20）增加（图4B)。这些结果揭示了PRX的潜在机制，即心脏发育和炎症基因的增加。

图4 PRX对炎症和心脏发育基因表达的影响。(A)PRX处理后炎症相关基因IL-10、IL-1β、IL-8、TNF-α的基因表达。(B) RX处理后心脏发育基因vmhc，amhc，hand2，nkx2.5，ta，tbx6，tbx16和tbx20表达。（与对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001）。

阿司匹林在基因水平上减弱了PRX诱导的炎症反应和心脏发育障碍

为了研究炎症反应在PRX诱导的心脏毒性中的潜在作用，我们使用一个经典的非甾体抗炎药（NSAID）阿司匹林来研究抑制炎症反应是否能部分挽救PRX诱导的心脏毒性。与预期的一样，与PRX组相比，阿司匹林治疗显著降低了IL-10、IL-1β、IL-8和TNF-α等炎症基因的表达（图5A），同时心脏发育相关基因vmhc、amhc、hand2、nkx2.5、ta、tbx6、tbx16和tbx20也明显降低（图5B）。为了支持PRX介导的恶化效应，我们将转基因斑马鱼Tg（myl7：EGFP）和Tg（lyz：DsRed）杂交，以标记斑马鱼幼鱼的心脏炎症。结果表明，和对照组相比20 mg/L PRX暴露后，lyz阳性斑点明显增加，而PRX+阿司匹林组的效果明显减弱。PRX组共定位斑点增加，而PRX+阿司匹林组明显降低。此外，阿司匹林显著减轻了PRX诱导的异常心脏形态（心脏面积和SV-BA距离）。这些结果表明，阿司匹林可改善PRX引起的炎症反应和心脏发育障碍。图6。

图5 阿司匹林对PRX诱导的炎症和心脏发育基因表达的影响。(A)PRX和阿司匹林治疗后炎症相关基因IL-10、IL-1β、IL-8和TNF-α的基因表达。(B)PRX和阿司匹林暴露后心脏发育基因vmhc、amhc、hand2、nkx2.5、ta、PRX 6、tbx16和tbx20（与对照组相比*P<0.05，**P<0.001，***P<0.001，****P<0.0001；与PRX组相比# P <0.005，##P<0.01，####P<0.0001）。

图6 阿司匹林对PRX致心肌肥厚的影响。(A)暴露于myl7和lyz双荧光染色斑马鱼（V：白色箭头心室；A：红色箭头心房）。(B) lyz任意单位和myl7-lyz共氧化斑点的统计图。(C)心房面积和心室面积统计图。(D)SV-BA距离统计图（与对照组比较*P < 0.05，**P <0.01；与PRX组比较# P <0.05）。每一组n=10。

阿司匹林可减弱胎儿运动，恢复PRX引起的心功能障碍

如图7所示，PRX暴露组的24 hpf突发活性显著增加，而阿司匹林处理后的突发活性显著降低（图7 A，C）。此外，PRX治疗组的心跳活动降低，但在阿司匹林后恢复（图7 B）。PRX治疗组心跳频率明显降低（图7 D），而PRX+阿司匹林暴露组心率频率明显升高。在心功能评估方面，PRX组的心排血量明显降低，而阿司匹林治疗可部分挽救（图7 E）。总的来说，阿司匹林暴露恢复了斑马鱼幼鱼运动的增加，而降低了心跳频率和心输出量。

图7 阿司匹林对PRX诱发突发活动和心功能指数紊乱的影响。(A)在24 hpf中，PRX和阿司匹林治疗后胎儿运动的典型特征。(B)在3 dpf中，PRX和阿司匹林治疗后的典型心跳图。(C)胎儿运动统计图。(D)心跳的统计图。(E)心输出量统计图（与对照组比较*P < 0.05，**P <0.01，与PRX组比较# P < 0.05，## P <0.01）。每一组n=10。

讨论

如今，随着生存压力的增加，精神疾病的发病率也在逐年上升。根据世卫组织的《2022年世界精神健康报告》，截至2019年，约有10亿人患有精神健康问题。因此，精神药物被广泛用于精神疾病。SSRIs是治疗抑郁症中使用最广泛的精神类药物。QTc延长和长期使用氟西汀与房颤和心动过缓相关。值得注意的是，PRX正在成为临床治疗中主要的精神药物之一，并逐渐扩散到环境中，从而在水生生态系统中积累。然而，PRX在水生生物中的毒性作用和作用机制尚不清楚。因此，在本研究中，PRX暴露首次通过炎症反应导致斑马鱼幼鱼的心脏毒性。用转基因斑马鱼（分别标记的心肌细胞和中性粒细胞粒细胞）来验证斑马鱼幼鱼的炎症反应和心脏毒性之间的因果关系。为了进一步证明这种偶然的关系，我们使用抗炎药物阿司匹林来减弱炎症相关的毒性作用。与预期的一样，经阿司匹林治疗后，心率、心输出量得到恢复，同时，炎症和心脏发育相关基因显著降低。我们的研究结果得到了Al-Taher等人的研究的有力支持，即甲氨蝶呤诱导的心脏毒性作用，其中TNF-α相关的炎症信号通路在心脏毒性中起关键作用。另一种炎症相关信号通路，toll样受体信号通路在心肌梗死中也起着关键作用。

其他研究也证实了炎症反应在心脏功能中的关键作用。例如，炎症反应对心肌损伤、修复和重塑至关重要。先前的研究也证实了炎症反应在非缺血性心脏病中的关键作用。

心房、心室面积和SV-BA距离是心脏毒性的关键指标。我们的研究表明，PRX组的SV-BA距离显著增加，这与马晋泽等人的研究一致，即吡达滨诱导72 hpf幼虫斑马鱼心脏形态增大，构成了吡达滨心脏毒性的特征特性。与我们的研究结果类似，氯氮平（CLZ），一种非典型的抗精神病药物，可以增加SV-BA的距离，并导致炎症反应。此外，PRX引起的心排血量减少与另一个结果相似，表明心力衰竭斑马鱼模型的心排血量减少。

炎症与冠状动脉疾病、动脉粥样硬化等多种心血管疾病密切相关。夏塔雷拉等提出一氧化氮可损害微血管内皮，其中炎症引发心肌细胞功能障碍。心脏发育障碍也可能与炎症反应有关。在斑马鱼胚胎发生过程中，一些基因在心脏发育中发挥着关键作用。例如，hand 2对早期心肌分化和形态发生至关重要，Nkx2.5与心房间隔有关。在心脏发育方面，amhc编码一个心房心肌细胞特异性表达的基因，而vmhc编码一个心室心肌细胞特异性表达的基因。Tbx6、tbx16和tbx20是含有t-box的基因的成员，该基因在心血管发育和稳态中发挥关键作用。因此，为了进一步探索PRX诱导的分子机制，我们采用qPCR在基因水平上验证其心脏毒性。我们的结果表明，符合心脏表型PRX暴露后，炎症相关基因（TNF-αIL-1βIL-8IL-10）和心脏发育相关基因（vmhc，amhc，hand2，nkx2.5，ta，tbx6，tbx16，tbx20）基因水平显著增加，这些过程可以大大恢复阿司匹林。这些结果与Goswami等人的研究结果一致，其中炎症因子IL-1β、白细胞介素-6（IL-6）和TNF-α介导了心脏炎症，证明了PRX介导的炎症在心脏毒性作用中的重要性。

然而，PRX在心脏毒性反应中复杂的毒性机制并不局限于炎症，其他生物学机制（如氧化应激、细胞凋亡和自噬）也可能参与了PRX的慢性暴露。例如，该研究表明，PRX诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡可归因于MAPK依赖的活性氧（ROS）的产生。此外，低剂量的环境暴露可能更能代表人体的体外暴露。因此，进一步探索环境浓度的生物学机制具有必要的意义。由于本研究的急性毒性作用，今后探索PRX的慢性毒性作用仍至关重要。人体内PRX的降解也是深入探索的必要条件。此外，其形态学与基因之间的分子机制和偶然性关系有待进一步研究。最后，还需要采用组学的方法来充分阐明PRX的毒性机制，找到PRX的靶点。因此，开发针对这些信号通路的药物在未来可能更有意义。

原文：Paroxetine induced larva zebrafish cardiotoxicity through inflammation response.

详细网址： https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115096