杂志：Journal of Genetics and Genomics
影响因子：5.9（2022）
年份：2023
通讯作者：Dong Liu, Cheng Wang
通讯作者单位：Nantong Laboratory of Development and Diseases, School of Life Sciences, Co-innovation Center of Neuroregeneration, MOE Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong, Jiangsu 226019, China.
摘要
感觉毛细胞(HCs)损伤是感觉神经性听力损失的主要原因，但由于许多潜在的耳聋基因尚未确定，其病理机制尚未完全了解。Ftr82是鱼类中主要的TRIMs家族成员，已被发现在耳小泡中特异性表达，但其功能尚不清楚。在这里，我们利用斑马鱼模型研究了ftr82在HC发育和听力功能中的作用。原位杂交结果表明，ftr82在不同阶段总是局限于耳小泡内。在ftr82突变体和突变体中均观察到HCs的缺陷，包括嵴HCs明显减少，纤毛缩短，神经鞘功能hcc明显减少，通过外源ftr82 mRNA共注射可成功挽救。惊吓反应行为实验表明，缺乏ftr82基因的幼虫对外部声音刺激的敏感性较低。进一步研究发现，hcc的丢失主要是由caspase-3激活介导的细胞凋亡引起的。我们的研究表明，ftr82是调控HC形态发生和听觉功能表现的重要听力相关基因，为快速鉴定耳聋基因提供了新的思路。
关键词：ftr82，TRIM蛋白，毛细胞发育，听力损失，斑马鱼
前言
感觉毛细胞(HC)损伤通常是引起感音神经性听力损失的原因，这一过程可由多种因素引起，包括遗传改变、噪音、耳毒性药物、衰老等。听力损失正在成为一个全球性的健康问题，由耳聋基因突变引起的遗传性听力损失占80%。因此，寻找新的耳聋关键基因并阐明听觉器官发育的调控机制是至关重要的。到目前为止，已经确定了120多个耳聋基因(https://hereditaryhearingloss.org)，近年来还有许多其他基因被证明与听力损失有关。探索耳聋基因的功能依赖于动物模型的构建。已建立的模型生物，如小鸡、斑马鱼、小鼠和大鼠，已被广泛应用于听觉研究。哺乳动物通常被认为优于非哺乳脊椎动物，因为它们的耳蜗结构和与人类的关系更密切。然而，它们的局限性也很明显，包括复杂的耳蜗解剖分离、耗时表型读数、高成本和低通量等。斑马鱼具有高繁殖力、透明度、易于可视化和基因操作等特点，使其成为快速耳聋基因鉴定和听觉研究的经济和有吸引力的模式生物。
斑马鱼HCs是分布在检测声音和运动的机械感觉器官，包括位于头部和侧线(LL)系统的耳泡。耳囊泡主要由三个正交排列的半规管、小囊和球囊组成。垂直插入壶腹的三个典型的HC簇，被称为嵴HCs，它们可以将外部振动刺激转化为由神经系统传递的电生理信号。此外，LL系统，另一个重要的感觉器官，由系列有规则排列的神经瘤组成，其中HCs被支持细胞和套膜细胞包围。神经肥大系统是LL的基本功能单位，其特征是位于人工表面体，易于染色和成像。许多研究人员已经致力于探索HC的发育和再生的分子机制。据报道，Wnt、Notch和Fgf信号通路，部分转录因子(Atoh1, Sox2, Math1, Gata3)，以及新发现的microRNA广泛参与了这些过程。目前已鉴定出120多个非综合征性听力损失基因，但仍有许多耳聋基因有待发现。
三元基序(TRIM)蛋白，也称为RBCC蛋白，由一个环结构域、一个或两个b -盒和一个预测的线圈区域组成，该区域通常后面是高度可变的c端结构域，如B30.2结构域(PRY-SPRY)。作为E3泛素连接酶的一种，广泛参与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞周期调控、抗病毒先天免疫应答等多种生物学过程。ftr82属于TRIM基因的一个大的新子集，称为鱼类新TRIM (finTRIM, ftr)，仅在硬骨鱼中存在，与之最接近的哺乳动物亲戚是TRIM16和TRIM25，但不是真正的同源基因。有限的研究表明，finTRIM基因主要与抗病毒感染的先天免疫有关。研究表明，ftr36可触发IFN通路，介导病毒复制抑制。FTR83的过表达诱导IFN上调并抑制RNA病毒感染，如IHNV、VHSV和SVCV。对ftr82的有限研究表明，在斑马鱼中，过表达ftr82不会诱导IFN的上调，也不会表现出抗病毒活性。而在橙斑石斑鱼中，ftr82负调控IFN反应，增强SGIV和RGNNV的病毒颗粒复制。此外，一篇论文发现ftr82是一个血管基因，在斑马鱼的血管发育中起着重要作用。此外，ftr82在早期斑马鱼胚胎的卵泡中特异性表达(Kudoh et al.， 2001)。由此可见，ftr82基因的功能在很大程度上仍然未知，在听觉研究中也没有对TRIM蛋白的相关描述。
在这里，我们利用斑马鱼模型研究了ftr82在HC发育和听力功能中的作用。采用全载原位杂交(WISH)技术详细表征了ftr82的表达谱，并观察了ftr82在耳小泡hc中的特异性表达。morpholino注射或CRISPR-Cas9的功能缺失实验均可诱导crisa hc和神经鞘在形态和功能上的缺陷。ftr82基因敲低或敲除均会导致惊恐反应缺陷。同时注射外源ftr82 mRNA可恢复相关表型变化。此外，在ftr82缺失中检测到毛细胞凋亡信号，这在很大程度上解释了HC丢失的表型。综上所述，我们的研究揭示了ftr82在斑马鱼HC发育和听觉功能中起重要作用。这项工作不仅有助于我们全面了解ftr82的基因功能，也为潜在耳聋基因的鉴定提供了新的见解。
结果
为了描述ftr82基因的进化特征，我们分析了斑马鱼ftr82在几种鱼类中的同源关系，也分析了人中最相似的同源关系。对来自不同物种的ftr82氨基酸序列进行了比对，并利用邻域连接（NJ）方法构建了ftr82的系统发育树。NJ树和比对结果显示，ftr82基因在硬骨鱼中具有高度同源性，与人类TRIM蛋白的同源性较低性（图1A和1C）。进一步分析表明，斑马鱼ftr82 包含典型的finTRIMs的结构域结构，包括一个RING/B-Box/卷曲线圈TRIM和一个特定的B30.2结构域（图1B和1C）。结果表明，ftr82基因在硬骨鱼中具有进化保守性，具有典型的TRIMs特征。为了探讨ftr82基因在斑马鱼胚胎发育中的潜在作用，我们利用地高辛标记的ftr82反义探针WISH对ftr82的空间表达谱进行了表征。结果显示，ftr82在斑马鱼胚胎24hpf~96hpf的耳泡中高表达（图1D-1I）。耳囊泡的放大图显示ftr82 mRNA定位于嵴HCs（图1D‘-1I’）。此外，ftr82 mRNA在头部间充质、干血管、尾静脉神经丛（CVP）、心脏和肠道中也检测到的mRNA（图1D-1I）。ftr82在耳小泡发育过程中的特异性表达表明，ftr82可能在斑马鱼的听觉器官发育过程中发挥关键作用。
图1 Ftr82基因在硬骨鱼中保守，并在发育中的卵囊中特异性表达。(A)利用MEGA 6.0版软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，包括斑马鱼ftr82(用红星标记)及其在几种鱼类中的同源物，以及与人类最相似的同源物。(B) ftr82基因典型结构域示意图。(C)斑马鱼ftr82(用红星标记)与鱼类和人类相似同源物的氨基酸序列比对。ftr82的保守结构域包括RING(橙色)、B-Box(蓝色)和coil - coil(绿色)。(D- I)斑马鱼胚胎在24、36、48、60、72和96 hpf时ftr82 mRNA的横向表达谱。在胚胎发育过程中观察到Ftr82 mRNA定位于耳小泡(用红色横线矩形标记)。(D ' i ')放大后的耳囊内阳性信号。
ftr82基因的敲除导致HCs降低、神经瘤减少和纤毛缩短
为了研究ftr82在斑马鱼听觉器官发育中的功能，我们通过向转基因系Tg(Brn3c:mGFP)中注射剪接阻断型morpholino来敲低ftr82基因。首先通过PCR验证了morpholino的有效性，结果表明，ftr82特异性的morpholino可以成功地在目标位点引起有效的错误剪接(图S1)。随后，记录并分析了耳小泡中典型的三簇嵴HCs的发育情况(图2)。图像显示，与72 hpf时正常幼虫的三簇嵴HCs相比，微注射ftr82特异性morpholino的幼虫的嵴HCs较少，纤毛较短(图2B)。为了排除发育迟缓的因素，我们观察了96 hpf时幼虫的嵴HCs，表型一致(图S2)。统计结果还显示，敲除ftr82基因后，嵴 HCs的数量和纤毛的长度均显著减少(图2C-2F)。
图2 ftr82基因的敲低导致耳小泡中典型的三簇crissta hcc显著减少和纤毛缩短。(A)含有典型三簇冠状细胞的耳囊结构示意图。ACHC，前嵴毛细胞;LCHC，侧嵴毛细胞;后嵴毛细胞。(B)分别在对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组获得72 hpf时耳小泡内典型三簇crissta hc的代表性荧光图像。比例尺:20µm。(C, D)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组在72 hpf和96 hpf时不同crissta HC簇中HC数量的统计分析。(E, F)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA抢救组在72 hpf和96 hpf时crissta HC簇纤毛平均长度的统计分析。
众所周知，侧线（LL）系统是斑马鱼的另一个重要的感觉器官，可以感知流体流动和声音振动。为了确定ftr82是否参与了LL的发展，我们在72 hpf和96 hpf下观察和分析了后侧线(pLL)的HC簇和神经突(图3A, 3B, 3D, 3E)。用GFP和eya1标记基因分别识别HC簇和神经突。图像显示，与对照幼虫相比，ftr82变异体在不同阶段的HC簇和神经突都显著减少(图3A和3B)。这与pLL中HC簇数和神经突数的统计结果一致(图3D和3E)。为了更详细地描述LL中hc的变化，我们对单个神经突进行放大和成像，并用FM4-64染料标记功能性hc。有代表性的图表显示，ftr82基因的敲低导致单个神经肥大细胞的hcc显著减少，并伴有不同阶段功能性hcc的减少(图3C和S3)。统计结果一致(图3F和3G)。上述结果表明，ftr82的缺乏影响了耳小泡和耳小泡感觉器官的发育，表现为耳小泡神经突的嵴HCs减少、纤毛缩短以及耳小泡神经突的功能性HCs减少。
图3 ftr82基因的敲低导致pLL中HC簇和神经突的减少，以及pLL单个神经突中HC和功能性HC的减少。(A)对照、ftr82突变体和ftr82 mRNA获救组在72 hpf和96 hpf时pLL中HC簇(用红色箭头标记)的相对比和荧光显微图。比例尺:500µm。(B) 72 hpf时正常、ftr82变形体和获救幼虫中eya1 mRNA的表达谱。红色箭头指向pLL的神经突。(C) 72 hpf时，对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA拯救组pLL单个神经肥大HC簇(绿色)和功能HC簇(红色)的代表性荧光显微图。比例尺:10µm。(D, E)对照组、ftr82突变体和ftr82 mRNA抢救组pLL中HC簇和神经突数量的统计分析。(F, G)对照组、ftr82突变体和ftr82 mRNA拯救组在72 hpf和96 hpf时每个神经肥大细胞的hc和功能性hc数量的统计分析。
ftr82基因的敲除会导致斑马鱼的听力缺陷
众所周知，斑马鱼的机械感觉HCs可以将外部振动转换为由神经系统传递的电生理信号，以感知声音和周围环境中的流体流动。ftr82基因的敲低导致耳泡和pLL的HC降低，斑马鱼的听力功能是否也受到影响尚不清楚。本文采用声惊吓反射行为实验来评价斑马鱼幼体对外界声音刺激的反应。施加不同大小的声刺激，记录并提取声刺激下的运动轨迹(图4A和4B)。统计结果显示，在不同声刺激强度下，ftr82 morphants的平均运动距离和运动峰值速度均显著降低(图4C和4D)。结果表明，ftr82基因敲低会损害幼虫的听觉功能，这反映在幼虫对外部声音刺激的敏感性低于对照组。
图4 ftr82基因的敲除会导致斑马鱼幼虫的听力功能障碍。(A)惊吓响应测试设备示意图。(B)对照、ftr82突变体和ftr82 mRNA 541在9 dB的一次性刺激下以5dpf拯救幼虫。1 ms-2 。（C，D）在不同强度的声音刺激下，5dpf幼虫与对照组、ftr82突变体和ftr82 mRNA拯救组的平均距离和峰值运动速度的统计分析。
敲除ftr82基因会破坏HC的发育和听觉功能
为了进一步鉴定ftr82基因在HC发育中的作用，我们首先利用CRISPR/Cas9对转基因158斑马鱼的基因编辑技术构建了ftr82突变体。我们合成了一个针对ftr82基因外显子2的编码序列的sgRNA，并将Cas9 mRNA共注射到单细胞阶段的胚胎中（图5A）。通过PCR和从生长中的胚胎中提取的基因组DNA测序来验证该基因型。结果显示，突变成功地发生在ftr82基因的靶位点（图5B）。
为了描述ftr82敲除对HC形态发生的影响，我们观察了HCs 163在耳囊泡和pLL系统中的发育过程，以确定ftr82突变体的表型。与ftr82吗啡啉突变体的表型相似，在72 hpf时，ftr82突变体的前、侧、后嵴hc随着纤毛的缩短而明显减少（图5D、5G、5H）。在72 hpf时，ftr82 基因敲除的幼虫中，pLL中的HC簇显著减少，单个神经肥大中的功能HC显著减少（图5C、5E、5I、5J）。在ftr82突变体中，在96 hpf时也观察到了一致的现象(图。S4).进一步研究发现，在惊吓反应行为实验中，ftr82突变体中运动的平均距离和峰值速度明显降低（图5F、5K、170 5L）。以上结果表明，CRISPR/Cas9介导的ftr82突变深刻影响了斑马鱼 HC的发育和听力功能。
图5 在靶位点成功实现了CRISPR/cas9介导的ftr82突变，敲除ftr82基因破坏了斑马鱼HC的形态发生，导致听力丧失。(A)靶向外显子2产生ftr82突变的ftr82特异性sgRNA示意图。(B)与野生型鱼相比，ftr82突变体的靶位点出现了多个突变。(C)对照、ftr82突变体和ftr82 mRNA获救组在72 hpf时pLL中HC簇(用红色箭头标记)的相衬和荧光显微图。比例尺:500µm。(D)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组在72 hpf时的代表性囊泡荧光图像，分别为ACHC、LCHC(用白色虚线圈标记)和PCHC。相应组LCHC放大图。比例尺:20µm。(E)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组在72 hpf时pLL单个神经肥大HC簇(绿色)和功能HC簇(红色)的重叠荧光图像。比例尺:20µm。(F)在9 dB re.1 ms-2的一次性刺激下，在5dpf条件下，对照、ftr82突变体和ftr82 mRNA获救的幼虫在惊吓反应实验中的游动轨迹。 (G-H)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组不同crissta HC簇中HC数量和72 hpf时纤毛平均长度的统计分析。(I-J)对照组、ftr82突变体组和ftr82 mRNA获救组在72 hpf时每个神经肥大中功能性HC数量和pLL中HC簇数量的统计分析。(K-L)不同声刺激强度下，对照组、ftr82突变组和ftr82 mRNA抢救组5dpf幼虫的平均运动距离和峰值运动速度的统计分析。
ftr82突变体和突变体的缺陷表型可以通过微量注射ftr82 mRNA来挽救
为了证实在ftr82突变体和突变体中观察到的表型是由ftr82缺失特异性诱导的，我们进行了经典的mRNA拯救实验。将外源性ftr82 mRNA与morpholino或sgRNA共注射到单细胞期胚胎中进行检测。结果表明，在ftr82变异体中，共注射ftr82 mRNA可以部分修复pLL中嵴hc减少、纤毛缩短、神经肥大和功能hc减少等异常表型(图2、3、S2、S3)。同时，共注射ftr82 mRNA也可以部分恢复听力损失(图4)。同样，微量注射ftr82 mRNA也可以挽救ftr82突变体中出现的HC缺陷和听力功能障碍(图5C-5L, S4)。上述结果表明，HC形态发生异常和听力功能障碍是由ftr82缺失特异性引起的。
ftr82基因功能缺失诱导斑马鱼HC凋亡
为了进一步研究ftr82 186突变体中HC表型的细胞生物学机制，我们用抗凋亡标记物caspase-3的抗体进行了细胞凋亡检测。免疫荧光结果显示，在正常幼虫中没有检测到caspase-3的切割信号，而在ftr82突变体中，近一半的幼虫中caspase-3的切割信号与HC共定位（图6）。此外，我们发现ftr82的功能缺失并不影响支持细胞的发育(图。S5)。这是ftr82在缺失时导致HC减少的主要机制。
图6 敲除ftr82基因可诱导HC细胞凋亡。(A)免疫荧光图像识别565只对照和ftr82突变体的pLL中单个核（蓝色）、HC（绿色）和切割的caspase-3信号（红色）。比例尺：20µm。(B)对对照组和ftr82突变组凋亡信号进行定量分析（n=20）。
讨论
我们都知道，TRIM蛋白具有共同的特征，它们包含相同的RBCC基序排列，包括RING、B-box和螺旋-螺旋结构域。可变c端结构域的多样性决定了TRIM蛋白在不同的细胞过程中的作用，如细胞增殖、分化、发育、肿瘤发生、和凋亡。TRIM蛋白的保守结构跨越了从低等脊椎动物鱼类到哺乳动物的多个物种。哺乳动物中的TRIM蛋白被广泛报道，主要有200种通过直接的病毒限制或调节先天免疫应答参与抗病毒免疫。TRIM5α是第一个发现的TRIM蛋白，作为一种抗病毒药物，可直接与人类免疫缺陷病毒（HIV）衣壳蛋白结合。与此同时，许多TRIM蛋白正向调控抗病毒先天免疫信号通路（TRIM4、TRIM21、TRIM25和TRIM56）或负向调控（TRIM11、TRIM27、TRIM28、TRIM38和TRIM59）。此外，TRIM蛋白在鱼类的抗病毒免疫系统中也发挥着关键作用。鱼类具有几个大的特异性基因扩增，包括finTRIMs (ftr)， TRIM39/嗜血相关TRIM (btr)和trim35样基因/hls5 (hltr)。其中，finTRIM（ftr）是一个新的亚群，只存在于硬骨鱼中，但在高等脊椎动物中没有明显的同源性。有限的报道表明，在病毒感染或IFN诱导后，FTR36和FTR83的表达可能会上调，而ftr01通过TBK1的自噬-溶酶体降解负调控IFN反应。可以看出，TRIM基因中的绝大多数与从鱼类到人类的多物种的先天免疫过程有关。
Ftr82可能是一个基础的和祖先的finTRIM基因，在主要鱼类分支中具有同源性。对用NJ方法构建的ftr82的系统发育树也进行了验证（图1）。斑马鱼中的大多数功能ftr基因通常在非常基础的低水平表达，并通过病毒感染或 IFN治疗显著上调。与ftr基因的典型特性不同，ftr82具有相对较高的组成水平表达，允许ISH信号检测。研究表明，ftr82在24 hpf之前仅局限于外侧中胚层和前肾中胚层，在48 hpf时到达耳泡、肠道、心脏、肝脏、咽和静脉，而在72-96 hpf时，专注于脑鳃、肠道、表皮、肾、肝、咽和脾脏。在我们的WISH实验中观察到普遍一致的结果，然而，区别在于ftr82阳性信号总是局限于在96 hpf之前的不同阶段的耳部囊泡（图1D’-I’）。一个系统和更详细的ftr82表达提供了表达谱，以深入了解潜在的组织特异性功能。此外，ftr82 在SVCV感染期间的6h和48 h时仅出现了轻微的上调。与最近的亲属ftr83不同，过表达ftr82并不诱导IFN的上调。根据之前关于ftr82的报道，它似乎是finTRIM基因中的一个特殊的基因，但没有抗病毒活性的证据。此外，另一份报告显示，ftr82 影响了由Notch/VEGF通路介导的斑马鱼的血管模式。它似乎表明，ftr82基因的功能仍然很大程度上未知。
考虑到ftr82在斑马鱼耳囊中的特异性高表达，我们推测ftr82可能在听器官的发育中起作用。为了确定ftr82是否为听力相关基因，我们首先构建了ftr82突变体。ftr82基因的下调不仅影响耳小泡HC的形态发生，还影响pLL系统HC的形态发生，表现为pLL嵴HC减少、纤毛缩短、神经鞘和功能性HC减少(图2、3、S2、S3)。在CRISPR/Cas9基因编辑技术介导的ftr82突变体中也观察到一致的hc缺陷表型(图5和图S4)，进一步证实了这是由ftr82缺失引起的。此外，在ftr82突变体中出现了HC的异常表型，通过显微注射外源性ftr82 mRNA可以挽救突变体(图2、3、5)。结果表明，HC的丢失是由ftr82的功能丧失引起的。虽然在WISH检测中没有检测到pLL系统中的阳性信号(图1D-1I)，但ftr82基因确实破坏了pLL中hc和神经细胞的发育(图3、5、S3、S4)，这可能是由于WISH检测方法的灵敏度限制。众所周知，细胞凋亡是细胞死亡的主要方式之一。HC细胞凋亡可由半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspases)、p53肿瘤抑制基因、活性氧等多种因素触发。据报道，在人乳腺癌细胞中，TRIM24缺失导致p53依赖的自发凋亡，TRIM69通过p53介导的细胞凋亡调控斑马鱼的发育。在这里，我们检测了切割的caspase-3 252信号，一个细胞凋亡的标记，在近一半的ftr82 突变体幼虫中与HCs共定位（图6）。结果表明，caspase-3激活介导的细胞凋亡是导致HCs缺陷的主要原因。斑马鱼HCs被认为是用于感知外部声音刺激和流体流动。ftr82缺失导致的HCs缺失导致了斑马鱼行为改变，表现为对外部声音刺激的敏感性较低(图4和5）。综上所述，我们的研究表明，ftr82是调控HC形态发生和听觉功能的关键基因。
Ftr82是鱼类TRIMs家族的一员，在这项工作中首次被发现参与了听觉器官的发育。虽然在哺乳动物中没有相应的同源物，但这并不妨碍我们对TRIMs功能的深入理解和推测。斑马鱼作为一种常见的模式生物，在听觉器官发育研究中具有无需解剖即可快速读出表型、实验周期短、成本低、荧光染色分析方便等明显优势。这项工作不仅为全面了解ftr82基因的功能提供了充分的信息，而且为快速鉴定耳聋基因提供了新的见解。
斑马鱼的饲养和伦理声明
本研究采用转基因系Tg(Brn3c:mGFP)和野生型菌株AB。在前者中，膜定位的绿色荧光蛋白(GFP)在HCs中特异性表达。按照我们之前的方案，斑马鱼成年鱼和胚胎在28.5℃的环境中饲养和维持。所有动物实验均经南通大学动物保护与利用委员会批准。所有动物均严格按照南通大学动物护理与使用委员会批准的动物程序处理，符合国家卫生研究院实验动物护理与使用指南。
按标准程序进行全载原位杂交(WISH)。用设计的引物从斑马鱼胚胎cDNA文库中克隆出466 bp的ftr82 cDNA片段(表S1)，并插入到pGEM-T-easy载体中。使用线性化pGEM-T-easy插入ftr82片段和DIG RNA标记试剂盒(SP6&.T7) (Roche， #11175025910)，通过体外转录获得地高辛标记的反义探针。之后，将不同发育阶段的无色素的预先固定的斑马鱼胚胎用探针孵育过夜，用碱性磷酸酶(AP)-偶联抗地高辛抗体(Roche， #11093274910)检测。随后，使用碱性磷酸酶(AP) -底物NBT/BCIP溶液(Roche， #11681451001)进行显色反应，以可视化目标基因的表达。按照上述步骤，用设计好的引物合成eya1 mRNA探针(表S1)，用于识别斑马鱼幼体的神经鞘。
吗啡肽显微注射液及效率验证
利用基因工具公司合成了ftr82特异性剪接阻断吗啉。将吗啉粉溶解在无RNAse的水中制备原液。然后将稀释浓度为0.3 mM的吗啉工作溶液微注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中。通过聚合酶链反应（PCR）验证了吗啉在外显子4和内含子4连接位点引起错误剪接的效率。从注射或不剪接吗啉的胚胎中提取RNA，并逆转转录到cDNA。将设计引物标记在第3外显子和第7外显子上（表S1）来检测ftr82 297的敲除效率。
sgRNA/Cas9 mRNA的合成、显微注射和突变体的鉴定
为了获得ftr82突变体斑马鱼，首先合成了靶向ftr82外显子2的特异性单导RNA (sgRNA)。采用含有ftr82基因靶向区(5′-GGAGGAGCTGAAGACAGCGG -3′)的正向引物和通用反向引物(表S1)，以pT7质粒为PCR模板扩增sgDNA。然后，根据制造商的说明，使用MAXIscriptTM T7转录试剂盒(Invitrogen， #AM1314)，用sgDNA体外转录生成sgRNA。使用mMESSAGE MmachinTM T7 Kit (Invitrogen， #AM1344)，用线性化的pXT7-Cas9质粒体外转录获得Cas9 mRNA。将浓度分别为300 ng/μL和100 ng/μL的Cas9 mRNA和sgRNA混合溶液2 nL微注射到单细胞期斑马鱼胚胎中。为了确定是否发生突变，随机选择注射胚胎提取基因组DNA，并使用设计的内含子1和内含子2的测序引物进行扩增(表S1)。对含有靶向位点的扩增片段进行测序以确定突变类型。
mRNA合成和挽救实验
用设计的引物ftr82-mRNA-BamHI-F和ftr82-mRNA- XbaI-R扩增了含有ftr82开放阅读框约2000 bp DNA(表S1)。将扩增片段插入人工pCS2+载体中，获得重组质粒ftr82-pCS2+。使用mMESSAGE MmachineTM SP6 Kit (Invitrogen，#AM1340)，以线性化重组质粒为模板，体外转录ftr82 mRNA，然后使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，#74104)进行纯化。将50 ng/μL的ftr82 mRNA溶液约2 nL与sgRNA或morpholino共注射到单细胞期胚胎中进行拯救实验。
FM4-64染色和免疫荧光
使用红色荧光生命染料FM4-64特异性标记神经鞘中的功能性HCs，具体步骤如下。将自由游动的幼虫置于3 μM FM4-64胚液中，室温黑暗浸泡45 s。然后去除染料溶液，用胚液轻轻冲洗三次后成像。采用免疫荧光法检测caspase-3细胞凋亡信号。受精后72 h的幼虫在室温下用4% (w/v)多聚甲醛固定2 h，然后用1% Triton X-100渗透30 min，用10%驴血清在37℃下阻断1 h。加入兔单克隆抗裂解caspase-3(1:500稀释，CST, 329 #9664)和鸡多克隆抗gfp(1:500稀释，Abcam，#ab13970)的一抗，在4°C孵育过夜。然后，分别用Alexa FluorTM 555驴抗兔lgG (H+L)(1:1000稀释，Invitrogen，# A -31572)和Alexa FluorTM 488山羊抗鸡lgG (H+L)(1:1000稀释，Invitrogen，# A -11039)的二抗检测一抗。最后用Hoechst 33342(10µg/mL, Invitrogen，#62249)在室温下染色20 min, PBS洗涤3次成像。此外，使用兔多克隆抗sox2(1:500稀释，Abcam，#ab 97959)的一抗特异性识别pLL神经鞘中的支持细胞。
快速反应试验
声惊吓反射的行为实验进行如下。随机选取25只受精后5 d（dpf）的正常幼虫，放入薄层胚培养基的培养皿中。在皿的底部，我们在实验中使用了6 dB和9 dB re ms-2到30 ms的刺激。每个刺激水平重复20次，用红外摄像机在6秒的时间内记录幼虫对声音刺激行为反应。然后，从录像带中提取幼虫的运动轨迹。并分析了运动的平均距离和峰值速度，作为量化幼虫对声音刺激的惊吓反应的典型参数。
成像和统计分析
使用立体显微镜（Olympus，MVX10）记录WISH 实验的结果。用共聚焦显微镜（Nikon，A1-DUT）记录ftr82敲除或敲除模型的HC表型结果、染色和免疫荧光结果。首先用三卡因MS-222（Sigma，#A5040）麻醉，然后用0.6%低熔点琼脂糖成像。获得的共焦图像采用Imaris X64软件（版本352 9.0.1）进行处理。所有实验至少重复3次，数据以平均± SEM 3由PraphPadPrism分析（版本8.0.2）分析。采用双尾、非配对学生t检验确定组间的显著性差异，P < 0.05被认为有统计学意义。条形图上“*、***、****、*****”的符号分别表示P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001、P < 356 0.0001，“ns”表示无显著性。
基金：本研究由国家自然科学基金项目（2018YFA0801004；81870359）、江苏省高等教育学校自然科学基金项目（22KJB320020）、江苏省“创新创业博士”项目资助。
详细网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852722002521
注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。
