杂志：Toxicology

影响因子：4.5（2023）

年份：2023

通讯作者：Dr. Mathieu Vinken

通讯作者单位：Department of Ophthalmology, Tongji Hospital Affiliated with Tongji University School of Medicine, No. 389, Xincun Road, Putuo District,Shanghai 200065, China.Jie Liu

摘要

背景：半胱胺是一种巯基化合物，是活生物体中辅酶a代谢为牛磺酸的中间产物。然而，一些研究报道了半胱胺在儿童患者中潜在的不良反应，如肝毒性。

方法：为了评估半胱胺对婴幼儿的影响，以斑马鱼幼体(脊椎动物模型)为研究对象，从72 ~ 144 hpf暴露于0.18、0.36和0.54 mM的半胱胺。检测细胞一般情况、病理评分、生化指标、细胞增殖、脂代谢因子、炎症因子和Wnt信号通路水平的变化。

结果：肝脏形态学、染色和组织病理学观察显示，半胱胺染毒组大鼠肝脏面积增加，脂质沉积，且呈剂量依赖性。实验半胱胺组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总甘油三酯和总胆固醇水平均高于对照组。与此同时，脂质生成相关因子水平升高，脂质转运相关因子水平下降。氧化应激指标如活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶在半胱胺染毒后上调。随后，转录检测显示生物素酶和Wnt通路相关基因在thel暴露组中表达上调，抑制Wnt信号通路可以部分恢复异常的肝脏发育。

结论：目前的研究发现，半胱氨酸诱导斑马鱼幼鱼肝毒性是由炎症和脂质代谢异常引起的，这是由生物素酶(一种潜在的泛氨酸酶同工酶)和Wnt信号介导的。这为半胱胺在儿童中应用的安全性提供了一个视角，并确定了预防不良反应的潜在靶点。

关键词：半胱胺；斑马鱼；肝；泛酸盐；脂质代谢；炎症。

前言

半胱胺是β-巯基乙胺和2-氨基乙胺的同义物，可以认为是半胱氨酸的脱羧衍生物，实际上是在体内由辅酶半胱胺(β-巯基乙胺和2A降解的同义物)产生。酮体、碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的代谢需要辅酶a。辅酶a裂解后产生中间产物泛替氨酸被称为vanin，由vnn基因编码)作用于泛汀形成泛酸和半胱胺。

除了胱氨酸耗竭效应外，已有研究证明，半胱胺会增加细胞内的谷胱甘肽水平，从而恢复氧化还原状态。相反，在高浓度下，半胱胺的氧化会产生过氧化氢分子，引起氧化应激。不可避免的是，一些研究报告了半胱胺的副作用。其中，恶心、消化不良、呕吐、胃脘痛和溃疡等胃肠道症状最为常见，约14%的患者会出现半胱胺不耐受。有鉴于此，半胱胺被广泛用于胃和十二指肠溃疡的动物建模。少量半胱胺也被代谢为含硫化合物(二甲基硫化物、甲基硫醇)，这可能导致令人不快的口臭和臭汗 。

以往的研究发现，半胱胺可引起儿科患者的肝毒性。根据文献报道，对一名患有肾病型胱氨酸病和严重胃肠运动障碍的2岁女童，每8小时静脉注射5 mg/kg剂量的盐酸半胱胺，然后每周增加1 mg/kg。该女孩在给药后肝转氨酶水平显著升高，包括碱性磷酸酶升高420IU/1(110-320IU/1为正常年龄)，但感染性肝炎筛查呈阴性。停药后，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平迅速恢复正常。半胱胺给药与肝转氨酶水平升高和正常化之间的巧合表明，肝脏生化指标异常是药物的直接作用。在另一份报告中，半胱胺治疗肾病型胱氨酸病可引起肝功能障碍，包括肝静脉闭塞性疾病。

最近，半胱胺已被评价为治疗某些肝脏疾病的一种方法。在一项基于α 1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)成人和儿童患者的人肝细胞的研究中，半胱胺治疗通过挽救α 1-抗胰蛋白酶分泌缺陷和降低氧化应激来改善AATD介导的肝毒性。在另一项跨10个临床中心的多中心随机临床试验中，比较了每日口服酒石酸半胱胺缓释或安慰剂治疗52周后非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)儿童肝脏组织学的改善情况。结果显示，146名儿童参与者中有43名(30%)表现出肝脏组织学改善。此外，在基线时患有关键1区非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的46名参与者中，12名(28%)最终消退。这里出现了相互矛盾的结果，半胱胺对儿童既有治疗作用，也有肝毒性。半胱胺诱导不良反应的潜在机制及其与治疗效果的平衡值得进一步研究。更重要的是，发现膳食中补充半胱胺可以调节大鼠的内分泌和代谢状态，增加脂肪组织、腓肠肌和比目鱼肌中脂钙素受体mRNA的表达，这可能涉及到脂钙素受体在转录水平上的组织特异性反应。联合补充共轭亚油酸和半胱胺可增加大鼠肌肉细胞中的脂质含量。然而，半胱胺引起肝毒性并影响脂质代谢的确切作用机制尚不清楚。

除了与疾病相关的同源基因高度相似(82%)之外，斑马鱼和人类有相当保守的生理过程和器官系统。斑马鱼具有体积小、性成熟周期短、繁殖能力高、胚胎透明、器官发育快等明显优势。因此，斑马鱼已成为国际公认的实验动物，也是研究胚胎发育、器官发生和再生的合适模型。Vanin是泛酸代谢的关键酶，也涉及炎症和脂质代谢的调节。此外，已经在包括细菌、果蝇、小鼠和人类在内的各种原核生物和真核生物中发现了缬氨酸，并且被认为是一种进化上保守的蛋白质。然而，在斑马鱼中既没有发现过缬氨酸的报道，也没有从斑马鱼相关数据库中检索到缬氨酸基因或蛋白质。因此，我们通过生物信息学分析，寻找潜在的斑马鱼vanin或同源物。

根据以往的研究，斑马鱼的肝脏在受精后48 h (hpf)开始形成并迅速发育。在72 hpf时，斑马鱼已经具有完整的肝脏形态和功能。与哺乳动物相比，斑马鱼在暴露于不同的肝毒性药物时具有相似的基因表达模式。我们曾报道，半胱胺会导致斑马鱼骨骼发育异常，这一表型与人类和大鼠等哺乳动物的表型一致。因此，半胱胺在模式生物斑马鱼中的适用性得到了澄清，但半胱胺对斑马鱼其他器官和组织的影响仍有待探索。

本研究通过斑马鱼幼鱼模型研究了半胱氨酸诱导的炎症反应的表型和早期发育中肝脏脂质代谢的紊乱。我们还使用组织切片、免疫荧光染色和实时定量PCR (qRT-PCR)来确定显著变化。本研究旨在阐明半胱胺引起肝脏脂质代谢异常的机制，为半胱胺的合理治疗应用提供理论背景，从而提高医疗安全和公众健康。

半胱胺(CAS No.60-23-1)和IWR-1(CAS No.1127442-82-3)购自Solarbio Technology (Beijing, China)。1-苯基-2硫脲(PTU) (CAS No. 103-85-5)购于德国Sigma-Aldrich公司。苏木精(CAS No. 517-28-2)-伊红(CAS No. 15086-94-9)和油红O (CAS No. 1320-06-5)购于中国上海三工生物科技公司。

斑马鱼饲养

斑马鱼在恒温(281°C)系统中，在典型的操作设置下(光照14小时，黑暗10小时)。本研究的斑马鱼转基因系，包括红色荧光蛋白标记的肝细胞Tg(fabp10:DsRed)、绿色荧光蛋白标记的中性粒细胞Tg(mpx: GFP)、红色荧光蛋白标记的中性粒细胞Tg(lyz:DsRed)和红色荧光蛋白标记的胸腺T细胞Tg(rag2:DsRed)，均从中国斑马鱼资源中心(中国武汉)获得。培育双转基因菌株Tg(fabp10:DsRed;mpx:GFP)，将Tg(fabp10:DsRed)和Tg(mpx:GFP)的雌性或雄性转基因菌株放入交配池中。次日上午，收集受精卵，置于培养液(盐度0.5%，CaCO3: 150 mg/L, pH: 7.0，电导率:500μS/cm)中保存。所有动物研究均按照《实验动物福利指南》进行中华民国科学技术部(2006)并随经井冈山大学动物研究所批准，所有动物实验均在雅高进行与人民的实验动物福利准则共舞中华民国科学技术部(2006)并随经井冈山大学机构动物保护与使用委员会批准。

药物治疗

半胱胺与培养基在室温下溶解，原液浓度为20 g/L, 4℃保存。实验中，用斑马鱼培养基稀释半胱胺储存液，达到合适的浓度。胚胎培养液中添加0.003% PTU，抑制皮肤色素沉着生长。在显微镜下，选择发育形态正常的斑马鱼进行研究，在72 hpf(每孔30只幼鱼)的条件下置于6孔板中。根据我们之前的研究(Chen et al.， 2022)，实验分为空白对照组(仅培养基)、低浓度(L)组(0.18 mM)、中浓度(M)组(0.36 mM)和高浓度(H)组(0.54 mM)。每组重复3次，幼鱼在28.5℃的培养箱中连续孵育3天。每天更换新鲜溶液。此外，为了研究半胱胺对斑马鱼免疫系统发育的影响，在0 hpf至72 hpf的幼体斑马鱼身上重复上述实验，除处理时间外保持程序一致。RNA序列数据的生物信息学分析

斑马鱼形态改变

用100 mg/L三卡因麻醉斑马鱼幼鱼，暴露72 h后固定在3%甲基纤维素中，使用立体荧光显微镜(Zeiss, AXIO ZoOM)捕捉并记录各组肝脏侧荧光的面积和强度。V16,德国)。免疫细胞的荧光图像采集也沿用了上述方法。在72 hpf下观察中性粒细胞，而在144 hpf下观察胸腺T细胞。

斑马鱼油红O染色

半胱胺处理72 h后，每组随机取15只幼鱼，用过量麻醉剂安乐死。用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛(PFA)浸泡过夜，以25%、50%、75%和100%甲醇(PBST配制)梯度脱水，0.5%油红O室温染色24 h，再水合至100% PBS。用甲基纤维素固定后，在双筒显微镜(德国徕卡M205 FA)下检查并拍照。

斑马鱼肝脏的组织病理学

从每组中随机抽取10只安乐死的幼鱼，固定在4% PFA中，然后在乙醇梯度中脱水并浸泡在二甲苯中。石蜡包埋的斑马鱼标本用徕卡RM2235德国显微镜进行切片，HE染色。在德国徕卡DM6B显微镜下对组织切片进行观察和测量。

斑马鱼苏丹黑和中性红染色

苏丹黑特别使中性粒细胞变黑。给药3 d后，每组随机选取10只安乐死幼鱼，转移至1.5 ml离心管中，用1 xPBS洗涤2次，每次5 min。用4% PFA在4°C下固定过夜后，每个离心管中加入1 ml 0.3%苏丹黑染色液，在摇床上染色40分钟。用75%乙醇冲洗掉多余的染料。用甲基纤维素固定幼鱼，体视显微镜(Leica M205 FA，德国)下拍摄侧尾图像。

中性红特异性地将巨噬细胞染成红色。给药3 d后，每组随机选取10只幼鱼，用含0.5%中性红的培养液5 ml染色持续5小时，用培养基冲洗掉多余的染料。将幼鱼麻醉并用甲基纤维素固定后，在徕卡体视显微镜下拍摄背头图像。

斑马鱼肝脏生化参数的测定

每组取60只安乐死幼鱼用0.9%生理盐水匀浆。样品在2500 rpm下离心10 min后，收集上清进行分析。根据制造商的说明书(南京医院(中国南京生物工程研究所)测量和评估丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、高密度脂蛋白(HDL)、总甘油三酯(TC)和总胆固醇(TG)酶活性。

免疫荧光成像

在144hpf下安乐死的斑马鱼用4% PFA在4°C下保存过夜，用1倍PBS洗涤三次，每次5分钟。第二天在20°C下进行丙酮处理4小时。之后，斑马鱼幼鱼剥皮，用3% PT (3% Triton x -100加入1倍PBS)洗涤3次，每次5分钟。将斑马鱼幼鱼与PBTN (3% PT中添加4% BSA和0.02% NaN3)在室温下孵育1小时，然后用小鼠抗pcna抗体(1:100,ab71286, Abcam, UK)在4℃下孵育过夜。一抗用绿色荧光抗小鼠抗体标记，该抗体购自InvitrogenTM (Carlsbad, USA)。接下来，将样品用新配制的DAPI (Roche，德国)溶液(2 ug/ml)在PBS中染色1小时。最后，使用共聚焦激光显微镜(Leica TCS SP8，德国)进行荧光成像。

氧化应激检测

氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平在本研究中使用特定的试剂盒进行测量。首先，在暴露于半胱胺72 hpf后，每组80只斑马鱼胚胎在低温下麻醉，然后进行3次5分钟的PBS洗涤。然后将其与生理盐水混合。在4℃下，10000 g离心10分钟后的上清液用于测量酶的活性。采用BCA法，计算各组总蛋白含量。为了测量吸光度，使用SpectraMax iD3多功能微孔板检测器。通过与硫代巴比妥酸反应在532 nm处测定MDA，通过抑制亚硝酸盐形成在550 nm处测定SOD。同时测定了sod1和sod2的相对mRNA水平。采用以下方法检测活性氧(ROS)。将半胱胺处理至72 hpf的斑马鱼胚胎置于含有10 mg/ml二氯二氢荧光素二乙酸酯(DFCH-DA)的培养基中，室温下处理30 min，避免光照。冲洗和麻醉后，用体视显微镜(德国徕卡)拍摄ROS的分布。所有程序均在制造商(中国南京建成生物工程研究所)的建议下进行。实验重复3次。

基因表达的定量逆转录- pcr分析

采用Tranzol UP (ET111-01, Takara, Japan)提取每组20只幼鱼的总RNA。利用cDNA转录试剂盒(AE311-03, TRANS，中国)，将1 μg的总RNA逆转录成cDNA。TransStart Green qPCR Supermix (AQ601-02, TRANS，中国)使用ABI Step One Plus RTPCR机(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)运行qRT-PCR。反应在以下条件下进行了40个循环:95℃预变性10分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒。采用内参基因eflo对实验误差进行校正。表S1列出了本研究使用的引物序列。

救援实验

每组随机选取发育良好的72hpf胚胎20个，放置于6孔板中，空白对照组只添加培养基，阳性对照组添加0.54 mM半胱胺，实验组添加0.54 mM半胱胺和0.5 μM IWR-1(一种Wnt信号通路抑制剂)。采用蔡司立体荧光显微镜(ZOOM.V16)对144hpf下的斑马鱼肝脏和中性粒细胞进行观察和拍照。

生物信息学分析

人类和小鼠VNN1蛋白序列从Uniprot数据库中获得，tBlastn在线在Ensembl网站上进行。Uniprot Blast在线比对蛋白一级序列。系统发育树分析采用MEGA-X邻接法(Neighbor-Joining, NJ)。

聚类分析

采用数据聚类的可视化统计方法，测定半胱胺对斑马鱼脂质代谢和免疫系统的影响。指标包括斑马鱼的形态参数、肝酶活性、免疫细胞计数和相关基因的相对表达水平。将数据归一化以计算z分数(暴露组的平均值减去对照组的平均值除以对照组的标准差)。使用TBtools软件对这些数据进行聚类和分析(Chen et al.， 2020)。

统计分析

两位不同的研究人员对数据和图像进行了盲检。使用ImageJ软件进行图像统计。在亮场图像中计算卵黄囊和油红O染色面积，以及染色的免疫细胞数量;荧光图像计算斑马鱼肝脏面积、免疫细胞数量和PCNA抗体标记的增殖细胞数量。数据以均数±标准差(S.D)表示，采用单因素方差分析(one - way ANOVA)确定显著差异。如未另行说明，与空白对照比较，统计学显著性定义为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

结果

为了确定半胱胺的生物毒性，斑马鱼胚胎暴露于规定浓度的半胱胺。然后对斑马鱼进行形态学检查。从72hpf到144 hpf，暴露于0.18、0.36和0.54 mM的半胱胺中，斑马鱼的体长缩短(图1A, C)，身体质量指数(BMI)(图1D)随着暴露浓度的增加而增加。斑马鱼胚胎发育受到不同影响。这些表型观察表明，半胱胺暴露导致斑马鱼的发育毒性。在Tg(fabp10:DsRed)转基因斑马鱼中观察到肝损害(图1B)，肝脏发育正常，但半胱胺导致肝脏肿胀，肝边缘不清，药物治疗后肝脏总面积显著增加(图1E)。肝脏荧光强度无明显变化(图1F)。Tg (fabp10:安全域;mpx:GFP)双转基因斑马鱼在半胱胺处理组中肝脏出现中性粒细胞聚集，表明肝脏出现炎症反应(图1G,H)。

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图1 不同浓度的半胱胺在144 hpf下诱导的肝脏发育异常和免疫细胞募集。(A)斑马鱼幼体形态。(B) Tg (fabp10: DsRed)斑马鱼的laval肝面积。幼鱼(C)体长、(D) BMI、(E)肝脏面积、(F)荧光强度定量分析。(G)转基因菌株Tg肝脏区域代表性图像(fabp10:DsRed;mpx: GFP)。(H)中性粒细胞数量定量分析。比例尺:200 um (A)， 100 um (B, G). *P< 0.05, P< 0.01, P< 0.001，平均值±S.D.

半胱胺诱导斑马鱼肝脏的组织学和病理学改变

卵黄的大小可以用来评估斑马鱼幼鱼肝脏的代谢功能，因为在没有外部能量供应的情况下，卵黄是用来维持发育和运动的。结果显示，半胱胺以剂量依赖的方式延迟了蛋黄的摄取(图2A;B)。在144 hpf时，0.54 mM半胱胺处理组的蛋黄面积显著大于对照组，说明肝脏存在显著代谢紊乱。正常肝脏无脂质沉积，油红O不染色;少量脂质沉积或仅部分肝脏有脂质沉积，则油红O染色较轻或仅部分肝脏染色;肝脏出现严重的脂质沉积，整个肝脏被非常深的油红o染成红色。处理组斑马鱼肝脏出现严重的脂质沉积(图2 A, C)。对照组斑马鱼肝脏组织学形态学表现正常，细胞完整饱满，经0.54 mM半胱胺处理后肝细胞变形不规则。此外，细胞间接触变得松散，细胞间基质减少，形成空泡(图2D)。

图2 暴露于144 hpf不同浓度半胱胺的肝脏脂质积累和组织学异常。(A)全载斑马鱼的油红o染色图像。幼鱼(B)卵黄区和(C)油红o染色区定量分析(D)斑马鱼幼鱼肝脏HE染色，左下角黄框内的放大图像。比例尺:100 um (A, C)， 200 um (B). *P<0.05, P<0.01, wP<0.001，平均值±S.D.

半胱胺改变了斑马鱼的肝脏生化参数

采用增殖细胞核抗原抗体和原位末端标记法检测半胱胺肝毒性是否与幼鱼肝细胞增殖有关。结果显示，经0.54 mmol/L半胱胺处理后，肝细胞的增殖能力降低，但无统计学差异(图3a)G).测定72 hpf下全鱼匀浆中ALT、AST、HDL、TG和TC的含量。除HDL外，所有指标均呈剂量依赖性增加(图3 B-F)。与对照组相比，0.36 mM半胱胺处理组TG和TC略有变化，其他指标均显著升高。在0.54 mM半胱胺处理组，所有指标均显著升高。HDL在L组升高，H组降低，但组间差异无统计学意义。以上结果说明，半胱胺诱导斑马鱼肝肿大的主要原因是脂质蓄积，而非肝细胞增殖。

图3 在144 hpf下暴露于不同浓度半胱胺的免疫荧光图像和肝脏生化参数。(A)绿色荧光显示的肝细胞增殖(PCNA蛋白)图像。(B) ALT， (C) AST， (D) HDH， (E) TG， (F) TG， (G) PCNA阳性细胞数。每分钟酒吧规模:200嗯(A) < 0.05, * * P < 0.001, P < 0.01,平均值±S.D.

半胱胺扰乱了斑马鱼的先天和获得性免疫系统

利用在中性粒细胞中表达红色荧光蛋白的斑马鱼转基因系Tg(lyz:DsRed)检测半胱胺对斑马鱼固有免疫系统的毒性作用。鉴于幼鱼中性粒细胞主要存在于尾端造血组织(CHT)中，本研究重点关注该组织内的变化。结果显示，在72 hpf的半胱胺暴露后，处理组斑马鱼尾部中性粒细胞数量增加(图4a)。作为对这些观察结果的进一步证实，暴露于半胱胺的幼鱼尾部中性粒细胞用苏丹黑B染色，得到了类似的结果(图4a)，这意味着半胱胺暴露显著增加了斑马鱼幼鱼的中性粒细胞计数(图4a)，F)。获得了中性粒细胞红色染色的胚胎中巨噬细胞的背侧图像，随着半胱胺暴露的增加，巨噬细胞数量逐渐减少(图4 C, G)。利用具有荧光胸腺t细胞的转基因斑马鱼菌株Tg (Rag2:DsRed)研究了半胱胺对幼鱼获得性免疫系统的毒性。随着半胱胺浓度的增加，在144 hpf时观察到斑马鱼胸腺体积的减少(图4 D, H)。总之，半胱胺对斑马鱼幼鱼具有免疫毒性作用，并且毒性随着半胱胺浓度的增加而增强。

图4 暴露于不同浓度半胱胺的幼体斑马鱼的免疫细胞变化。(A)转基因斑马鱼(TelyzDsRed)和(B)全载苏丹黑黑染色的造血尾端组织中72 hpf的中性粒细胞数量。(C)中性红染色后背头72 hpf时的巨噬细胞计数。(D) Tg (Rag2:DsRed)转基因斑马鱼144 hpf时胸腺体积。(E) tgclr:DsRed转基因斑马鱼幼鱼中性粒细胞数量，(F)苏丹黑染色全载中性粒细胞数量，(G)中性红染色巨噬细胞计数，(H)转基因斑马鱼胸腺体积Te (Rog2-DsRed)。比例尺:200um (A-C)， 100um (D)，P< 0.05,P< 0.01,P< 0.001，平均值±S.D.

半胱胺过度激活氧化应激过程

通过ROS分布、SOD活性、MDA含量等指标检测半胱胺诱导的斑马鱼幼鱼肝毒性和免疫毒性中的氧化应激状态。与对照组相比，半胱胺处理组的ROS荧光强度显著增强(图5A, B)。半胱胺暴露导致sod1和sod2在转录水平下调(图5 C, D)。与对照组相比，SOD活性和MDA含量分别在0.36 mM和0.54 mM显著降低和升高(图5 E, F)。结果表明，半胱胺暴露导致氧化应激水平显著升高。

图5 暴露于半胱胺诱导的氧化应激。(A) ROS染色。(B) ROs荧光强度。(C) sod1相对mRNA水平。(D)相对mRNAsod2水平。(E) MDA含量。(F) SOD活性。比例尺:100 um (A). p< 0.05,p<0.01, p<0.001，平均值±S.D.

生物信息学分析

为了鉴定斑马鱼vnnl同源基因，我们使用Ensemble在线blast工具，以人类Vanin1蛋白作为参考序列，对斑马鱼基因组(GRCz11)进行比较。发现斑马鱼vnnl同源基因为双截获生物素酶(btd)，位于第19染色体上，位置信息为Chr 19:2002964-2004133和Chr 19:2001516-2001674。斑马鱼的btd基因含有3个外显子，编码520个氨基酸的蛋白。斑马鱼生物素酶蛋白与人类Vaninl和小鼠Vaninl蛋白具有高度的序列同源性(图S1 a)。此外，我们使用Mega的NJ分析构建了迄今为止克隆的几个物种的Vaninl氨基酸序列的系统发育树。斑马鱼的生物素酶与非洲爪蛙和果蝇的vnn1同源物相似，而与另一种骨鱼密西西比白鲟(Mississippi paddlefish)的距离较远，这可能表明它们在进化上并不相同(图s1b)。

半胱胺引起免疫信号和脂质代谢基因表达异常

从上述实验可以看出，半胱胺暴露在斑马鱼体内引起肝毒性和免疫毒性。采用qRT-PCR技术测量了半胱胺暴露对144hpf斑马鱼基因转录水平的影响。结果发现，参与免疫信号传导的关键基因出现上调。与对照组相比，治疗组的cxcl-clc、il-8和ifn-y的表达水平更高。特别是，与对照组相比，0.54 mM组il-8和ifn-y的表达增加了四倍以上。虽然tlr4在所有浓度药物治疗组中均有所增加，但低剂量组和中剂量组均未显示出显著差异(图6 a - d)。此外，72hpf时炎症因子转录物表达水平的总体趋势与144hpf时相关。半胱胺暴露导致斑马鱼在72hpf时炎症因子表达上调(图6 E-H)。

此外，半胱胺暴露也影响了斑马鱼脂质代谢相关基因的表达。在144 hpf下，暴露于0.36和0.36的幼鱼体内，甾醇调节元件结合蛋白1 (srebf1)、甾醇调节元件结合蛋白2 (srebf2)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶A (hmgcra)和脂肪酸合成酶(fasn)的转录物水平显著升高0.54 mM半胱胺与对照相比，而三磷酸腺苷结合转运蛋白1a (abcala)和三磷酸腺苷结合转运蛋白1b (abcalb)显著下调(图6 I-N)。三磷酸腺苷结合转运蛋白la (abcala)和三磷酸腺苷结合转运蛋白1b (abcalb)的表达水平显著下调(图6 E-J)。这些基因参与脂肪形成、脂肪积累和胆固醇代谢。生物素酶(btd)表达增加，过氧化物酶体增殖物激活受体y (ppary)表达降低(图6 O-P)。

图6 暴露于不同浓度铬胺的斑马鱼幼鱼相对mRNA水平。(A-D) 144 hpf时炎症因子:ifn-y。tlr4。Il-8和cxcl-clc。(E-H) 72 hpf时的炎症因子:ifn-y、tir4、il-8和cxcl-clc。(I-N) 144 hpf时脂质代谢因子:srebfl、srebf2、hmgcra和fasn。(O-P)144 hpr时泛酸代谢因子:p0.05, P0.01,P<0.001，平均值S.D.

Wnt信号参与半胱氨酸诱导的肝脏和免疫发育缺陷

为了探究半胱胺是否影响Wnt信号传导，我们首先评估了Wnt信号传导相关基因的转录水平。半胱胺暴露后，Wnt信号转导靶点axin2和lef1以及Wnt信号转导关键基因ctnnbl通过定量聚合酶链反应出现显著上调(图7 H-J)，表明半胱胺激活了Wnt信号转导。下一步，我们在斑马鱼胚胎中通过IWR-1抑制Wnt信号。IWR-1显著缓解了半胱胺引起的肝脏和免疫发育缺陷(图7 A-E)，上调了ppar-y的表达，但没有显著改变btd的表达(图7 F, G)。

图7 Wnt信号在眼胺诱导的肝脏发育不良中的作用。(A)在144 hpf下，0.2 pM TWR-暴露于0.54和0.54 mM半胱胺的斑马鱼幼鱼的亮场图像。(B)在144 hpf下暴露于0.54和0.54 mM半胱胺和0.2微米IWR-1的Te (fabp10: DsRed)斑马鱼的左肝面积。(C)在144 hpf下，暴露于0.54和0.54 mM半胱胺和0.2 μ m IWR-1条件下的Telyz:DsRed斑马鱼造血尾端组织中中性粒细胞数量。定量分析(D) Tg(fabp10: DsRed)斑马鱼的肝脏面积和(E) Tg(lyz:DsRed)斑马鱼的中性粒细胞数量。显微镜下成像的斑马鱼暴露于Tg(twhh: GFP)幼鱼1.05 mM evsteamine和1.05 mM evsteamine与60微米丙戊酸钠在72 hpf下。(F-G)暴露于0.54和0.54的斑马鱼的相对pparty和btd mRNA水平0.54 mM半胱胺，在144 hpf下0.2 uM IWR-1。(H-J)暴露于不同浓度半胱胺的斑马鱼幼鱼Wnt信号mRNA的相对水平。比例尺:200 um (A)， 100 um (B-C)，P<0.05,P<0.01， *P<0.001，平均值±S.D.

聚类分析

通过分层聚类分析对斑马鱼肝脏和免疫系统指标及相关基因表达进行归一化和分类后，得到了一个清晰的、有区别的排序(图8)。可视化结果形象地概括了半胱胺暴露在斑马鱼中引起的显著差异。具体来说，与对照组相比，TC、油红o染色区域以及fasn、ifny和cxcl-clc的表达水平显著升高。

图8 分层聚类分析揭示了半胱胺暴露对斑马鱼脂质代谢、免疫系统和相关基因表达的影响。

我们进一步分析了在四个簇中表达的顶级标记基因，发现一些基因主要特异性地表达在其中一个簇中，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(图3B, S3)。功能富集分析显示，上述4个细胞簇中表达的很多基因具有毛细胞相关的生物学功能(图3C-F)，这表明这些细胞是毛细胞。为了进一步确认毛细胞的聚类和注释，我们进行了全载原位杂交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛细胞中表达，根据我们的分析，嵴毛细胞被认为位于簇12(图3H)，这与之前的研究[21]一致。至于簇0和7的细胞，虽然都是神经肥大毛细胞，但它们之间存在差异。根据成熟和年轻毛细胞标志物s100s[22]和prox1a[23]在两个簇中的表达情况，簇0的细胞被归类为成熟神经肥大毛细胞，簇7被归类为年轻神经肥大毛细胞(图S4)。

另一方面，我们分析了支持细胞的标记基因klf17[24]，发现它主要表达在簇1的细胞中(图S5)，这表明这一簇细胞是支持细胞。同样，我们还分析了据报道在套细胞中表达的基因，如tnfsf10、ponzr6、pkhd1l1、fat1b、crb3b、cts12、ovgp1和cldne[17]，发现高水平表达这些基因的细胞聚集在簇9中(图S6)。然而，它们表达了一些已被证明在毛细胞中特异性表达的基因，如myo6b[25]、myo7aa[26](图S7)，这提出了它们是可以分化为毛细胞的支持细胞的可能性。因此，我们得出结论，来自簇1和9的细胞分别是支持细胞和套细胞，来自簇14的细胞可能是毛细胞祖细胞。

讨论

半胱胺与半胱胺二硫的氧化还原反应是半胱胺双相效应的基础。通过使用低浓度的半胱胺，半胱氨酸被转运到细胞中，在细胞中进一步转化为谷胱甘肽。谷胱甘肽的抗氧化特性在调节细胞氧化还原稳态中起着关键作用。尽管如此，高浓度的半胱胺与过渡金属结合会产生过氧化氢分子，从而导致氧化应激。因此，剂量选择很重要，以避免半胱胺治疗各种疾病的任何并发症。人类血液中的半胱胺水平通常低于检测阈值(<0.1 μM)。重酒石酸半胱胺在15mg /kg时产生的峰值血浆浓度为给药1小时后0.03-0.07 mM 。其他研究报道了与高剂量半胱胺治疗相关的罕见副作用(>90 mg/kg/day (1.95 g/m2/day))，包括骨痛、肌痛和肘部瘀伤(皮肤活检中反应性血管内皮质骨质疏松)。回顾性队列研究130例患者接受0.55%(约48 mM)盐酸半胱胺滴眼液治疗45个月后，报告了47个非严重不良反应(一般为一过性刺激、刺痛、或视物模糊)和4起严重不良事件(包括角膜炎和角膜溃疡)。本研究中半胱胺的暴露浓度比人类治疗性暴露低几个数量级，0.18 mM及以上的半胱胺剂量会导致斑马鱼幼鱼的肝毒性，其特征是炎症反应和脂质代谢异常。虽然现有的证据并不能证实半胱胺暴露的相对剂量强度，由于之前没有半胱胺与斑马鱼肝脏的相关报道，但基于以上事实，我们认为至少本实验中使用的0.54 mM是斑马鱼的高暴露剂量。仍有必要探索与斑马鱼试验中使用的浓度有关的人类相关性。

在本研究中，我们培养了荧光蛋白标记的肝细胞和炎症细胞转基因斑马鱼系，以便在体内直接观察肝损伤和炎症反应。结果表明，在发育早期暴露于半胱胺会导致斑马鱼幼鱼肝脏异常增大，肝中性粒细胞增加，肝脏脂肪沉积，转氨酶增加，脂质代谢因子和炎症因子破坏，表现出与人类相似的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)样病变。

脂肪沉积在肝脏和饱和游离脂肪酸的积累是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的标志。肝细胞受到这些脂肪沉积的毒性影响，导致疾病进展。由于脂肪毒性，肝脏可能受损并引发炎症反应，导致非酒精性脂肪性肝炎和纤维化。然而，在目前的研究中，在肝脏发育开始之前的半胱胺暴露导致免疫系统改变，其特征是中性粒细胞增多和72 hpf时斑马鱼炎症因子表达升高。炎症反应也可能影响发育中的肝脏脂质代谢过程，两者可能在NAFLD中相互促进。仅就本研究而言，炎症似乎是肝脏脂质代谢异常的起始因素，需要进一步的实验来阐明两者之间的关系。

大多数生理过程和疾病都涉及氧化应激。在本研究中，我们发现半胱胺的剂量依赖性分布会增加斑马鱼体内的活性氧种类。半胱胺处理后氧化产物MDA含量的增加与这些结果一致。至于转录和翻译水平上SOD的降低，可能是氧化应激过度激活后的代偿性变化。综上所述，本研究发现，半胱胺暴露后，氧化应激的上调是斑马鱼的一个显著病理特征。

有趣的是，半胱胺曾被用作抗氧化剂用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一项多中心、安慰剂对照、双盲试验中，包括169名活检证实为NASH的儿童(8-17岁)，尽管ALT和肝叶炎症有显著改善，但未能达到主要结局指标(NAFLD活动评分降低2分或更多，肝纤维化未恶化)。与上述研究结果相反，我们发现半胱胺反而导致总甘油三酯和总胆固醇升高、肝脂肪变性，并显著增加srebfl、srebf2、hmgra和fasn(参与脂肪形成和脂质积累的基因)的转录水平，而abcala和abcalb(与胆固醇转运相关的基因)的表达水平在早期发育的幼鱼中显著下调，表现出非酒精性脂肪肝样病变。这与前面提到的半胱胺的双相作用有关，但也提示除了抗氧化剂之外，半胱胺还有其他靶点的可能性。

Vanin是辅酶a向半胱胺代谢的关键酶循环，也参与炎症和脂质代谢的调节。出乎意料的是，我们没有在NCBI、ZFIN、UNIPROT和ENSEMBL等数据库中检索到斑马鱼pantetheinase或vanin (vnn)对应的基因或蛋白质的存在。通过与斑马鱼蛋白数据库的比对，我们鉴定出了生物酶前体(pre-btd)，它们与钒蛋白属于同一水解酶超家族。在人类中，这两种蛋白质都分解线性酰胺中的碳氮键，而不是肽键。据推测，斑马鱼btd在泛茶氨酸的分解代谢中起着类似于缬氨酸的酶的作用。在本研究中，我们发现半胱胺暴露导致斑马鱼幼鱼btd mRNA水平上调。

vnnl基因在肝脏、肾脏和内分泌腺等代谢活性较高的组织中高度表达。从分子上看，vanin在肝脏的脂质代谢和牛磺酸合成中起着重要作用。此外，在炎症性银屑病皮肤的免疫组化中观察到，触发氧化应激或炎症应激的药物可促进vnn3的表达。与野生型(WT)小鼠相比，vnn1基因敲除小鼠对氧化应激暴露的抵抗力更强。这种抗性可以通过给药半胺(半胱胺的氧化形式)来消除，可能是由于抑制了通过蛋白质二硫键交换合成谷胱甘肽所需的y-谷氨酰半胱氨酸合成酶。有人认为，vnnl可能会促进炎症。另一项研究发现，vnn1(-/-)小鼠对急性(NSAID给药)和慢性(血吸虫感染)诱导治疗均产生较低的炎症反应。因此，vnnl对于先天免疫细胞感知压力的能力至关重要。另一方面，肝细胞表达vaninl蛋白，尤其是靠近中央静脉的区域性小叶中心肝细胞。几种NAFLD小鼠模型显示Vnn1 mRNA表达升高。脂质代谢可能直接受到泛酸酶活性的影响。正如其他研究表明的那样，vnn1在肝细胞脂质之前上调在小鼠和人肝癌Huh-7细胞中均有vnn1的聚集，提示vnn1的激活可能是疾病的始动因素。

这些结果表明vnn与脂质代谢和炎症密切相关。而半胱胺又是如何影响btd (vnn的替代物)的表达，进而导致炎症上调和脂质代谢紊乱的呢?从现有的结果来看，我们假设，由于辅酶a -泛酸-半胱胺是一种循环代谢状态，外源性半胱胺导致辅酶a合成增加，进而诱导泛酸增加和btd表达水平升高，并导致下游分子的一系列改变，包括促炎因子增强以及肝脏脂肪生成过度活跃。

此外，过氧化物酶体增殖体激活受体y (ppary)和传统的Wnt/ b -连环蛋白轴经常相互对立;一个增加，另一个被抑制，反之亦然。这两种成分之间的相互作用似乎在炎症、氧化应激和癌症中非常常见。也证实了缬氨酸对肠上皮细胞中pparty mRNA表达的直接影响。特别是，PPARy可以抑制由活性蛋白1(AP1)、κ B核因子(NF-xB)和转录信号转导和激活因子1(STAT1)介导的脂多糖诱导的转录效应。至于Wnt信号传导与vanin之间的关系，目前尚未见文献报道。在本研究中，Wnt信号抑制剂IWR-1对btd的表达没有显著影响。上述结果初步提示，半胱胺可引起btd上调。随后，它诱导pany下调，然后通过激活Wnt信号通路引起肝脏炎症和脂质代谢紊乱。

结论

综上所述，本研究表明，半胱胺可诱导斑马鱼幼鱼的炎症反应和脂质代谢，导致肝脏损伤。并且首次发现，这些病理变化可能是由btd(一种分子起始事件)共同介导的，btd可能在斑马鱼体内充当vanin同工酶，与半胱胺在泛酸降解过程中产生相互反馈调节。进一步说，氧化应激的激活和Wnt信号的上调可能也参与了这一过程。儿童服用半胱胺时，应合理控制剂量，警惕其潜在的炎症反应和肝毒性。

基金：中国科学技术部(2021 VEA1101300和2020YFA0112500);国家自然科学基金中国(82070920)。

本文章原文：https://doi.org/10.1016/j.tox.2023.153555

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