杂志：International Journal of Molecular Sciences

影响因子：5.6（2022）

年份：2017

通讯作者：Kun-Yun Yeh , Guor Mour Her

摘要

miR-27b已成为胆固醇和脂质代谢的调节枢纽，并成为治疗动脉粥样硬化和肥胖的潜在治疗靶点。然而，miR-27b对体内脂质水平的影响仍有待确定。斑马鱼的脂质通常以三酰基甘油（TGs）的形式储存，它们的主要储存部位是内脏、肌肉内和皮下的脂质库，而不是血管和肝脏。在本研究中，我们应用microRNA-海绵（miR-SP）技术，生成表达转基因miR-27b-SP（C27bSPs）的斑马鱼，该基因破坏内源性miR-27b活性，诱导血管内脂质积累（高脂血症）和非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的早期发病。C27bSPs幼鱼和幼鱼的血管和肝脏中油性红O染色明显增加，表明miR-27b消耗在功能上促进了脂质积累。C27bsp也显示出脂肪垫的增加，这是由于脂肪细胞增生。分子分析显示，miR-27b的缺失增加了与脂肪生成和内质网（ER）相关的基因的表达。此外，miR-27b-SP增加了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBP-α和固醇调节元件结合转录因子1c（SREBP-1c）的表达，并有助于脂肪生成和脂肪生成。结论：我们的研究结果表明，miR-27b-SP通过直接增加多种成脂/成脂转录因子的表达，从而导致脂肪生成和脂肪生成的增加。在本研究中，miR-27b的表达改善了C27bSP的脂质代谢，提示miR-27b是调节斑马鱼早期高脂血症和脂肪形成的重要脂肪生成因子。

关键词：microRNA海绵、脂肪细胞发生、脂肪形成、肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝。

前言

除了经典的转录监管机构，microRNAs（miRs）已被证明参与几乎所有代谢稳态过程，包括脂肪细胞发生，脂肪生成和葡萄糖刺激胰岛素分泌，以影响参与非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发病机制的代谢途径。最近的研究表明，miRs能够调节参与脂质稳态的关键基因的表达，包括miR-122、miR-33、miR-106、miR-758、miR-26、miR-370、miR-378、let-7、miR-27、miR-143、miR-34a和miR-335。一些miRs已被证明可以调节脂质代谢相关基因，这可能参与了NAFLD的发病机制。因此，某些miRs可能参与了代谢性疾病的发病机制。Karbiener等人证实在人脂肪来源的干细胞（hMADS）细胞的脂肪形成过程中，miR-27b水平下降，miR-27b的过表达抑制了在脂肪形成和后期甘油三酯积累的早期开始阶段PPAR-γ和CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBP-α）的表达。PPAR-γ在其30 UTR中有一个高度保守的预测结合位点，并被证实为miR-27b的直接靶点。Kang等人发现，miR-27是一种抗成脂的microRNA，部分原因是通过靶向抑制素（PHB）和损害线粒体功能。Kang等在研究中发现，在诱导hMADS成脂后，miR-27a和miR-27b的水平均下调，而miR-27a或miR-27b的过表达抑制了PHB的表达和脂肪细胞分化。此外，Kong等人证实，miR-27b在糖皮质激素（GC）诱导的中心脂肪积累的发病机制中起着核心作用。过表达miR-27b抑制了棕色脂肪的分化和原代脂肪细胞的能量消耗。相反，抑制miR-27b的功能会下调棕色脂肪组织中特定基因的表达。此外，Vickers等人在硅、体外和体内提供了证据，表明miR-27b是脂质代谢调节枢纽的一个强有力的候选者。他们证明，肝脏miR-27b对脂质水平有反应，并调节关键代谢基因的表达（mRNA和蛋白），包括血管生成素样3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸酰基转移酶1（GPAM），这些基因此前与脂质相关疾病的病理生物学有关。尽管有这些观察结果，但迄今为止，还没有关于miR-27b对体内脂质代谢的影响的报道。

许多研究已经证明了斑马鱼和人类的脂质代谢之间的同源性。事实上，斑马鱼最近已经成为研究NAFLD的重要模式生物。我们之前的研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白、强定蛋白、阴阳1（YY1）和大麻素受体1（CB1R）通过增加成年斑马鱼脂肪生成基因表达的转录活性来诱导肝脂肪变性的发展。分子分析显示，过表达锚定蛋白诱导肝脏脂肪变性，并调节四种肝脏microrna，miR-16、miR-27b、miR-122和miR-126的表达谱。在本研究中，我们报道了YY1通过下调C/EBP同源蛋白10（CHOP-10）与肝脏脂质积累的关系，该蛋白抑制了斑马鱼幼鱼和成鱼脂肪生成程序中PPAR-γ和C/EBP-α的表达。

本研究旨在探讨miR-27b缺失对斑马鱼幼鱼和成鱼脂质代谢的影响。我们生成了microRNA-海绵（miR-SP）转基因斑马鱼（C27bSP），以分析miR-27b消耗对脂质稳态的影响。在本研究中，我们描述了miR-27b在27bSP和野生型斑马鱼的脂质代谢中的作用。我们确定了miR-27b缺失对斑马鱼脂肪生成和脂肪生成通路调控的影响。过度抑制miR-27b的表达与高脂血症、NAFLD（或NASH）和肥胖表型相关。这项工作的结果首次揭示了miR-27b可以调节与斑马鱼脂肪代谢紊乱相关的分子病理信号通路。

结果

成熟的miR-27b序列在许多物种中都是完全保守的，在5’端有一个相同的种子序列（图1A）。为了研究内源性miR-27b在斑马鱼中的功能，我们设计了一种含有10个miR-27b结合位点的miR-27b海绵，以及4个与miRNA核苷酸9-12不匹配的核苷酸间隔物，以阻断miR-27b的抑制活性(图1B)。为了评估海绵结构在体内和体外的抑制活性，我们评估了海绵产物对miR-27b的隔离是否会破坏miRNA-27b与靶mRNA 3’UTR内的靶位点的结合。因此，我们使用荧光素酶报告基因pb-Act-eGFP-mir-27b-TS和一个载体进行了eGFP报告基因分析，其中eGFP 的3’UTR mRNA包含miR-27b的完美靶序列。

我们检测了miR-27b簇海绵元件（miR-27b-SP）的表达，以评估其在体内发挥作用以降低miR-27b表达的能力。在体内和体外都进行了eGFP报告基因检测，以确认miR-27b-SP和miR-27b靶向序列（miR-27b-TS）的直接相互作用。在体外实验中，与对照GFP (TS-mut或SP-mut)相比，miR-27b-SP过表达以一致的方式挽救了miR-27b-TS的GFP强度降低(图1C)。相应地，体内实验表明，与对照组相比，miR-Act-EGFP-miR-27b-TS/miR-27b共表达降低的eGFP荧光强度可以以miR-27b-27b剂量依赖的方式挽救（图1D）。综上所述，这些数据表明，miR-27b-SP可以特异性抑制miR-27b的表达，并通过消除miR-27b的表达来隔离miR-27b在其靶基因上的活性。

图1 miR-27b-海绵（miR27b-SP）的设计和验证。（A）序列比对表明成熟miR-27b在许多物种中都是完全保守的，包括树栖蜥蜴（aca-miR-27b）、田鼠（cgr-miR-27b）、家山羊（chi-miR-27b）、斑马鱼（dre-miR-27b）、红原鸡（gga-miR-27b）、人（hsa-miR-27b）、灰色短尾负鼠（mdo-miR-27b）、恒河猴（mml-miR-27b）、小鼠（mmu-miR-27b）、鸭嘴兽（oan-miR-27b）、眼镜蛇（oha-miR-27b）、七鳃鳗（pma-miR-27b）、大鼠（rno-miR-27b）、大西洋鲑鱼（ssa-miR-27b)、野猪（ssc-miR-27b）和中国树鼩（tch-miR-27b)。（B）将pri-miR-27b和miR27b-SP转化为b-Act表达载体。premiR-27b茎环结构显示，其中成熟的miR-27b用红色突出显示。(C)采用体外EGFP报告基因分析来确认miR-27b与靶序列之间的直接相互作用。用b-Act-miR-27b质粒转染ZFL、ZEM2S和SOB-15细胞，并测定EGFP强度。* p < 0.01，和** p < 0.005。(D)采用体内EGFP报告基因分析，证实了miR-27b在受精后6天内的miR-27b与目标序列之间的直接相互作用。

转基因C27bSPs（bC27bSP1、2和hC27bSP1、2）斑马鱼品系的生成

为了在斑马鱼中产生稳定的mcherry融合miR-27b-SP表达，我们使用pb-Act-mCherry-miR-27b-SP和LF2.8-mCherry-miR-27b-SP构建物来产生传递生殖系的转基因斑马鱼株系C27bSPs（图2A）。通过pb-Act-mCherry-miR-27b-SP构建，生成了斑马鱼转基因株系bC27bSPs（Tg（-2.5β-Act：mCherry-miR-27b-SP）），其中miR-27b的表达被全局消除（图2B，面板1,2）。利用LF2.8-mCherry-miR-27b-SP构建，我们生成了斑马鱼转基因株系hC27bSPs（Tg（-2.8fabp10a：mCherry-miR-27b-SP）），其中miR-27b在肝脏中被特异性消除（图2B，面板3,4）。

我们采用茎环RT-PCR方法检测成熟miR-27b在bC27bsp和hC27bsp中的表达水平。根据miR-27b的表达，选择2个bC27bSP（bC27bSP1和bC27bSP2）和2个hC27bSP（hC27bSP1和hC27bSP2）转基因株系（图2C）。与野生型对照相比，miR-27b在hC27bSP1和hC27bSP2细胞系的肝脏中分别显著下调了15.4倍和7.8倍。此外，我们还证明，与野生型（WT）相比，肝脏过表达miR-27b-SP并没有改变hC27bsp中其他组织中内源性成熟miR-27b的水平（图2C）。在bC27bSP1和bC27bSP2细胞系的肝脏中，肝脏成熟的miR-27b分别减少了近3.8倍和2.9倍。然而，与WT相比，bC27bSPs中其他组织的成熟miR-27b水平显著降低（图2C）。结果表明，miR-27b-SP能够阻断体内miR-27b的表达。

图2 miR27b-SP转基因斑马鱼产生。(A)将pri-miR-27b和miR27b-SP克隆到LF2.8或b-Act表达载体中。(B)miR27b-SP在bC27bSP1全身表达的红色荧光图像（面板1,9 dpf，40×放大，比例尺200µm；面板2，受精后4个月（mpf），40×放大，比例尺100 mm）和hC27bSP1肝脏（3,9 dpf；4,4 mpf，40×放大，比例尺：100 mm）。(C)对bC7asp（bC27bSP1、2）和hC7asp（hC27bSP1、2）、肝脏、心脏、肠道、大脑、眼睛、脂肪和肌肉组织成熟miR-27b的茎环RT-qPCR分析。每组均为n=5-8。* p < 0.01，和** p < 0.005。

抑制内源性miR-27b可增加体内和血管内脂质积累

为了检测hC27bSPs、bC27bSPs和WT幼鱼之间的中性脂质，我们对受精后10d（dpf）幼鱼进行了油红O染色（图3）。在WT幼鱼中没有检测到油红O信号（图3A、A’、A’’），尽管它确实对膀胱进行了非特异性染色（图3A’）。hC27bSPs的幼鱼仅在肝脏中表现出强烈的染色（图3B、B’、C、C’）。饲喂高脂饮食（HFD）的bC27bSPs幼鱼在肝脏（图3D’、E’）、大脑和心脏（图3D’、E’）中均有中度染色，在血管系统中也有额外的染色，包括后主脉、背主动脉和节段间血管（图3D’’、E’’）。

重要的是，hC27bSPs中的体内和血管内脂质积累（78−86%）和肝脏脂质积累（77−81%）的发生率要高得多，而WT幼鱼中肝脏脂质积累仅为1.4−5.3%，血管内脂质积累为4.4%（图3F）。这些数据表明，miR-27b的消耗可诱导斑马鱼幼鱼的体内和血管内脂质积累。

图3 通过Oil Red O（ORO）染色，miR27b-SP对hC27bsp和bC7aSPs肝脏和血管内脂质的影响。（A-E）用高脂饲料（HFD）喂养的代表性幼鱼的全贴装ORO染色的侧视图（40×放大，比例尺：200µm）。躯干和后部的放大显示在面板0和00（110×放大，比例尺：100µm）。(F)通过ORO染色计算hC27bSPs和bC27bSPs幼鱼中脂肪变性和血管内脂质的百分比。ORO染色重复进行三次，平均每组60-80只幼鱼。星号表示差异有统计学意义；* p < 0.01，** p < 0.005。缩写：e、眼、背主动脉、视网膜，背纵向吻合血管、心脏、肠、节段间血管、PCV，后主静脉，膀胱，卵黄囊。

miR-27b缺失增加了C27bsp中与脂肪生成相关的基因的表达

由于miR-27b缺失可诱导斑马鱼的内营养和血管内脂质积累和肝脂肪变性，我们接下来研究了miR-27b缺失对脂肪生成和未折叠蛋白反应（UPR）靶基因表达的影响。和对照组相比脂肪酸（FA）膜转运体的mRNA水平显著上调，包括脂肪酸转运蛋白（FATPs），如slc25a10和slc35b4，脂肪酸结合蛋白（FABPs）如bC27bSPs和hC27bSPs中的FABP6和脂肪酸转位酶FAT/CD36（图4A)。脂质存储基因的mRNA水平升高，包括ACAT-2、LDL受体LDLR和LPIN1（图4B）。许多参与肝脏脂肪生成的基因受到甾醇调节元件结合转录因子1c（SREBP-1c）的转录调控，包括过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）和CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBP-α），它们被发现上调（图4C）。参与脂肪酸合成的关键脂肪生成酶的mRNA水平显著升高，包括乙酰辅酶a羧化酶1（ACC1）、脂肪酸合酶（FAS）、A酰基辅酶A合酶（ACS）、酰基辅酶a：酰基转移酶1-酰基甘油-sn-3-磷酸酰基转移酶（AGAPT）、磷脂酸磷酸酶（PAP）和二酰基甘油O-酰基转移酶2（DGAT2）（图4D）。与对照组（WT和WT-liver）相比，所有标记物在bC27Ϡ和hC27Ϡ的肝脏中均显著且高上调。这些结果表明，bC27bsp和hC27bsp中的脂质积累是脂质生物发生相关基因上调的结果。

图4 对bC27bSPs幼鱼和hC27bSPs幼鱼肝脏中选定的成脂基因的RT-qPCR分析。C27bSPs中脂质转运(A)脂质储存(B)、脂肪生成因子(C)和脂肪生成酶(D)基因的相对mRNA表达量与野生型鱼的基因表达量相比较。qRT-PCR进行三次重复。用每组平均4个月雄雌鱼的cDNA对所选基因进行表达分析。数值与β-actin进行归一化处理。星号表示差异有统计学意义；与对照组相比，* p < 0 .01，** p < 0.005水平。

hC27bSP成鱼发展为NAFLD并最终发展为NASH

我们怀疑C27bSPs幼鱼（<60 dpf）在早期出现NAFLD表型。与预期的一样，饲喂低脂饮食（LFD）的C27bSPs幼鱼（21 dpf）出现了明显的肝脏脂肪变性，而饲喂相同饮食的WT幼鱼没有出现脂质沉积（图5A，面板1−5）。组织学分析显示，WT中均匀的肝窦和肝细胞显示完好的细胞质和明显的细胞核（图5A，图6），幼年C27bsp的肝脏切片显示肝细胞质中有不同程度的空泡化（图5A，图7−10）。宏观上看，WT成年肝脏在受精后4.5个月（mpf）颜色正常、柔软和乐观（图5A，面板11），而大约80%的4.5 mpf C27bsp鱼显示黄色和油腻的肝脏，这是典型的斑马鱼脂肪肝（图5A，面板12−15）。Oil Red O染色进一步证实了脂肪肝结果，结果显示，与成年WT相比，成年c27bps的肝组织中有囊泡状脂肪变性和大量脂滴（图5A，图17−20）（图5A，图16）。此外，我们还观察到肝脂质（与WT相比，hC27bSP1、hC27bSP2、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分别为5.8-、4.9-、3.2-和2.8倍）和胆固醇与WT相比，hC27bSP1、hC27bSP2、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分别为3.1-、2.6-、2.1-和1.8倍）显著增加（图5B)。然而，与hC27bsp和WT相比，bC27bsp的血脂和胆固醇水平仅稍微升高（图5B）。

在成年hC27bsp（年龄大于10 mpf）中，肝细胞内的慢性脂质积累进一步引发了肝细胞损伤和肝应激，这与之前观察到的NASH样表型一致（图5C，面板3−6），并与WT进行了比较（图5C，面板1、2）。我们发现，氧化应激显著增加了hC27bSPs和bC27bSPs中肝脏MDA和过氧化氢的释放；然而，在喂食LFD的WT肝脏中没有或更少观察到氧化应激的影响（图5D），表明miR-27b消耗可以显著增强斑马鱼肝脏的氧化应激。此外，对hC27bSP2 NASH肝脏的分子分析显示，参与NASH发育的基因表达上调。与预期的一样，与WT相比，hC27bSPs成鱼炎症基因il-1b、il-6、tnf-α、ifn-γ、nfkb2和nf-kb的表达增加（图5E）。此外，hC7aSPs成鱼还表现出内质网（ER）应激标志物atf6、ern2、ire1、prek、hspa5和ddit3的上调（图5E）。这些结果表明，hC27bsp成人发生了NAFLD和NASH，这是由于肝脏中脂肪的积累，并伴随着随后的炎症和内质网应激通路的激活。

图5 在hC27bsp和bC27bsp成人中观察到NAFLD和NASH表型。(A)不同喂养量和脂质含量下C27bSPs幼鱼的肝脏组织学变化。用低脂饲料（LFD）喂养的C27bSPs幼鱼肝脏中WT（图1）、hC7aSPs（图2和3）和bC7aSPs（图4和5）的ORO染色。110倍放大，比例尺：100µm。用LFD喂养WT（图6）、hC7aSPs（图7和图8）和bC7aSPs（图9和图10）的斑马鱼幼鱼肝脏的组织学变化，400×放大，比例尺：10µm。4个月大的WT（11）、hC7aSP（12和13）和bC7aSP（14和15）成人肝脏的代表性大体解剖。40×的放大倍数，比例尺：50毫米。通过成年WT（16）、hC7aSP（17和18）和bC7aSP（19和20）的oro染色切片证实了脂质积累。400×的放大倍数，比例尺：25µm。(B)11个月大的hC27bsp和bC27bsp成人的脂质含量（肝脏和血清甘油三酯和胆固醇）的比较。（每组n=4-6）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(C)11个月大的WT(1)、hC27bSP1(3)和hC27bSP2(5)肝脏的代表性大体解剖图像。40×的放大倍数，比例尺：50毫米。对11个月大的WT(2)、hC7aSP1(4)和hC7aSP2(6)肝脏进行H&E染色，显示与WT相比，hC27bSPs诱导肝脏应激和损伤。400×的放大倍数，比例尺：50µm。将肝脏线粒体中MDA和过氧化氢的(D)水平与hC27、WT成人bC27和过氧化氢水平进行比较。(E)内质网（ER）应激标志物atf6、ern2、ire1、prek、hspa5、grp78和ddit3（上升）和炎症基因il-1b、il-6、tnf-α、ifn-γ、nfkb2和NF-kB的表达增加（下降）。qrt-pcr一式3份。用每组平均4个月雄雌鱼的cDNA对所选基因进行表达分析。数值与β-actin进行归一化处理。星号表示具有统计学意义。与对照组相比，* p < 0 .01，** p < 0.005水平。

miR-27b缺失可诱导斑马鱼早期发生脂肪细胞增生

为了评估miR-27b在斑马鱼早期脂肪形成中的重要性，我们分析了同一阶段饲喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼鱼（图6A，B）。与野生型相比，在幼鱼发育过程中，bc27bsp7鱼体重和长度均显著增加（图6C，D）。此外，我们还比较了在24 dpf时油红o染色的内脏脂肪细胞的大小。我们检测到，与野生型斑马鱼相比，bC27bSPs中内脏脂肪细胞的质量增加了（图6E），而含有内脏脂肪细胞增生的斑马鱼幼鱼的百分比也增加了（图6F）。因此，miR-27b缺失导致斑马鱼幼鱼内脏脂肪细胞增生，暗示miR-27b表达对斑马鱼胚胎后生长和幼鱼脂肪细胞形成的影响。

图6 miR-27b缺失导致bC27bSPs幼鱼生长和脂肪细胞形成的增强。(A)bC7aSPs和WT幼鱼的代表性图像，喂养HFD和(B)喂养LFD，40×放大，比例尺：200µm。(C)饲喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼鱼的平均体重（每组n=为40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(D)饲喂LFD或HFD的bC27bsp和WT幼鱼的平均体长（每组n=为40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(E)与WT对照组相比，在24 dpf时，bC27bSPs中的oro染色的内脏脂肪细胞。内脏脂肪细胞被圈起来。110×的放大倍数，比例尺：200µm。(F)含有内脏脂肪细胞增生的bC27bsp和WT幼鱼的百分比（每组n=40-50）。* p < 0.01，和** p < 0.005。

成年bC27bsp体积大，白色脂肪组织质量增加

为了确定miR-27b缺失是否可能在脂肪组织中具有功能相关性，我们检测了成年bC27bsp白色脂肪组织（WAT）表型，发现它们对肥胖或超重有肥大反应。在四个月的时间里，我们发现bC27bsp对被喂食HFD有显著的尖锐反应。与生长曲线一致，bC27bSPs成鱼的体重在5个月内显著增加（图7A）。比喂食HFD的bC27bSP1成鱼丰满且更大（图7B）。从大体观察(图7C，左)、内脏大小(图7C，中)和脂肪库外植体(图7C，右)可以看出，饮食引起的体重增加伴随着脂肪积累的显著增加。此外，我们还研究了miR-27b-SP是否能调节伴随脂肪形成的bC27bsp的WAT中的肥大。肥大的WAT伴随着成脂转录因子的表达增加，包括PPAR-γ、C/EBP-α和SREBP-1c（图7D）。这些结果表明，miR-27b的缺失通过上调参与脂肪形成的成脂转录因子，加速了斑马鱼的脂肪细胞分化。

图7 miR-27b消耗诱导成人bC7aSPs的体重增加和脂肪质量增加。(A) bC27bSPs、hC27bSPs和WT用HFD喂养210天。每月监测每只斑马鱼的连续体重（n=20-25）。* p < 0.01，和** p < 0.005。(B)男性和女性bC27bSP1和WT喂养HFD 5个月的代表性图像。(C) miR-27b消耗导致更大的腹部脂肪（左），更大的内脏器官（中）和腹部脂肪垫大小的增加（右）。脂肪组织被圈起来。40×放大，比例尺：25mm(D)，WT和bC27bSP1腹部脂肪中成脂基因和蛋白的表达。PPAR-γ、C/EBP-β和SREBP-25pxRNA（左，qRT-PCR）和蛋白质（右，免疫印迹）。* p < 0.01，和** p < 0.05。

讨论

microRNA miR-27b参与了许多代谢过程，这些代谢过程与多种疾病有关，包括脂质代谢、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和2型糖尿病。尽管其重要，但很少有功能验证的相关代谢模型，也缺乏体内研究。在本研究中，我们发现miR-27b在斑马鱼的脂肪细胞发生和脂肪生成中均具有负调控因子。我们报道了一个新的发现，即miR-27b缺失导致内营养和血管内脂质积累和高脂血症，以及几种脂肪生成标志物基因的表达增加。在斑马鱼。最近的报道已经确定miR-27b是脂质代谢的调节枢纽，并有许多证实。Vickers等人预测miR-27b是脂质代谢的调节枢纽。他们证明，肝脏miR-27b对脂质水平敏感，并调节两个关键代谢基因的表达，血管生成素样3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸酰基转移酶1（GPAM），这两个基因之前已经涉及到血脂异常病理。此外，我们还发现C27bSPs中的脂质积累是由于参与FFA合成途径的基因上调，导致后来的发病率伴随不同水平的肝脂肪变性。我们的研究结果表明，miR-27b在体内表达的脂质代谢途径平行，而在哺乳动物和斑马鱼中，miR-27b介导的调控的脂质代谢具有很强的相似性。

为了更清楚地定义内源性miR-27b在肝脏反应中的生理作用，我们建立了一个肝脏特异性的miR-27b-SP转基因斑马鱼模型，hC27bSPs。值得注意的是，hC27bSPs在幼鱼期发生生理NAFLD，在成鱼期发生NASH。我们的研究结果与最近的一项研究一致，表明抑制miR-27b可以恢复大鼠肝星状细胞（HSCs）中的细胞质脂滴。Vickers等人报道，miR-27b被特异性发现参与肝脏中的脂质代谢，并发现与正常小鼠肝脏相比，miR-27b在HFD肝脏中显著增加。他们将miR-27b模拟物或抑制剂（antagomiRs）引入人肝细胞（Huh7细胞）。miR-27b模拟物的过表达导致4个脂肪生成基因PPAR- γ、ANGPTL3、N-去乙酰化酶/磺基转移酶1（NDST1）和GPAM的表达显著增加，而内源性miR-27b的抑制显著上调了相同的4个基因。Vacaru等人，证明斑马鱼肝脂肪变性与UPR激活的标志物相关，而强大的UPR诱导脂肪变性。此外，一种miR-27a/b抑制剂显著增加了促炎因子产生，如IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α。相反，用miR-27a/b模拟物处理细胞后，炎症反应降低。相应地，我们提供了证据，表明肝脏中miR-27b的消耗导致了肝脏脂肪变性和脂肪变性，甚至脂肪性肝炎的发展，这对炎症反应和内质网应激有进一步的联合作用。

一些miRNAs，包括miR-27，已经参与了加速或抑制前脂肪细胞分化的过程。最近，来自三个研究小组的研究结果表明，miR-27b是脂肪细胞分化的负调控因子。Zou等报道，柿子单宁在脂肪形成早期通过调控PPAR-γ、C/EBP-α和miR-27来抑制3T3-L1细胞的脂肪细胞分化。Karbiener等人发现，miR-27b在hMADS细胞中的抗成脂作用是由于抑制了PPAR-γ所致。Kang等人证实，miR-27a和b通过靶向PHB和损害hMADS细胞中的线粒体生物发生和功能来抑制脂肪形成。研究表明，miR-27b消耗对HFD诱导的脂肪细胞增生敏感，这至少部分解释了bC27bSPs的体重增加或肥胖，表明bC27bSPs可作为早发性体重增加的模型。bC27bsp在幼鱼期生长迅速（10−21dpf），导致幼鱼期体重和长度增加。体重增加可能是早期生命脂质积累引起的生长“超前”的结果，可能与脂质代谢损伤和能量消耗不足状态有关，从而影响斑马鱼胚胎后的生长。

根据外观和脂肪库的检查，与对照组相比，幼鱼bC27bSPs的脂肪量略有增加，而bC27bSPs的年轻成鱼的脂肪量显著增加。这种效应在成人中显著增加的事实表明，bC27bsp对与年龄相关的体重增加很敏感。此外，我们的研究结果表明，bC27bsp中脂肪质量的增加是由细胞数量的增加（脂肪细胞的增生）引起的。相应地，miR-27抑制脂肪细胞分化，这与肥胖的发生密切相关。miR-27b在大鼠、小鼠和人类细胞模型中作为脂肪形成的负调控因子。Chan等人报道，人参皂苷-Rb1可以下调miR-27b的活性，进而促进PPAR-γ的表达和脂肪的形成。然而，miR-27b已被发现能促进脂肪的形成。Kong等人发现，miR-27b是Prdm16的中心上游调控因子，可以控制WAT的褐变。白色脂肪的“布朗宁”已经成为目前持续对抗肥胖的焦点。因此，靶向miR-27b可能会促进由WAT转化为棕色脂肪组织（BAT）介导的能量消耗，并有可能预防肥胖。虽然成年斑马鱼的脂肪组织已被描述，其生理和形态与哺乳动物相似已被证实为，但对斑马鱼BAT的发育知之甚少。我们的体内观察表明，在bC27bSP1的脂肪细胞终末分化过程中，miR-27b缺失通过诱导PPAR-γ、C/EBP-α和SREBP-1c而导致脂肪细胞增生。我们的结果表明，bC27bSPs中脂肪体积的增加是由于脂肪生成的增加。我们假设miR-27b可能比燃料代谢更介调节脂肪积累，通过能量消耗抑制脂肪组织。这一发现强调了miR-27b功能等值对斑马鱼脂肪组织的潜在重要性，这也被证明与斑马鱼的一般发育和大小密切相关。

总之，我们的研究结果表明，miR-27b的慢性消耗会导致总脂质含量的增加，从而导致斑马鱼中高脂血症和NAFLD表型的早期发病。miR-27b的慢性消耗会导致脂肪形成增加，进而导致脂肪形成（斑马鱼的脂肪细胞增生）和斑马鱼体重增加。所提出的幼年C27bSP模型显示了病理状态的改变，如肝脂肪变性，更多的是，脂肪性肝炎和高脂血症。具有传染性nash样和肥胖表型（不同水平的严重肝脂肪变性和脂肪质量）的老年C27bsp是研究人类代谢性疾病的理想模型，如高甘油三酯血症、肥胖和糖尿病。

原文网址：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29286302/

注：因文章篇幅有限，所有相关引用文献，以及补充图、表可以点击至原文查阅。