关于脂肪肝（Fatty Liver Disease）
脂肪肝（FLD）是目前已知肝硬化的主要病因，并可导致动脉粥样硬化和代谢综合征的发生。在欧美等发达国家，脂肪肝发病率高达20%，我国脂肪肝发病率超过15%，并呈女性化及低龄化趋势。资料显示，重度肥胖会导致脂肪肝的发生。超过60%的肥胖患者同时伴有肝细胞脂肪变性，25%伴有肝纤维化变性，最终导致肝硬化及原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，HCC）。HCC是脂肪肝晚期最严重的并发症，死亡率较高。如脂肪肝在早期及时发现，去除病灶及早干预，可有效控制病情发展，达到治愈。
当肝细胞内的脂质蓄积超过肝湿重的5%，或组织学上肝细胞脂肪变面积达到单位面积1/3以上时，称为脂肪肝。脂肪肝是一种常见病理症状，也是一种可逆性病变，由多种原因相互作用导致肝脏内蓄积脂类物质（主要是甘油三酯）过多，引起机体代谢平衡失调。脂肪肝是仅次于病毒性肝炎的第二大类肝病，为隐蔽性肝硬化的主要病因。酒精性脂肪肝（AFLD）是由于长期大量饮酒导致的，除酒精之外因素引起的脂肪肝统称为非酒精性脂肪肝（NAFLD），包括肥胖性脂肪肝、快速减肥性脂肪肝、营养不良性脂肪肝、糖尿病脂肪肝、药物性脂肪肝、妊娠脂肪肝、其他疾病引起的脂肪肝。
目前，许多研究利用啮齿动物模型来探讨FLD的发病机制、诊断和治疗。最常见的模型是喂食高脂肪饮食(HFD)的小鼠，用于揭示NAFLD在生理、代谢、组织学、转录组学和信号通路方面的变化。然而，啮齿动物模型存在育种成本高、繁殖能力低、实验程序复杂等缺点。
图1 人类和斑马鱼的肝脏形态和NAFLD进展
斑马鱼是一种优秀的模型动物，经常用于发育和药物研究，具有饲养和维护成本低、后代数量多、体外发育快、胚胎和幼鱼的光学透明性等优点，便于对体内器官和生物过程进行无创可视化。此外，斑马鱼的碳水化合物和脂质代谢高度保守，肝脏的发育可以通过荧光报告线观察到，其组织结构和功能与哺乳动物相似。在斑马鱼中已经发现了大多数主要类型肝细胞的哺乳动物对应体，巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞的浸润与人类肝脏疾病的发生发展密切相关。与哺乳动物相似，斑马鱼也会出现脂肪变性的表型，逐渐发展为NASH，最终导致肝细胞癌(HCC)。这些特征使斑马鱼成为一种新兴的模型系统，有助于脂肪肝的病理研究和治疗评估。
斑马鱼脂肪肝模型
非酒精性脂肪肝
研究表明，斑马鱼的脂质代谢过程和NAFLD的发生机制与人类相似，肝脏代谢紊乱会引起人类和斑马鱼的脂肪肝，比如高脂肪或高糖的饮食、禁食、毒素暴露、蛋氨酸消耗和遗传因素。在极少数情况下，先天性代谢紊乱和其他遗传病也可引起脂肪肝。最重要的是人类和斑马鱼FLD模型具有许多相似的特征，包括肝细胞的增大和膨胀、甘油三酯的积累、激活未折叠蛋白反应（UPR）的分泌通路功能障碍以及活性氧（ROS）的增加等。此外，氧化应激和脂肪因子超载可促进炎症反应，加重肝细胞损伤、血管改变和纤维化。截止到目前，研究者利用转基因、化学诱导和饮食诱导等方法建立的斑马鱼NAFLD模型被应用于临床研究和药物评价中，而且斑马鱼在脂质代谢研究方面的潜力得到了积极的报道。
图2 斑马鱼NAFLD的病理机制及主要模型
饮食诱导模型：斑马鱼摄入的脂质被肝脏分泌的胆汁乳化，并被肠道吸收，这与人类的过程相似。目前有几种饮食NAFLD模型，包括斑马鱼高脂饮食(HFD)、高胆固醇饮食(HCD)、果糖饮食(FD)，以及过度喂养模型和饥饿诱导模型。
饲喂含有13%-16%大豆油的饲料后，斑马鱼血浆TG水平和肝脏组织脂质积累显著增加。另一种常用的HFD含有8%棕榈酸(PA)，一种饱和脂肪酸，在斑马鱼中引起肥胖、高脂血症和高血糖表型，并促进炎症相关因子如肿瘤坏死因子α (tnfa)和白细胞介素1β (il1b)的表达。同样，细胞死亡相关基因DNA断裂因子亚基α (dffa)、纤维化相关基因胶原蛋白、I型、α 1a (col1a1a)和脂质代谢相关基因CD36分子(CD36)、低密度脂蛋白受体(ldlr)和脂蛋白脂肪酶(lpl)的表达水平显著升高。诱导氧化应激和线粒体损伤最终导致肝脏脂肪变性和器官损伤加重。
HCD模型的优点是可以在2-3周内诱导NAFLD从脂肪肝到NASH的全面过程。以TC水平、TG水平和尼罗红染色作为脂质代谢指标，通过检测全身ROS、MDA、SOD水平来判断氧化应激程度。油红O染色和H&E染色检测肝脏脂肪变性程度是NAFLD药物筛选最直接的指标。高胆固醇水平也可能影响斑马鱼的葡萄糖转运和胰岛素敏感性，为NAFLD中糖脂代谢的研究提供了良好的模型。
HFD联合HCD模型显示斑马鱼的脂肪变性更为严重，内质网应激和脂解分子(atf6、hspa5、hsp90b1、pparab、cpt1a和acox3)的表达水平显著上调，22表明这些混合饮食在较短的时间内导致脂质代谢紊乱和内质网功能障碍，从而有助于肝脏脂肪变性的研究和药物筛选，具有较好的可靠性和实用价值。
流行病学研究表明，使用果糖作为食品添加剂与肥胖和NAFLD患病率有关。与此一致的是，短时间摄入果糖会导致炎症和脂肪生成基因(如cidec和lipin1)以及脂肪生成转录因子srebf1的激活。该模型表现出脂肪性肝炎的特征，包括线粒体异常和内质网缺陷，这表明果糖导致斑马鱼幼鱼肝脏脂肪变性。因此，FD模型可以作为NAFLD炎症途径和氧化应激的研究工具。
过度喂食模型也被广泛使用，它是通过给斑马鱼喂食更多的食物或更频繁的食物来实现的。在过度喂食模型中，斑马鱼被喂食正常饮食摄入量的六倍，以模拟高热量的摄入。脂质生成和糖代谢相关基因如lipin1、srebf1和irs2a mRNA表达降低，过量饲喂饲料对斑马鱼氨基酸代谢和自噬激活有较大影响。NAFLD的过度喂养模型还显示出与核糖体生物发生、嘧啶代谢、脂肪酸代谢、α -亚麻酸代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路的显著相关性。相比之下，在耗尽蛋黄供应的营养后5-10天禁食斑马鱼幼虫，通过促进肝外脂肪酸摄取和新生脂肪生成，有助于肝脏脂肪变性，从而建立饥饿诱导的NAFLD模型。
化学诱导模型：目前，化学诱导的斑马鱼NAFLD模型主要是通过肝毒性药物或氧化剂如tunicamycin、valinomycin等抗生素治疗而产生的。这些处理引起肝细胞蛋白异常折叠和内质网应激反应，激活肝星状细胞(HSCs)和分泌细胞外基质蛋白，进一步引起肝脂肪变性。
硫乙酰胺具有急性肝毒性。它可以被氧化并产生自由基，导致肝细胞变性和坏死。经硫乙酰胺处理后，斑马鱼肝脏组织出现脂滴聚集和脂肪变性，并伴有细胞凋亡。因此，该模型可应用于与氧化应激诱导相关的NAFLD研究。
突变模型：通过正向遗传筛选或反向遗传方法已鉴定出许多突变株，它们表现出与NAFLD相似的肝脏表型，可用于相关分子机制的研究。
foigr突变体中的突变基因trappc11编码转运蛋白复合物的一个亚基，该亚基在膜运输、外源生物代谢和内质网应激中发挥重要作用。foigr突变斑马鱼(trappc11hi1532bTg)表现出肝脏肥大表型和蛋白n-糖基化减少，这是由于脂联寡糖(LLO)合成受到抑制，导致未折叠蛋白反应(UPR)和内质网分泌蛋白的积累，从而诱导脂肪肝的形成。
cdipt是合成磷脂酰肌醇(PtdIns)的关键基因，PtdIns是磷脂酰肌醇(PIs)的主要来源，磷脂酰肌醇是钙稳态和蛋白质分泌的重要调节因子。cdipt缺陷斑马鱼(cdipthi559Tg)表现出与NAFLD相似的病理肝脏结构，包括肝脏肿大、脂质积累和肝细胞变性、氧化应激增加和内质网破坏。
dtp突变体(ahcyp14nb)被鉴定为具有s-腺苷型同型半胱氨酸水解酶(ahcy)基因中保守残基的突变。ahcy活性降低会增加s-腺苷型同型半胱氨酸(SAH)水平，导致脂质摄取增强以及对Tnfα的炎症反应。此外，突变引发线粒体功能障碍和肝脏脂肪变性。
slc16a6a编码一种酮体转运蛋白，研究表明，高蛋白低碳水化合物生酮饮食可导致斑马鱼rmn突变体(slc16a6as951)发生大规模肝脏脂肪变性，并伴有肝组织中总脂、TG和游离脂肪酸(FFAs)的显著增加，而血脂、血糖和肝脏胆固醇水平无变化。
转基因模型：转基因技术被广泛应用于将外源靶基因整合到动物基因组中，从而使新的生物学性状在后代中稳定地遗传和产生。这些转基因斑马鱼也可以进行荧光标记，可用于深入研究特定基因的功能、细胞迁移和分化以及NAFLD等疾病的发病机制。
大麻素受体1 (Cb1r)在转基因品系Tg(-2.8fabp10a: tetooff-Cb1r-2a- egfp)two23的肝脏条件表达促进肝脏脂质积累和脂肪变性，在食物摄入、体重增加和与肥胖相关的一些病理特征中起关键作用。此外，Cb1r的过表达激活了脂肪生成转录因子甾醇调节元件结合蛋白1c (Srebp-1c)及其靶酶乙酰辅酶a羧化酶1 (Acc1)和脂肪酸合成酶(Fas)以及从头脂肪酸合成。
转基因系Tg(-2.8fabp10a:GFP-Yy1)two16肝脏中普遍存在的转录因子阴阳1 (Yy1)过表达，通过抑制CCAAT增强子结合蛋白-α同源蛋白10 (Chop-10)的表达水平，促进Tg在肝脏中的积累，从而促进肝脏氧化应激和肝损伤。
转基因系Tg(lfabp:dnFgfr1-EGFP)zf421在斑马鱼肝细胞中表达显性阴性成纤维细胞生长因子受体1 (Fgfr1)。组织学分析表明，这种基因干预导致斑马鱼幼体肝脏发育缺陷。3月龄时，肝细胞出现空泡变性，并进一步发展为肝脂肪变性和胆汁淤积。
激活转录因子4 (Atf4)参与多种代谢疾病的调节。转基因系Tg(−-2.5actb1:Tetoff-Atf4-2A-mCherry)zf2124在缺乏多西环素(Dox)的情况下选择性表达Atf4，从而上调参与脂质生物合成和UPR激活的多个基因，从而影响斑马鱼幼鱼细胞内和血管内脂质积累和肝脏脂肪变性。此外，用HFD饲喂转基因鱼可诱导NASH样病理改变的形成。
图3 斑马鱼NAFLD模型的应用
斑马鱼模型有助于NAFLD研究揭示特定基因和途径在NAFLD进展中的作用，评估药物和外源性化学物质的肝毒性，以及鉴定新的治疗NAFLD的化合物。
酒精性脂肪肝
长期饮酒是世界范围内慢性肝病的主要原因，酒精对肝脏的急性影响尤其令人担忧。近年来，斑马鱼幼鱼已成为一种新的酒精性肝病脊椎动物模型。
有研究报道了一种直接诱导斑马鱼急性乙醇性肝损伤的方法。具体来说，就是将肝脏发育后的幼鱼暴露于乙醇中，其肝细胞中乙醇脱氢酶和细胞色P450（CYP）家族成员的表达水平就发生显著改变。在最初的12h内，乙醇能够诱导斑马鱼出现肝肿大等表型，而且这些效应会随着时间的推移而逐步加剧。如果在24h内去除乙醇，这些效应是可逆的，但是随着暴露时间的延长，这些效应会加剧，甚至导致星形细胞的激活。此外，每一次斑马鱼成鱼交配产生的胚胎数目足够保证在每个实验中可以同时控制多个变量，如乙醇浓度和暴露时间。不仅如此，斑马鱼幼鱼实验可以重复多次，展现出较强统计功能和详细实验设计的优势。因此，目前最有效的研究主要集中在幼鱼对乙醇的急性效应上。然而，由于年龄的显著差异，幼鱼的实验结果可能不能准确地概括人类酗酒的状况。因此，研究者逐步开始将斑马鱼成鱼作为研究酒精肝的模式生物。
近期研究者发现，低浓度乙醇（0. 2%）处理成年斑马鱼4周能够引起脂肪变性和肝细胞膨胀，促进血清丙氨酸氨基转移酶活性、血糖和三酰甘油显著升高。此外，结果表明发现参与糖脂代谢、线粒体生物发生和功能、氧化应激和内质网应激的基因表达水平显著上调。总之，在低剂量慢性酒精暴露下，成年斑马鱼很好地再现了ALD患者的病理、代谢和应激反应状态。因此，低剂量慢性乙醇处理足以引起酒精诱导的成年斑马鱼肝脂肪变性和损伤。成年斑马鱼ALD模型可以作为研究人类慢性肝病的替代动物模型。
近些年，基于斑马鱼模型进行的FLD的机制研究也取得了极大进展。甘油三酯积累是急性和慢性酒精滥用中最常见的特征之一。与NAFLD相同，脂肪生成增加、脂质降解减少和脂蛋白输出失败是酒精性脂肪变性的主要机制。平均而言，乙醇暴露处理24h能够引起60%以上斑马鱼发生脂肪变性。该实验结果是由甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）转录因子介导的脂肪生成所引起的，在某种程度上和老鼠的体内实验结果具有极大的相似性。而且使用突变的斑马鱼阻断甾醇反应元件结合蛋白的激活，能够阻止乙醇诱导的脂肪变性。在这些研究中，即使没有脂肪堆积，也会发生肝细胞功能障碍。
众所周知，ROS能够参与ALD发展过程中的每一个方面，而且还和肝细胞蛋白、细胞膜和DNA的氧化密切相关，因此二者被认为是引起ALD患者肝细胞功能障碍的主要原因。体内稳定的ROS水平能够限制饥饿介导的脂肪变性，相反，CYP介导的乙醇代谢能够产生较高水平的ROS，进而会导致线粒体功能紊乱，从而降低脂质氧化，导致脂肪变性。在斑马鱼中，乙醇引起的肝脏损伤常常伴有氧化应激损伤。与大鼠相似，阻断乙醇代谢或服用抗氧化剂可减少斑马鱼的脂肪变性，改善肝脏功能。因此，氧化应激是乙醇引起肝脏损伤的一个保守方面。虽然抗氧化剂对ALD或酒精性肝炎患者的作用不大，但斑马鱼可以为筛选治疗方案或联合治疗提供一个平台，以改善ALD患者的预后。
在酒精患者中，血清蛋白缺乏在一定程度上能够反映肝细胞分泌受损情况。UPR激活（通常与ER应激互换使用）可能是ALD分泌通路功能障碍的先兆。研究发现NAFLD斑马鱼体内的UPR标记物有较强的上调，而肝细胞分泌标记物却有显著下降，说明乙醇处理能够引起斑马鱼的肝脏分泌通路功能发生紊乱。在斑马鱼的遗传学研究中，aft6是乙醇诱导脂肪变性的充分必要条件，UPR活化可以引起乙醇诱导的肝脏疾病。这些发现表明atf6是酒精诱导FLD的重要中介物质。有趣的是，转录组分析发现乙醇诱导的UPR-ome与atf6过表达诱导的基因几乎完全重叠。因此，atf6可能作为一种机制，感知和介导肝细胞蛋白分泌对酒精的反应，这有望能够将ALD与FLD的其他病因区分来。IMRAN M等最近的研究使用斑马鱼幼鱼来测试膜重塑对肝脏毒性的影响，结果表明将肥胖斑马鱼幼鱼同时暴露于苯并芘和乙醇能够通过膜重塑诱导斑马鱼肝脏毒性。
以上谈到的研究结果都有助于促使科学家开发出一种治疗脂肪肝疾病及其相关危险因素的方法。FLD的治疗策略主要集中在肝脏脂质调节和抗氧化方面。目前，斑马鱼NAFLD模型已经被广泛的用于中药中具有显著NAFLD治疗活性的化合物的筛选和评价。
斑马鱼脂肪肝模型评价指标
肝脏面积（油红O染色，Image测量大小）；
肝脏变性程度（油红O染色，Image测量灰度值）；
卵黄囊吸收延迟的发生率（卵黄囊是脂肪，卵黄囊吸收与肝功能密切相关）；
肝脏病理切片（HE染色）；
脂质代谢相关基因表达（qRCR）；
甘油三酯（TG）含量、总胆固醇(TC)含量、游离胆固醇（FC）含量、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量、谷草转氨酶（AST）含量、谷丙转氨酶（ALT）含量（ELISA）。
近年来，一些新的技术被应用于斑马鱼FLD的研究。基于三维建模和拉曼光谱的肝脏ROS水平定量分析可以定量评估组织化学成分随疾病进展的时空变化。此外，新开发的体外高含量成像分析系统已被应用于识别鱼体轮廓，自动计数转基因标记的炎症细胞，以验证靶基因的改变或药物治疗是否能有效减轻炎症负担。此外，斑马鱼幼鱼的适应性免疫系统发育较晚，更有利于FLD中先天免疫信号的研究。斑马鱼具有高度保守的先天免疫途径，并通过病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)和损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)发挥先天免疫应答。特别是，由于斑马鱼幼鱼的透明性，追踪免疫细胞的特定标记(巨噬细胞、中性粒细胞等)变得更加容易，从而可以深入研究免疫相关的脂肪肝疾病。鉴于这些发现，我们预计随着新兴技术的发展和高通量、高含量筛选方法的革命，斑马鱼将进一步促进FLD的研究。
总的来说，斑马鱼越来越被认为是肝病研究中一个有价值的新模型，它是体外细胞评价模型和体内啮齿动物模型系统的补充。对斑马鱼肝脏疾病模型的描述将为疾病发病机制相关的分子事件和细胞机制提供新的见解。通过斑马鱼进行高通量的基因筛选和化学筛选，有望为识别新的治疗靶点提供巨大的机会。
木芮生物具有完善的斑马鱼实验平台，并建立起了上百种的临床疾病模型，利用遗传、行为、细胞、生化分子等实验技术，深入探索疾病发生的机制，进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或药物筛选机制。我们依托成熟的科研技术，可以为广大客户提供基础科研、毒理测试、药物筛选等服务，助力生物医学领域发展。
参考文献
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