关于骨质疏松症（osteoporosis）
骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由于多种原因引起的骨量丢失与降低、骨组织微结构破坏、骨脆性增加、骨密度（BMD）下降从而导致患者易出现骨折的全身代谢性骨病。患者最常见的临床表现为腰背疼痛或全身骨痛，通常在姿势改变时及长时间行走后出现，夜间或负重活动时疼痛加重，有可能出现行动受限，疼痛多为弥散性。其他临床表现为骨折、脊柱变形等，严重者可能压迫心肺，出现循环、呼吸系统的功能异常，且长时间会对患者造成巨大心理负担。一些早期的OP患者没有症状或只有疼痛，往往会被人忽视，等到病情加重时常常已经发展到了较为严重的阶段，所以OP又被称为“寂静的疾病”。目前OP的发病机制以及治疗方法需要进一步研究，建立骨质疏松模型是进行发病机制及治疗药物研究的必要条件，根据研究需要，应尽可能选择与人类相似度高、重复性好、经济有效的模型。
骨质疏松症可分为原发性、继发性和特发性三大类。不同类型的骨质疏松有不同的病因，是多种因素共同作用的结果。骨骼发育涉及多种关键的生物学途径或信号转导通路，全基因组关联研究报道了60多个影响BMD的位点，证实了BMD基因的多态性。OP涉及到其中多种关键的生物学途径，如Wnt信号通路、维生素D内分泌途径、雌激素内分泌途径、核因子κB受体活化因子-核因子κB受体活化因子配体-骨保护素（RANK-RNAKLOPG）途径等。
斑马鱼作为现今常用模式生物，在骨骼疾病研究中，以独特的结构与生理提供了灵活高效的动物模型。在骨骼发育层面，斑马鱼的骨生成方式与其他哺乳动物一样，均为软骨内骨化和膜内骨化。在胚胎期斑马鱼体内，颅骨和咽弓软骨为软骨内骨化，脊柱与鳞片为膜内骨化。在细胞水平上，斑马鱼的成骨细胞和破骨细胞与哺乳动物高度相似，且成年斑马鱼具有与人类长骨一样的分层结构。在基因层面，HoweK等通过基因测序发现，与人类相比，斑马鱼的基因相似性高达87％，且在蛋白序列、功能方面均具有高度的保守性。在分子层面，参与人类成骨的BMP和Wnt信号通路均被证实存在于斑马鱼中参与斑马鱼骨骼发育的关键基因Runx-2也被证实与哺乳动物也具有高度同源性。可见，斑马鱼作为OP模型具有成熟的理论基础与实验依据。
斑马鱼骨质疏松模型
斑马鱼的两种形态——胚胎鱼与成年鱼阶段各有完全不同的可研究之处，研究者称之为“一体两面”的动物模型。
与哺乳动物一样，斑马鱼存在两种不同类型的骨生成方式: 从软骨支架骨化( 软骨内骨化) 或直接从间充质干细胞前体骨化( 膜内骨化) 。在胚胎期斑马鱼体内，典型的软骨内骨化的部位包括颅骨和咽弓软骨，典型的膜内骨化包括脊椎与鳞片。在细胞水平上，斑马鱼的成骨细胞和破骨细胞与哺乳动物高度相似。因此，胚胎斑马鱼用于研究骨骼系统的发育与药物高通量筛选有着巨大优势。
图1 斑马鱼早期发育期间颅骨区域的骨化元素
然而，由于缺乏成熟的骨骼，骨组织的代谢、修复和重建无法使用胚胎斑马鱼进行。成年斑马鱼骨属性与人类相似，提示可能成为用于研究人类骨骼疾病的模型，研究者进行了不断探索，目前已复制出数个成年鱼骨病如骨质疏松，用于分析病理生理机制和设计新的治疗方案。因此，成年斑马鱼模型是一个研究骨代谢和骨转换重要的模型。
图2 斑马鱼骨矿化可视化和量化实例
药物诱导模型
常用的斑马鱼骨质疏松模型的建立方法都是将斑马鱼培养在适宜浓度造模药物的生活环境中，处理一段周期后，使斑马鱼的骨密度发生改变。目前研究斑马鱼骨骼模型的最常用方法是通过经典骨骼染色并在荧光显微镜下进行观察
常用的化学染料有茜素红 ( alizarin red ) 和钙黄绿素( calcein) 等。茜素红染色为固定染色，通过与骨中的钙结节引起的显色现象来检测鱼的骨形态和BMD，毒性强具有特异性，用于斑马鱼硬骨染色，但实验前期步骤较多，耗时较长。钙黄绿素染色为活体染色，与骨骼中的钙化离子结合，在荧光的照射下发出绿色荧光来显示骨骼钙化程度，荧光信号强、毒性弱、染色时间短，但无特异性，可以实时观测胚胎骨所有时期的发育，需要注意染色过程要避光且要将染色液清洗干净，防止对荧光信号产生影响。活体荧光染色主要研究斑马鱼幼鱼的骨骼钙化及成鱼尾鳍的再生等，而影像学技术也被用于斑马鱼骨骼的观察，如 X 线检测、显微 CT 等，能够更精准的评价骨的质量，更适用骨质疏松症的早期检测。
图3 斑马鱼骨质疏松模型药物造模的建立方法
转基因及突变模型
虽然目前OP的模型很少，但有各种斑马鱼突变系可以准确地模拟人类骨骼发育不良，包括胶原病和成骨不全的形式，其特征是骨骼脆性和频繁的低冲击骨折。在许多骨骼发育不良的情况下，斑马鱼不仅可以模拟人类的状况，而且可以从机理上洞察基因变化如何导致细胞变化，从而支持疾病症状。因此，斑马鱼为新的骨质疏松基因位点的功能研究提供了令人兴奋的前景。
图4 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对斑马鱼进行快速高效的诱变
图5 斑马鱼突变体、转基因插入突变体和显示骨骼矿化改变的变形体
斑马鱼模型在骨再生与修复的应用
以尾鳍为代表的成年斑马鱼部分组织在截肢或受伤后拥有再生的能力。尾鳍由基底部骨骼、放射状鳞质鳍条( 骨组织) 、软组织和血管组成。尾鳍的基底部骨骼为软骨内骨化，切除后不能再生。放射状鳞质鳍条不含细胞，为膜内骨化，可实现完全再生，因此被用于研究成熟骨组织的修复和再生能力。由于鳍和鳞片是半透明的，很容易成像，因此可以使用标准荧光显微镜详细观察细胞及其钙化基质。在切除鳍(通常是尾鳍)后，伤口愈合反应导致表形胚的形成，该胚能以可控的方式再生被切除器官的所有受影响组织，包括骨。在这种炎症反应之后，成骨细胞经历去分化和增殖以形成胚基。这些幼年成骨细胞分泌介于软骨和骨之间的基质，然后由成熟的成骨细胞和招募的破骨细胞重塑为成熟的骨。这些鳍也可以通过低温损伤，将-196°C的刀垂直放置在尾鳍射线上，以便研究骨吸收反应。这些技术为比较成人的骨形成和骨重塑提供了很好的视角。此外，通过使用糖皮质激素泼尼松龙处理再生鳍，证明了鳍再生试验用于检测生物活性化合物的有效性。
OP的一个主要问题是由于骨结构较弱导致骨折风险增加，因此需要确定能够改善骨折愈合的治疗方法。斑马鱼表现出骨折愈合反应，包括骨痂形成，与哺乳动物有很强的相似性。斑马鱼的鳍可以通过简单的外部压力诱发骨折。由于鱼鳍约有300条骨射线，单个鱼鳍可诱发多处骨折。骨折后2天形成骨痂并开始新生骨形成，同时runx2和sp7/osx等成骨细胞基因表达增加。由于鳍是平的，因此可以使用转基因细胞系或用AR和钙黄蛋白标记骨形成在细胞分辨率下动态跟踪骨折修复过程。此外，还可以在再生组织中添加药理学制剂，从而测试潜在的骨合成代谢化合物在体内骨折修复中的有益作用。
图6 鳍再生和骨折试验，可视化和量化活骨形成和修复
此外，斑马鱼的身体覆盖着由钙化的真皮骨组成的弹性样鳞片，由于该鳞片含有生物活性的成骨细胞和破骨细胞，包括神经和血管内皮细胞，因此它们的使用为在成熟环境下研究骨细胞行为提供了机会，并作为骨骼化合物的主要药理筛选工具提供了巨大的潜力。
图7 斑马鱼鳞片结构与骨细胞类型
图8 成骨细胞活性如何从鳞片上量化
斑马鱼骨质疏松模型评价指标
软骨发育（阿利辛蓝染色、转基因斑马鱼软骨荧光强度）；
成骨发育（茜素红染色、转基因斑马鱼成骨荧光强度）；
破骨发育（TRAP染色）；
qRT-PCR(acp5a、bglap、ctsk、mmp9、rankl、runx2a、smad3a、sp7等骨发育相关基因表达）。
斑马鱼以其“一体两面”独特的结构与生理，为骨骼疾病的研究提供了一种全新的、高效而灵活的动物模型，经过数十年的不断研究，在分子、基因水平均得到了长足的进展，越来越成为人类骨骼疾病基因分析与治疗、药物开发研究方面的重要工具。
木芮生物具有完善的斑马鱼实验平台，并建立起了上百种的临床疾病模型，利用遗传、行为、细胞、生化分子等实验技术，深入探索疾病发生的机制，进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或药物筛选机制。我们依托成熟的科研技术，可以为广大客户提供基础科研、毒理测试、药物筛选等服务，助力生物医学领域发展。
参考文献
