斑马鱼中白内障相关晶状体蛋白变体的表达揭示了感知蛋白质的蛋白质稳态网络

标题：Expression of Cataract-linked-Crystallin Variants in Zebrafish Reveals a Proteostasis Network That Senses ProteinStability

期刊：JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 25387

原文链接：https://www.jbc.org/article/S0021-9258(20)34532-4/fulltext

摘要

晶状体的折射性和透明度取决于纤维细胞中晶体蛋白的稳定性与可溶性。人类和小鼠的多种晶状体晶体蛋白突变均与显性白内障相关。其中，与小鼠模型中显性白内障相关的B型和D型晶体蛋白突变体尤为受关注。尽管这些突变体在热力学上不稳定且易发生聚集，但体外实验发现它们与体内的分子伴侣-晶体蛋白的亲和力较弱。为深入探究白内障表型的形成机制，我们在斑马鱼晶状体中转基因表达了不同的D型晶体蛋白突变体，观察到一系列晶状体缺陷，这些缺陷主要由突变蛋白的聚集引发。与小鼠模型不同，斑马鱼中表型的严重程度与外显率和突变体的不稳定程度呈显著正相关。我们认为这一结果反映了存在一个能“感知”蛋白质稳定性的蛋白质稳态网络。在稳定性更差的突变体中，该网络的功能被过度消耗，导致表型外显率升高。过表达A型晶体蛋白对晶状体缺陷的外显率无显著影响，表明其分子伴侣的容量并未受限。尽管这一结果与“晶状体透明度需要分子伴侣网络参与”的主流假说相符，但我们的研究表明A型晶体蛋白可能无法有效抑制晶状体γ-晶体蛋白的聚集。此外，本研究还揭示了该蛋白质稳态网络中存在其他调控因子/作用因素，并证明斑马鱼可作为解析白内障发病机制的研究平台。

晶状体蛋白是一类水溶性蛋白质，在赋予眼晶状体光学特性方面发挥核心作用。晶状体的发育涉及上皮细胞的终末分化形成蛋白质合成与更新活性可忽略的纤维细胞。哺乳动物晶状体蛋白包含三类蛋白质，即α-晶状体蛋白、β-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白，它们共同构成晶状体纤维细胞总重量的90%。晶状体蛋白在纤维细胞中类玻璃化的短程有序排列对晶状体的透明度和屈光性至关重要。晶状体蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用使得蛋白质在与可见光波长相当的尺寸下呈现均匀分布。从这个角度来看，脊椎动物的晶状体是蛋白质进化的热力学奇迹。晶状体蛋白的异常稳定性及其经过精心调控的相互作用是进化而来的，目的是在人类寿命的漫长时期内，避免高浓度蛋白质溶液必然会出现的聚集和沉淀的热力学结局。

α-晶体蛋白是属于小分子热激蛋白超家族的分子伴侣。它们能够结合热力学不稳定的蛋白质，并隔离易聚集的蛋白质；而β-和γ-晶体蛋白则被视为结构蛋白，其在晶状体发育中的功能尚不明确。霍维茨在其开创性研究中提出假说，认为一旦晶状体蛋白越过不稳定的能量阈值，就会成为α-晶体蛋白的作用底物，α-晶体蛋白会将这些底物隔离，抑制其聚集，从而延缓光散射。研究人员已投入大量精力探究晶体蛋白的年龄相关修饰，并阐明其对晶体蛋白稳定性及聚集倾向的后续影响。有假说认为，当α-晶体蛋白的结合能力耗尽后，不稳定的晶状体蛋白会发生解折叠，进而引发年龄相关性白内障；不过，分子表面性质改变导致可溶性丧失，也是白内障形成的另一重要机制。

霍维茨的假说推动了一项范围广泛但成效显著的研究，旨在在体外环境中解析α-晶体蛋白分子伴侣活性的作用机制。在体外条件下，α-晶体蛋白可与热力学上失稳的蛋白质结合，同时还能隔离易发生聚集的蛋白质。这种结合过程可能涉及构象变化，从而暴露原本无法接触的结合位点。α-晶体蛋白的寡聚体可塑性是其结合能力与结合亲和力的关键所在。

尽管其功能已成功勾勒，但α-晶体蛋白的机械原理之间出现了分歧体外已证实α-晶体蛋白的分子伴侣活性，以及该活性在晶状体老化和白内障形成中的作用。尽管在机制研究中依赖模型底物具有合理性，但其结果是忽视了α-晶体蛋白与β-、γ-晶体蛋白相互作用的潜在特异性。这种认知偏差的一个尤其令人不安的例子是，现有模型无法解释α-晶体蛋白与γ-晶体蛋白不稳定突变体之间基于分子伴侣的弱相互作用，而这种相互作用会在小鼠模型中引发显性遗传性白内障。例如，在携带显性白内障的小鼠品系中发现了B-晶体蛋白突变体I4F和D-晶体蛋白突变体V76D。在详细分析中，米什拉等人以及莫罗和金证实，这些γ-晶体蛋白突变体的热力学稳定性有所降低。此外，它们会发生缓慢的聚集过程，这在晶状体纤维细胞等长寿细胞中具有重要意义。然而，在体外实验中，α-晶体蛋白的任一亚基都无法以高亲和力结合这些突变体，也无法阻止其聚集。这两项研究共同揭示了一类可逃避α-晶体蛋白检测的突变，这一发现与它们在小鼠体内诱发白内障的能力看似一致。

在本研究中，我们探究了两种热力学不稳定的γ-晶体蛋白突变体导致晶状体缺陷的体内机制。为更明确γ-晶体蛋白在晶状体发育中的作用，并解析其在体内的分子伴侣活性，我们启动了以斑马鱼为模型系统的研究。相较于小鼠模型，斑马鱼晶状体具有诸多优势与简化条件，包括转基因和基因敲除品系的构建成本更低、周期更快，以及胚胎群的规模更大，这一因素对本文报道的研究至关重要。在先前的研究中，我们证实了α-晶体蛋白在斑马鱼胚胎晶状体发育中发挥关键作用。通过大鼠α-晶体蛋白的转基因表达实现的部分挽救实验表明，该蛋白在晶状体发育中的功能具有保守性。本研究中，我们通过靶向且可控地表达β-晶体蛋白突变体，对斑马鱼晶状体的蛋白稳态网络进行干预。不出所料，我们发现表达不稳定且易聚集突变体的胚胎出现晶状体缺陷。与小鼠模型不同，我们观察到突变体的外显率和严重程度由以下因素决定——突变体的折叠稳定性。晶状体缺陷的机制似乎主要与突变体的聚集倾向相关，而其他典型的细胞功能障碍并未被显著检测到。我们将这些发现解读为揭示了一种分子伴侣网络的存在，该网络能够“感知”蛋白质的热力学稳定性和聚集倾向。与对不稳定的γ-晶状体蛋白突变体以及其他经过修饰的晶状体蛋白开展的体外研究结果一致——这些研究表明α-晶状体蛋白与这些易聚集的突变体蛋白相互作用并不强烈——晶状体中α-晶状体蛋白的缓冲能力并非限制性因素，这提示其他分子伴侣也对晶状体的蛋白质稳态发挥作用。

在心脏中。B，对比野生型（WT）与三种人CRYGD转基因（I4F、V76D和I4/F/V76D）胚胎出现晶状体缺陷的百分比。这些转基因在心脏中表达青色荧光蛋白（Cerulean）标记。图A为微分干涉相差（DIC）与青色荧光的叠加图像。图B中白色箭头标记青色荧光蛋白标记 图1 人CRYGD突变体的转基因表达在4天龄斑马鱼胚胎中诱导晶状体缺陷。A，晶状体特异性人CRYGD

结果

人源γD-晶体蛋白变体的转基因表达诱导斑马鱼胚胎晶状体缺陷——为评估与白内障相关的γD-晶体蛋白变体与晶状体分子伴侣在晶状体纤维细胞天然环境中的体内相互作用，我们构建了表达三种具有去稳定化作用的人源γD-晶体蛋白（Hsa.CRYGD）变体I4F、V76D和I4F/V76D的转基因斑马鱼品系。依据此前描述的转基因方法，在斑马鱼cryaa启动子的调控下，(gamma D)-晶体蛋白突变体仅在晶状体中表达。我们选择该启动子是为了使突变体的整体表达水平低于天然γ-晶体蛋白，因为蛋白聚集具有强烈的浓度依赖性。此外，所有转基因品系均表达由myl7启动子驱动的天蓝色荧光蛋白，作为转基因动物的便捷筛选标记（图1A，图b）。

(gamma D) -晶体蛋白变体的表达从受精后3天开始，在胚胎晶状体中引发了明显的异常（图1B），而胚胎的整体形态则完全未受影响（图1A，图a）。晶状体缺陷的特征与此前针对α-晶体蛋白敲除品系所描述的情况相似。表型特征表现为晶状体上分布着圆形、有光泽的类晶状小液滴，这类缺陷被归为“轻微”缺陷（图2A，图e）；也存在位于晶状体中央的大型不规则突起，被归为“严重”缺陷（图2A，图f，箭头；补充图S1中也有展示）。在所有表达(gamma D) -晶体蛋白变体的三个转基因品系中，后一类晶状体缺陷均导致光反射率高于野生型同窝个体（图2A，图a–c及图B；V76D变体未展示）。对表达I4F/V76D突变体的转基因斑马鱼（图2C，图b和(d))）在4天胚胎期（dpf）的视网膜进行甲苯胺蓝染色后的横切和矢状切片观察显示，与野生型（图2C，图a和c）相比，视网膜层状结构正常，进一步证实所观察到的缺陷定位于晶状体，且晶状体区域出现多个深色斑点或包涵体（图2C，图b和d，箭头指示），这些结构与胞质蛋白聚集体相似。

携带Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F)和Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F/V76D)的载体胚胎在受精后4天表现出不同程度的晶状体缺陷（图d-f，箭头所示），同时反射率也发生变化（图a-c）。B，对受精后4天野生型晶状体以及表达Hsa.CRYGD_I4F和Hsa.CRYGD_I4F/V76D的晶状体进行反射率分析，结果显示表达(gamma D)-晶状体蛋白变体的胚胎其晶状体比野生型晶状体散射更多光线（t检验；(p<0.001)）。C，与野生型同窝胚胎（图a和c）相比，经甲苯胺蓝染色的Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F/V76D)胚胎晶状体组织切片显示出明显的深色包涵体（图b和d）。图2 表达人CRYGD突变体的斑马鱼胚胎中的晶状体缺陷与反射率。

我们针对每个突变体筛选了大量胚胎，并根据表型的严重程度对其进行评分。晶状体缺陷的外显率与D-晶体蛋白的热力学稳定性降低之间存在显著相关性。塔林突变蛋白（图1B）。在携带D-晶状体蛋白I4F/V76D转基因的胚胎中，该突变体是三种突变体中最不稳定的，大多数胚胎（80%）表现出晶状体形态异常，且其中超过一半被归类为严重晶状体缺陷（图2A，图f）。在表达稳定性稍差的(gamma D)-晶状体蛋白突变体I4F和V76D的品系中，我们观察到出现晶状体缺陷的胚胎比例更低（I4F为30%；V76D为62%），但与野生型（WT）胚胎相比，缺陷发生频率更高、程度更严重。

D-晶状体蛋白转基因品系之间严重程度和外显率的差异，可能是由于基因组插入事件的随机性导致各品系的表达水平存在差异，这种现象统称为位置效应。也就是说，D-晶状体蛋白转基因的表达水平越高，观察到的晶状体表型外显率就越高。为了排除位置效应作为可变表型的成因，我们通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）比较了D-晶状体蛋白V76D与I4F转基因的表达水平，以及D-晶状体蛋白V76D胚胎之间的表达水平展示主要和次要缺陷（补充图S2）。尽管与I4F转基因品系相比，V76D转基因品系在胚胎中表现出晶状体表型的比例更高（图1B），但V76D转基因的表达量实际上略低（补充图S2A）。此外，对于同一突变体，表现出主要和次要晶状体缺陷的胚胎之间，转基因表达量未检测到显著差异（补充图S2B）。因此，我们得出结论，D-晶状体蛋白突变体的转基因表达水平并不决定晶状体表型的严重程度或外显率；相反，与突变体稳定性的相关性表明，这种变异性是突变位点/类型的函数。我们将这一发现解读为晶状体中存在一种内在机制，能够缓冲这些易聚集的突变体。该网络的分子伴侣容量的滴定度解释了所观察到的对突变体稳定性的依赖性。

图3 不稳定的γD-晶状体蛋白在晶状体中形成聚集。A，图a，利用Gal4/UAS靶向基因表达系统的实验示意图。将双转基因品系Tg[cryaa:Gal4]；Tg[UAS:GFP]的雄性与AB雌性进行远缘杂交。向受精合子中注射tol2 mRNA以及表达荧光标记的人γD-晶状体蛋白（Hsa.CRYGD-mCherry）的UAS应答子Tol2构建体，其中包括野生型以及I4F、V76D和I4F/V76D双突变体三种变异体。图b，筛选出晶状体纤维中mCherry表达呈阳性的胚胎，并在受精后4天（4 dpf）进行成像。(b') 展示了绿色晶状体（源自UAS:GFP）以及mCherry标记的γD-晶状体蛋白镶嵌表达的示例。B，mCherry标记的人γD-晶状体蛋白的镶嵌表达，包括野生型（图a-c）和I4F/V76D双突变体（图d-f）。在表达Hsa.CRYGD_I4F/V76D-mCherry的晶状体中观察到明显的mCherry斑点/聚集体（图e和f中的白色箭头），而在表达野生型(gamma D) -晶状体蛋白构建体的晶状体中未观察到（野生型主要呈现弥散且细长的模式，与晶状体纤维细胞的形状一致）。展示了微分干涉对比（DIC）图像（图a和d）、荧光图像（红色通道；图b和e）以及融合图像（图c和dc231522-3d0-49d1-8f8d-d39297b68982）。(C,) 统计了晶状体中出现mCherry斑点的胚胎频率（野生型及I4F、V76D、I4F/V76D双突变体三种变异体）。

DestabilizedD-Crystallin蛋白在晶状体中形成聚集体——以前的研究推断，在人类和小鼠中发现的γ-晶体蛋白的先天性突变倾向于形成聚集体，然后导致浑浊和白内障的形成。然而，这一结论是基于稀疏的生化证据而不是体内数据得出的。

为了直接测试观察到的晶状体表型来自destabilizedD-crystallins形成蛋白质聚集体的倾向的假设，我们用红色荧光蛋白标记D-晶体突变体以可视化它们的结合状态（详见“实验程序”）。Gal4/UAS靶向基因表达系统用于通过注入来自晶状体特异性转基因驱动系Tg[cryaa： Gal4VP16]的胚胎来生成晶状体纤维马赛克，UAS响应构建体表达荧光标记的人(gamma D)-晶体（Hsa.CRYGD-mCherry）野生型（作为对照）和三个变体，I4F，V76D和I4F/V76D双突变体（图3A）。在受精后4天（4 dpf）检测标记的D-晶体蛋白的荧光时，我们经常在表达D-晶体蛋白I4F/V76D突变体的晶状体中观察到明显的红色点状聚集（图3B，图d-f），而在表达野生型D-晶体蛋白的晶状体中，荧光呈弥散状，点状聚集极为罕见（图3B，图a-c）。重要的是，与D-晶体蛋白I4F或V76D单突变体相比，表达稳定性最差的D-晶体蛋白变体（I4F/V76D双突变体）的胚胎晶状体中，荧光点状聚集的出现频率最高（图3C）。晶状体中荧光点状聚集的出现与D-晶体蛋白突变体的解折叠自由能之间的这种相关性表明，D-晶体蛋白稳定性的降低确实会增强其在天然细胞环境（即晶状体纤维细胞）中形成聚集体的可能性。这一结论得到了微分干涉相差（DIC）和荧光显微镜联合观察结果的支持，发现在晶状体缺陷部位与荧光点状聚集共定位（图3B，图f，箭头）。因此，如上所述的组织学分析也证实，与β-晶体蛋白突变体表达相关的晶状体表型主要是由蛋白质聚集体的形成引起的（图2C）。 定量蛋白质组学揭示成年斑马鱼晶状体内水不溶性聚集体的形成——除了胚胎晶状体缺陷外，我们还着手探究在成年转基因鱼中表达不稳定的人D-晶体蛋白变体所产生的长期影响。为此，我们采用等压标签定量蛋白质组学（iTRAQ）技术，分析了3月龄和15月龄成年鱼晶状体的水溶性组分（WSF）和水不溶性组分（WIF）中整体蛋白丰度的相对变化。详细分析将在其他地方发表。与本研究直接相关的发现是，在15月龄成年鱼晶状体样本中，与表达I4F突变体的鱼相比，表达I4F/V76D突变体的鱼晶状体水不溶性组分（WIF）中，人D-晶体蛋白肽段（经酶切用于iTRAQ标记）的含量显著增加（图4及补充图S3）。结合上述对聚集现象的荧光检测结果，这些结果表明，稳定性更差的D-晶体蛋白突变体聚集体无法保持可溶性，而是优先存在于水不溶性组分中，这为晶状体光散射能力的增强提供了分子基础。 大鼠β-晶体蛋白的外源表达对D-晶体蛋白I4F/V76D诱导的晶状体缺陷无保护作用——体外生化研究表明，与白内障相关的D-晶体蛋白突变体能够逃避β-晶体蛋白的质量监控，这与其在小鼠模型中诱导白内障的能力一致。我们利用转基因斑马鱼模型在体内探究D-晶体蛋白与β-晶体蛋白之间的相互作用，旨在验证β-晶体蛋白的结合能力是否存在限制，以及是否会被突变体β-晶体蛋白所耗尽。我们将携带D-晶体蛋白I4F/V76D转基因的鱼系与在晶状体中由同一启动子驱动表达大鼠β-晶体蛋白的转基因鱼系进行杂交，随后通过PCR基因分型分离出仅含单转基因和含双转基因的胚胎。结果发现，双转基因胚胎（D-晶体蛋白I4F/V76D；野生型β-晶体蛋白）的晶状体缺陷外显率未得到任何抑制。与仅携带D-晶体蛋白I4F/V76D转基因的胚胎相比（图5A）。结合荧光数据，这些遗传结果支持了以下观察：这些不稳定的D-晶体蛋白会在斑马鱼中引发晶状体异常，且我们推测在小鼠模型中会导致白内障，原因是它们易在晶状体中形成蛋白质聚集体，从而使光线散射（见上文）。α-晶体蛋白过表达无效应，这与此前体外研究中其与D-晶体蛋白突变体无显著相互作用的结果一致。因此，可用的α-晶体蛋白结合位点池并非限制性因素，突变体对其的滴定并非聚集和晶状体缺陷形成的根源。**β-晶体蛋白剂量降低会加剧D-晶体蛋白I4F表达诱导的晶状体缺陷**——为进一步评估β-晶体蛋白在调控表型中的作用，我们在伴侣蛋白能力降低的斑马鱼品系中表达了β-晶体蛋白突变体。我们假设，在伴侣蛋白网络先天受损的胚胎中，不稳定D-晶体蛋白变体的表达会加剧晶状体缺陷的严重程度和外显率。能以中等外显率（约30%；图1B）在斑马鱼晶状体中引发异常的D-晶体蛋白I4F转基因，为研究修饰基因/因子的遗传协同或拮抗作用提供了理想平台。鉴于我们此前的研究发现α-晶体蛋白缺乏会导致斑马鱼晶状体发育受损，我们通过在cryaa杂合背景（cryaa+/-）中表达D-晶体蛋白I4F转基因来验证这一假设。具体而言，将δ-晶状体蛋白I4F转基因品系与cryaa纯合突变体（(( cryaa ^{-1-}))）及野生型斑马鱼进行杂交后，我们观察到，当内源性cryaa基因的一个拷贝被敲除时，在受精后4天（4 dpf），由(gamma D)-晶状体蛋白I4F诱导出现严重晶状体缺陷的胚胎数量显著增加（达到2倍）（图5B；对比14F；(cryaa ^{+/-})与IF4）。此外，与非转基因同窝仔鱼(( cryaa ^{+/-}))）相比，携带δ-晶状体蛋白I4F转基因的(cryaa ^{+/-})胚胎在受精后4天出现严重晶状体缺陷的比例也显著上升（图5B；对比[14F；(cryaa ^{+/-})与仅[cryaa/]）。这些结果表明，在斑马鱼晶状体中，α-晶状体蛋白水平的降低会加剧由(gamma D)-晶状体蛋白I4F表达所诱导的晶状体缺陷。这一观察到的累加效应并不一定意味着两种晶状体蛋白之间存在直接的物理相互作用，反而可能反映出内源性cryaa基因的单拷贝缺失本质上构建了一个“敏感化”的遗传背景，使得两种较弱的扰动能够协同作用于下游的分子伴侣网络。此外，这一结果也表明，维持α-晶状体蛋白适当的“基因剂量”对于保障下游分子伴侣网络的正常运作至关重要。

与野生型背景（I4F；14%）中的胚胎以及非转基因cryaa/、cryaba/胚胎相比，结果存在差异。B图中，当cryaa基因的一个拷贝缺失时，Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F)胚胎出现严重晶状体缺陷的比例显著更高（I4F；约39%，注：原文(cryaa ^{+1-})为标识串，保留），如前文所述。无论是否存在Rno.Cryaa转基因，出现晶状体缺陷的I4F/V76D胚胎比例均未发生显著变化。对转基因斑马鱼品系进行了杂交。对所得胚胎（I4F/V76D）的晶状体缺陷进行检测，并按照此前的标准将其分为三个严重程度等级，这些缺陷由αA-晶体蛋白突变引发，但内源性αA-晶体蛋白剂量降低会使缺陷加剧。A图为成年Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F/V76D)和Tg(cryaa:Rno.Cryaa)斑马鱼。图5：4天龄胚胎中，人CRYGD_I4F表达诱导的晶状体缺陷比例并未被外源表达所抑制

D-晶状体蛋白变体的表达不会诱导晶状体细胞凋亡或破坏去核过程——细胞死亡与白内障表型相关，包括辐射诱导性白内障、糖尿病性视网膜病变相关白内障以及年龄相关性白内障形成。通过TUNEL染色（图6，G和H）和吖啶橙染色（补充图S4）检测细胞凋亡性死亡，我们发现与野生型（WT）相比，携带D-晶状体蛋白I4F/V76D转基因以及I4F和V76D变体的胚胎中未发现凋亡水平升高的迹象（结果未展示）。因此，在D-晶状体蛋白转基因所观察到的晶状体缺陷中，细胞凋亡性死亡似乎并未发挥主要作用（图2，A和C）。在斑马鱼中通过吗啉代敲低crybgx、cryaa和crybb1c进行功能丧失分析时，也观察到了类似的表型（即无细胞死亡现象）。

晶状体纤维细胞去核失败与多种先天性白内障相关。通过核染色（DAPI；图6D和E）以及表达核定位绿色荧光蛋白的转基因品系（图6A和B），我们未发现晶状体纤维细胞去核过程存在明显受损或延迟的迹象，而在cloche突变体中我们明确观察到了去核不完全的现象（图6C和F），这与已发表的研究结果一致。因此，突变体γ-晶体蛋白表达所引发的晶状体缺陷不太可能是晶状体纤维细胞去核过程被破坏的结果。

讨论

研究发现，不稳定突变体 (gamma D) -晶体蛋白的表达会导致斑马鱼胚胎晶状体出现缺陷，这一结果与此前在小鼠模型中开展的研究一致，这些研究均将此类突变体与白内障的形成相关联。然而，斑马鱼中该表型的外显率和严重程度存在异质性，这揭示了两种模型系统之间存在关键差异。表型的变异性不仅取决于蛋白的不稳定程度，在表达同一突变体的胚胎群体中也能观察到这一现象。因此，部分表达 V76D 突变体的胚胎晶状体未受影响，而另一些胚胎则出现了严重的晶状体缺陷。

鉴于表型取决于突变体的热力学稳定性，而非其表达水平，我们提出，突变的严重程度和外显率反映了分子伴侣网络的存在——该网络的作用是结合、隔离并可能重新折叠那些稳定性下降、易聚集的突变体。该网络的缓冲能力有效赋予了细胞“感知”所表达突变蛋白稳定性的能力，这一点在对解折叠自由能的显著依赖性中得以体现。因此，对于I4F突变体而言，其未折叠且易聚集的蛋白群体水平较低，此时分子伴侣网络隔离易聚集蛋白的效率，要高于双突变体I4F/V76D——后者的解折叠自由能展开过程显著减少，且即使在平衡状态下，部分和/或整体展开的构象也大量存在。这一机制模型得到了D-晶体蛋白突变体聚集体检测结果的支持，这些聚集体在形态上与晶状体缺陷相关联。我们的研究结果不仅证实了此前在小鼠模型中开展的研究——这些突变体与白内障相关，还揭示了分子伴侣网络在缓冲易聚集构象群体方面的重要作用。

Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F/V76D)胚胎（B和E）未出现去核失败迹象，外观与野生型同窝胚胎（A和D）相似。图6：转基因表达人类CRYGD突变体未诱导去核失败或细胞凋亡。与克洛奇突变体胚胎不同，通过核定位H2B-GFP可视化（C）或DAPI染色（F）可清晰观察到Tg(cryaa:Hsa.CRYGD_I4F/V7D)胚胎的晶状体存在不完全去核过程，且与野生型同窝胚胎相比，其晶状体细胞凋亡无显著增加。G和H为TUNEL染色的晶状体图像。

在表达相同易聚集突变体的胚胎群体中，晶状体表型的变异性必然反映出同一网络中的遗传或表观遗传差异，而该网络负责“感知”晶状体蛋白突变体的稳定性。该网络的具体身份将是未来研究的主题，尽管我们推测它必然与分子伴侣相关。

晶状体分子伴侣网络的一个重要成员是小分子热激蛋白——α-晶状体蛋白。我们利用α-晶状体蛋白敲除斑马鱼品系证实，降低其表达水平可提高由不稳定的β-晶状体蛋白突变体诱导的晶状体表型的外显率。然而，增加α-晶状体蛋白的可用池并未影响该表型的表现程度。这一结果表明，D-晶体蛋白突变体的聚集并未耗尽可用的α-晶体蛋白库。

本文所述斑马鱼模型与发现这些突变体的小鼠模型之间的一个根本差异在于突变蛋白的表达水平。在小鼠中，γ-晶体蛋白突变体受其各自的天然启动子调控，而在斑马鱼晶状体中使用α-晶体蛋白（cryaa）启动子驱动表达，可能会降低这些蛋白的整体浓度。这或许能让我们区分不同β-晶体蛋白突变体在聚集倾向方面的固有差异。在小鼠体内，即便是稳定性轻微受损的I4F突变体，其表达水平也可能超过分子伴侣网络的处理能力，从而掩盖不同γ-晶体蛋白突变体之间的这些差异。

本研究建立了一种新模型以探究与白内障相关突变体的作用机制，并为晶状体中维持蛋白质动态平衡的分子伴侣网络的存在及活性提供了直接证据。尽管这一结果与体外研究（32、33）相符，但α-晶状体蛋白虽在哺乳动物晶状体中大量表达，却无法挽救晶状体的表型，这一点在某种程度上有悖常理。

与白内障相关的γ-晶体蛋白突变的机制

进一步的实验正在进行中，以测试其他驻留伴侣蛋白β-晶体蛋白对本文所述表型的调节作用。

实验步骤

斑马鱼的饲养与繁殖——本研究使用AB野生型品系斑马鱼（斑马鱼）。胚胎通过自然产卵获得，于28.5 ℃、14/10小时光照/黑暗周期的0.3Danieau溶液中培养，培养基中添加0.003%（质量/体积）1-苯基-2-硫脲以抑制色素形成。胚胎根据其发育天数（dpf）进行分期。本研究使用的突变体和转基因斑马鱼品系包括：cryaa^avu532、Tg(cryaa:Rno.Cryaa,myl7:Cerulean)^vu531Tg、Tg(cryaa:Gal4vp16)^mw46Tg；Tg(UAS:GFP)^kca33Tg以及cloche^m39。所有动物实验均经范德堡大学机构动物护理与使用委员会批准。本研究中使用的所有斑马鱼品系均根据其相应发育阶段采用相同的饲养流程。

斑马鱼转基因技术——为建立特异性在晶状体中表达人CRYGD基因（Hsa.CRYGD）的转基因斑马鱼，通过将人CRYGD互补DNA插入pT2HBLR载体中斑马鱼cryaa启动子（1.2 kb）的下游，构建了Tg(cryaa:Hsa.CRYGD,myl7: Cerulean)载体，该载体同时包含由myl7启动子驱动的天青蓝作为筛选标记。采用Tol2介导的转基因技术，对三种人CRYGD（I4F、V76D和I4F/V76D）转基因均按先前描述的方法进行操作。为每个构建体筛选至少两个首建系（F0），并与已建立的稳定F1代进行回交。每个F1系均进行繁殖并培育至F2和F3代。收集的晶状体缺陷数据来自F3或F4胚胎，且在表达相同γD-晶状体蛋白构建体的各稳定品系中，观察到晶状体缺陷的外显率一致。

UAS表达构建体的组装——所有UAS表达构建体均通过MultiSite Gateway（英维特罗根公司）组装反应，采用先前建立的Tol2kit相关方案完成构建（60）。具体而言，将Tol2kit载体p5E-UAS与p3E-mCherry，与pME-Hsa.CRYGD（野生型及三种变体：I4F、V76D和I4F/V76D）进行组装，并重组至pDestTol2CG2载体中，随后将该载体用于显微注射实验。

实时荧光定量PCR——使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）从所需发育阶段（受精后2天和4天）的胚胎中分离总RNA，随后进行DNase处理（Ambion公司）。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad公司）进行逆转录反应，后续的实时荧光定量PCR反应（采用SsoAdvanced通用SYBR Green预混液；Bio-Rad公司）按照制造商的操作流程在Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统上进行（循环参数为：95℃预变性10分钟，40个循环中95℃变性15秒、60℃退火延伸30秒）。通过凝胶电泳分析PCR产物，确认其片段大小符合预期。使用实时荧光定量PCR仪配套的CFX Manager软件（Bio-Rad公司）测定Ct值。样本间的表达差异采用ΔΔCt（比较Ct）法计算，结果未转换为对数2倍变化值进行报告。从每个转基因系的不同批次受精卵中，收集3组各10枚胚胎的样本，每个样本均进行检测一式三份。以下用于定量实时荧光定量PCR的引物如下：针对Hsa.CRYGD（所有D转基因）的引物为5'-CGAGCTGTCCAACTACCGAG-3'和5'-TCGACCTCGAGTCAGGAGAA-3'；针对actb2（β-肌动蛋白）的引物为5'-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3'和5'-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3'，actb2作为内参用于校准样本间的基因表达水平。

细胞死亡检测实验——将胚胎置于含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中，于4℃固定过夜，用100%甲醇脱水后，于-20℃保存。TUNEL染色步骤按照制造商推荐的方案进行（原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红色；Sigma-Aldrich货号12156792910）。吖啶橙染色则是将活胚胎浸入5微克/毫升的吖啶橙溶液中，于室温下孵育10分钟，随后立即使用异硫氰酸荧光素滤光片进行成像。

组织学与免疫组织化学——胚胎眼的塑料组织学切片按前述方法制备，1M 切片经甲苯胺蓝染色。DAPI 染色在冷冻切片上进行，方法参照 Uribe 和 Gross 的研究。

使用明场显微镜（蔡司 Axiovert 200）在受精后4天（4 dpf）对置于含1-苯基-2-硫脲/三卡因的0.3%丹宁酸水中的活胚胎晶状体进行显微成像和图像处理分析，并根据本团队前期研究（34）中定义的晶状体缺陷严重程度将其分为三类。1类为无可见晶状体缺陷的胚胎（“野生型类似”）；2类为“轻度”晶状体缺陷组，其晶状体中出现细小且散在的球形小滴；3类为“重度”晶状体缺陷组，特征为晶状体中存在大量且/或数量众多的液滴，覆盖了晶状体大面积区域。 使用蔡司 AxioZoom.V16 显微镜拍摄荧光图像。通过蔡司 LSM510 倒置共聚焦显微镜，对包埋于3%甲基纤维素中的受精后4天胚胎进行差分干涉对比（DIC）和反射率分析，相关分析编号为(lambda em=488)。以20倍物镜拍摄DIC图像，并将其作为反射率分析的参考感兴趣区域，随后通过图像处理软件ImageJ对反射率分析结果进行数字化分析。

蛋白质变化的iTRAQ定量分析——为定量转基因斑马鱼晶状体中蛋白质表达的变化，将每种类型（野生型、野生型双显性、DI4F突变型和DI4F/V76D双突变型）15月龄鱼（F3代成鱼）的1个晶状体在50毫升匀浆缓冲液（25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、150毫摩尔/升氯化钠、1毫摩尔/升二硫苏糖醇、5毫摩尔/升乙二胺四乙酸，pH值7.5）中匀浆。样品在20000倍重力加速度下离心30分钟，沉淀用另外50毫升匀浆缓冲液洗涤后，再次以20000倍重力加速度离心离心。上清液合并得到水溶性上清组分。采用考马斯亮蓝法（赛默飞世尔科技公司，美国伊利诺伊州罗克福德市）测定水溶性上清组分的蛋白质浓度。沉淀记为水不溶性组分。水不溶性组分经两次水洗后悬浮于100毫升水中，取等体积样品与等体积5%十二烷基硫酸钠混合，采用二辛可宁酸蛋白定量法（赛默飞世尔科技公司）进行检测。每个晶状体的100毫克水溶性上清组分在60摄氏度条件下用50毫摩尔/升三（2-羧乙基）膦还原1小时，在室温下用200毫摩尔/浓度的甲基甲烷硫代磺酸盐烷基化10分钟，随后用测序级胰蛋白酶进行过夜酶解。每个水溶性上清组分的20微克随后按照制造商（美国加利福尼亚州福斯特城的 AB Sciex 公司）的说明，使用 iTRAQ 试剂对各组分进行标记（WT 对应 114 标签、WTD 对应 115 标签、DI4F 对应 116 标签、DI4F/V76D 对应 117 标签）。对于 WIF 组分，每个 WIF 样品的复溶沉淀全部用胰蛋白酶消化，取 18 微克样品用 iTRAQ 试剂进行标记。将试剂复溶于乙醇中，使每个蛋白质样品在最终浓度为 90% 的乙醇中完成 iTRAQ 标记，标记反应持续 2 小时。

将iTRAQ标记的样品混合，用TFA酸化，随后在LC-MS/MS分析之前通过改进的阶段尖端方法脱盐。使用13个盐脉冲步骤（0 mM、25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM、500 mM、1 M和2 M醋酸铵）的MudPIT分析iTRAQ标记的样品。肽通过纳米电喷雾引入Q Exactive质谱仪（Thermo Science）。Q Exactive以数据控制模式操作，使用(1 ×10^{6})离子的MS1离子靶和(1 ×10^{5})离子的MS2靶，在20个最丰富的离子上获得更高能量的碰撞激活解离MS/MS扫描（每次MS1扫描((r=70,000))后((r=17,500))）。MS/MS扫描的最大离子时间设置为100毫秒，HCD归一化碰撞能量设置为30，动态排除设置为30，并启用肽匹配和同位素排除。对于iTRAQ数据分析，使用Spectrum Mill软件包（版本B.04.00；安捷伦科技）处理质谱。合并在保留时间为1秒的相同前体(m/z)（0.01 m/z）上获得的MS/MS光谱。质量差的MS/MS光谱由于没有序列标签(length >1)而未能通过质量过滤器被排除在搜索之外。最小匹配峰值强度要求设置为50%。对于肽鉴定，MS/MS光谱针对附加了人类CRYGD蛋白序列的Uniprot斑马鱼数据库（2012年6月21日）进行搜索。其他搜索参数包括胰蛋白酶特异性，最多有三个错过的裂解，20ppm前体质量耐受性，20ppm（HCD）产物质量耐受性，以及固定的修饰，包括半胱氨酸的methanethiosulfonate烷基化和赖氨酸和肽N末端的iTRAQ标记。允许甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。进行自动验证，以便按照自动化程序将肽分配到质谱中指定为有效，在此过程中，针对每个前体电荷状态分别优化得分阈值，并将基于目标诱饵的最大错误发现率设置为1.0%。

统计学分析——组间差异采用Student’s t检验进行分析。数据以均值±标准误（S.E.）表示。当(p<0.05)时认为差异具有统计学意义