题目：Understanding the Role of ztor in Aging-related Diseases Using the Zebrafish Model Diseases Using the Zebrafish Model

原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6899122/

期刊：In Vivo

摘要

 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是磷酸肌醇3-激酶（PI3K）相关家族中一种分子量为289千道尔顿的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在调控人类和啮齿动物的寿命及衰老过程中的作用已为人熟知。斑马鱼的衰老过程与人类和啮齿动物极为相似。老年斑马鱼常表现出脊柱弯曲、白内障和认知衰弱等症状，这与人类因衰老引发的骨关节炎、视力下降以及认知功能障碍等表型效应类似。然而，mTOR的斑马鱼同源物ztor在这些方面的作用研究仍不够明确。本文综述了斑马鱼的衰老机制、ztor在正常发育过程中的生理作用，以及其在代谢紊乱和癌症等衰老相关疾病发病机制中的参与情况。

斑马鱼是一种脊椎动物，自20世纪70年代起就被用作研究发育生物学的模式生物。大约十年后，首次大规模脊椎动物诱变筛选发现了众多斑马鱼突变体，这些突变体与人类疾病相关突变体具有同源性。斑马鱼是生物医学研究中理想的脊椎动物模式生物，这得益于其已被充分研究的脊椎动物生物学特性，以及高度保守的分子和细胞生理学特征。在饲养管理方面，斑马鱼相较于啮齿类动物等其他动物模型，具有类似无脊椎动物的技术优势。斑马鱼在生理和解剖结构上有诸多特征与脊椎动物相似，还兼具高繁殖力和快速胚胎发生的额外优势，这使其能够开展与无脊椎动物类似的大规模筛选。与无脊椎动物类似的筛选。

斑马鱼也是研究机体衰老的理想模型。斑马鱼发生的渐进性衰老过程与人类相似。老年斑马鱼中年龄依赖性的生理变化包括导致脊柱弯曲的肌肉异常、白内障以及认知功能衰退。然而，与人类不同的是，斑马鱼具有组成型活性的端粒酶活性。斑马鱼的端粒长度（15-20千碱基对）略长于人类（10-15千碱基对）。有研究表明，从胚胎期到成年期，斑马鱼的端粒长度和端粒酶表达水平会升高，而在衰老的斑马鱼体内则会急剧下降。由于端粒长度和端粒酶与衰老及癌症易感性相关，分析斑马鱼不同发育阶段的遗传背景，有助于研究衰老相关疾病中的端粒生物学。

大量研究表明，细胞衰老在机体层面推动生物衰老。在这方面，雷帕霉素哺乳动物靶标（mTOR）与细胞衰老以及衰老均存在广泛关联。mTOR的激活受到营养物质和生长因子的促进，具体通过增强其下游效应因子的磷酸化来实现。这些效应因子包括S6激酶、核糖体蛋白S6和4E-BP1，它们通过调控起始因子、延伸因子以及核糖体的生物发生来控制蛋白质合成。mTOR最著名的功能是作为细胞增殖、细胞生长和代谢的核心调控因子。然而，霍尔（2016）发现mTOR调控的是细胞生长而非细胞增殖。一项针对酵母的研究显示，TOR突变体与真正的细胞周期突变体表现不同，其中cdc28突变体细胞尽管在G期停止了细胞增殖，却持续生长至正常细胞大小的四倍。相比之下，当细胞分裂在 G_1期停止时，TOR突变体细胞并未生长到如此大的尺寸。在G_1阶段被逮捕。霍尔的研究进一步揭示，这些细胞的细胞周期蛋白翻译起始过程发生改变。因此，霍尔（2016）提出了关于TOR作用的范式转变：TOR直接调控细胞生长（如大分子合成），间接调节细胞增殖。研究表明，mTOR复合物1（mTORC1）的异常激活会导致细胞和组织肥大，进而引发细胞衰老。肥大细胞的形成是细胞长期持续生长（细胞体积或质量增加）但不进行细胞分裂的结果，这通常与细胞衰老表型相关。

斑马鱼雷帕霉素靶蛋白（ztor）直向同源物与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的同源性达90%，但这种高度保守的ztor的作用尚不完全明确（图1）。既往研究表明，ztor可调控斑马鱼肠道上皮形态发生的发育过程，而抑制ztor已被证实能对成年斑马鱼产生长期的心脏保护作用。ztor杂合斑马鱼中TOR单倍体不足会减轻阿霉素（DOX）诱导的心肌病。这些研究结果凸显了ztor信号通路在肠道发育和心肌病中的重要性，但其具体作用机制仍有待进一步探究。

老年斑马鱼与人类的表型变化

斑马鱼因其良好的老年学特性被用于衰老研究，其衰老过程与大多数脊椎动物一样是渐进的，随着年龄增长，生长速度明显下降，繁殖力也逐渐减弱。斑马鱼的平均寿命约为3至4年，且在约2岁时开始出现衰老迹象。端粒重复结合因子2（terf2）基因和斑马鱼自旋同源物1（spns1）基因均为杂合突变的成年斑马鱼表现出与衰老相关的表型。杂合突变鱼的衰老表型出现时间提前，且与胚胎神经和肌肉退行性表型相关，具体表现为神经管中吖啶橙染色强烈，神经管和骨骼肌中活性氧（ROS）生成增加，以及整个肌节出现肌纤维缺失。

脊柱弯曲：研究发现，老年斑马鱼存在不同程度的脊柱弯曲，1至3岁的斑马鱼脊柱弯曲的发生率和严重程度更高。关节边缘的骨性增生和皮质骨内骨折等年龄相关性异常是导致这些脊柱弯曲的原因。皮质骨内骨折是导致这些脊柱弯曲的原因。格哈德等人（2002年）的研究表明，没有证据表明存在骨脱矿和压缩性畸形，这一发现支持了因肌肉变性导致的骨骼肌流失是脊柱弯曲异常成因的这一假说。老年斑马鱼脊柱中随年龄增长自然发生的这些变化，让人联想到一系列与人类退行性关节病相关的类似病理改变，例如骨质疏松症、骨关节炎中的关节软骨侵蚀以及骨赘形成。

视力退化：成年斑马鱼白内障形成增多与衰老相关。眼晶状体中的蛋白质beta gamma和γ-晶状体蛋白对维持晶状体透明度至关重要。晶状体蛋白随年龄发生的改变会导致光线散射，使视网膜成像质量下降。晶状体透明度随之丧失会逐渐引发晶状体混浊或白内障。Reis等人（2013）发现一种新型beta gamma -晶状体蛋白突变与常染色体显性遗传性白内障高度相关。值得注意的是，CRYBA2的斑马鱼同源物cryba2a和cryba2b在晶状体早期发育阶段呈高表达，提示其在遗传性白内障形成中发挥作用。同时，研究人员通过向单细胞胚胎显微注射人突变CRYGC p.Gly129Cys信使RNA，开展了斑马鱼crygc功能获得性研究。编码γC-晶状体蛋白的p.Gly129Cys突变体过表达会导致斑马鱼晶状体特异性基因下调，包括晶状体内膜蛋白2.3（lim2.3）和连接蛋白23（cx23），最终使斑马鱼晶状体混浊度增加并出现白内障表型。相应地，衰老斑马鱼眼晶状体中α-晶状体蛋白的表达水平显著升高。

认知衰退：斑马鱼中也观察到了与衰老相关的认知衰退。越来越多的证据表明，老年斑马鱼的学习过程会变得拖沓。老年野生型斑马鱼在记忆类和回避类任务中的表现不佳。3岁野生型斑马鱼对时间线索的认知反应比1岁幼龄斑马鱼更迟缓，这一点体现在限制喂食新时间节律的效率降低上。此外，老年斑马鱼表现出探索行为减少、刻板行为增多的特点，且在衰老过程中会出现行为参数的改变，例如在出现刻板行为之前，行为改变率会下降。同样，随着年龄增长，人类也会出现记忆减退、学习速度变慢等认知衰弱问题。另有研究对比了1岁幼龄斑马鱼和2岁老龄斑马鱼的认知能力。幼龄斑马鱼具有良好的学习能力，且表现出显著的学习优势。与年长斑马鱼相比，年轻斑马鱼在颜色辨别任务中做出的正确选择更多，这表明其表现有所提升。此外，空间认知测试显示，在整个实验过程中，年轻斑马鱼在开放场地迷宫中寻找有诱饵的孔洞所需的搜索时间更短，而年长斑马鱼在迷宫中所需的时间更长。老年斑马鱼身体表现的此类变化，与人类老年时期出现的年龄依赖性认知损伤相似。

图1. 利用 BLASTP 2.9.0+ 对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，智人，登录号 NP_004949.1）及其同源蛋白 ztor（斑马鱼，登录号 NP_001070679.2）进行序列比对，结果显示二者序列的同源性为 90.13%（上图）。下图为利用多重序列比对查看器 1.10.1 查看的两条序列比对结果。

表I. ztor在斑马鱼模型中与年龄相关疾病的关联

心血管功能障碍：在斑马鱼体内，与年龄相关的功能变化与心脏的病理生理变化高度相关，这与人类心血管功能逐渐衰退进而增加高血压、动脉粥样硬化和心肌梗死的发病风险的情况颇为相似。与8个月大的斑马鱼相比，52个月大的斑马鱼心率显著降低，心律失常或心律不齐的情况也有所增加。随着年龄增长，心室舒张末期内径增大，心室舒张内径减小，心室顺应性下降，舒张功能受损。此外，老年斑马鱼的心室心肌密度高于年轻斑马鱼，心外膜血管也更小。因此，老年斑马鱼心脏功能的恶化会导致心脏肥大、功能障碍等病理状态，与人类出现的心血管疾病症状相似。

斑马鱼模型中ztor在年龄相关疾病中的作用

虽然衰老和年龄相关性疾病（ARDs）曾被视为独立的个体，但近期的流行病学和实验数据表明，年龄相关性疾病是衰老连续过程的一部分，且二者拥有相似的基础和细胞机制。有研究提出，包括年龄相关性疾病发病在内的衰老过程，是由信号传导通路的过度激活所驱动的，尤其是涉及mTOR介导的生长通路这一途径；在该通路中，正常的生长及其他细胞功能被异常加剧，进而引发稳态失衡以及器官功能障碍与损伤。尽管mTOR调控在人类衰老及其他模式生物中的作用已得到广泛研究，但其高度保守的同源基因ztor在斑马鱼中与年龄相关性疾病相关的作用却鲜有探索。后续章节将探讨ztor在斑马鱼各类年龄相关性疾病模型中的参与情况（表I）。ztor的表达具有时间和空间上的动态特征。

ztor在斑马鱼中的表达具有时空动态性，在胚胎发生早期呈广泛表达，这表明ztor对斑马鱼的发育和生长至关重要。研究在受精后6、18和24小时（hpf）检测到了ztor的表达，且已证实其在受精后35至57小时于头部以及发育中的肠道内表达。ztor参与斑马鱼发育和生长的过程已有充分研究，其中包括ztor激活对肠道上皮形态发生、轴突再生、突触强化以及再生相关结构形成的必要性、突触强化与形成新的学习与记忆连接、血管生成以及心肌小梁形成。相反，ztor 的过度激活会导致斑马鱼出现癫痫样表型特征的早期发作 。由于斑马鱼表现出与人类相似的衰老表现，因此可建立肥胖、2型糖尿病、癌症、认知障碍以及年龄相关性视网膜神经病变/眼病变等年龄相关性疾病（ARDs）模型，为深入理解这些疾病的发病机制开展基础研究，同时也为药物研发及新型治疗策略的测试提供支撑。

肥胖症：斑马鱼肥胖模型可通过在单细胞阶段的斑马鱼胚胎中，由斑马鱼皮肤特异性角蛋白4（krt4）启动子驱动表达人AKT1的活性形式（myrAKT1）来构建。myrAKT1是AKT1基因的肉豆蔻酰化序列，经改造后可绕过磷酸肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）和PIP2的激活过程（原文此处重复表述，保留核心含义）。在人体中，myrAKT1对PI3K通路的负调控因子PTEN的抑制具有抗性。转myrAkt1基因的斑马鱼Tg(krt4:Hsa.myrAkt1)cy18表现出严重的肥胖表型，包括皮肤增生和过度生长。此外，成年的Tg(krt4:Hsa.myrAkt1)cy18斑马鱼还存在体重增加、脂肪组织异常堆积以及葡萄糖耐量异常等特征。更重要的是，持续激活的AKT信号通路上调其下游蛋白，包括斑马鱼雷帕霉素靶蛋白（ztor）和S6蛋白激酶（70s6k），且该通路的激活在肥胖大鼠中已得到充分证实。相反，在120小时胚胎阶段（hpf）对Tg(krt4:Hsa.myrAkt1)cy18斑马鱼进行ztor抑制，可通过显著降低肥厚型皮肤的比例来改善肥胖表型。ztor在肥胖症中发挥着一定作用，但其在脂肪生成、脂质代谢和产热过程中的具体功能，如同mTOR的相关研究报道一样，仍需进一步探究。

2型糖尿病：mTOR在糖脂代谢及糖尿病中的作用已得到广泛研究。通过每日喂食由卤虫和1%蛋黄组成的高脂饲料持续10周，可成功在斑马鱼中诱导出2型糖尿病模型。长期喂食该高脂饲料的斑马鱼会出现肥胖的临床症状，如体重增加、肝细胞内脂质空泡增多。胰岛素信号通路也受到破坏，表现为空腹血糖水平升高，肝脏中胰岛素mRNA水平上升，同时介导胰岛素效应的胰岛素受体底物-2（irs-2）和葡萄糖转运蛋白2（glut2）表达下调。有趣的是，在类2型糖尿病斑马鱼中，ztor水平升高，且这一现象与其对自噬的抑制作用相关。这与此前脂肪酸积累破坏自噬、胰岛素通路调控自噬的研究报道一致。这些研究已证实 ztor 参与斑马鱼的 2 型糖尿病过程，这一发现可为 ztor 在脂质调节和糖代谢中的作用开展深入研究提供方向。

癌症相关研究：Kim 等人（2013 年）通过在 p53 突变体背景下诱导 tsc2 杂合突变，构建了斑马鱼癌症模型，以研究癌症发病机制。该突变体出现了眼部肿瘤、胸鳍附近的血管瘤样肿瘤、头部和背鳍的黑色素瘤样肿瘤以及腹部肿瘤。研究观察到，与仅携带 p53 突变的斑马鱼相比，tsc2;p53 复合突变斑马鱼的肿瘤发生过程得到增强。此外，作为癌症恶性进展的重要调控因子，hif1-α、hif2-α 和 vegf-c 在 tsc2;p53 复合突变斑马鱼体内的表达水平有所升高，这一点可通过肿瘤中新生血管生成增加和血管扩张得到证实。研究还发现，恶性腹部肿瘤和眼部肿瘤中 ztor 信号通路被上调。在 tsc2;p53 复合突变斑马鱼体内，ztor 上下游效应因子（包括 S6 激酶、4EBP1 和 Akt）的蛋白水平均呈上调状态。与之相反，用雷帕霉素处理 2 周可抑制眼部肿瘤的 ztor 信号通路，处理 3 天可抑制胸鳍处的血管瘤样肿瘤，处理 2 天可抑制腹部肿瘤，这一处理不仅使肿瘤体积缩小，还破坏了肿瘤相关的血管生成。借助斑马鱼异种移植模型，Chiang 等人（2016 年）发现 PTEN 功能缺失会促进人乳腺癌（MCF-7）细胞的增殖。同时，在 48 小时受精阶段的斑马鱼胚胎后脑脑室中，PTEN 敲低的 MCF-7 细胞从原发注射位点发生显著扩散，这为体内转移提供了证据。此外，在 PTEN 敲低的 MCF-7 细胞中，对癌症转移过程至关重要的上皮-间质转化（EMT）诱导转录因子（如 Zeb-1、Zeb-2、Snail、Slug 和 Twist）的表达水平有所升高。由于 PTEN 是 PI3K/AKT/MTOR 通路中 MTOR 的上游负调控因子，因此可推测 ztor 信号通路可能与乳腺癌转移相关。这些研究结果凸显了 ztor 信号通路在癌细胞肿瘤发生和转移过程中的重要作用。

与年龄相关的视网膜疾病：据报道，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的异常激活会导致人类视网膜色素上皮变性。Ztor 在人类视网膜疾病变性中的作用。Ztor 在视网膜疾病中的作用尚不清楚，但在野生型AB斑马鱼的衰老视网膜中，Ztor 的表达水平更高。老年斑马鱼的视网膜变性与线粒体完整性下降和基因拷贝数减少有关。老年斑马鱼的视网膜中，Pink1 蛋白的表达下调，Pink1 是一种介导线粒体自噬的线粒体激酶。线粒体自噬的调控对于通过选择性自噬过程清除受损线粒体以维持线粒体功能至关重要。在此外，衰老斑马鱼视网膜中存在线粒体融合受损和线粒体分裂异常的现象，表现为mfn2蛋白表达减少、fis1蛋白表达增加。线粒体质量与融合/分裂的这些异常反映了衰老过程中出现的线粒体功能障碍。有趣的是，白藜芦醇处理不仅能改善线粒体功能，还能抑制衰老视网膜中ztor活性的升高。白藜芦醇处理10天后，视网膜神经节细胞层（GCL）中ztor的蛋白表达显著降低。目前仍有待解答的问题是，在老年斑马鱼年龄相关性视网膜神经病变中，ztor与线粒体功能障碍之间存在何种关联。

心血管疾病：ztor 在斑马鱼的发育过程中发挥着重要作用，抑制 ztor 信号通路会导致斑马鱼幼虫的肠下血管（SIVs）和节间血管（ISVs）形成缺陷，这一点已得到明确证实。抑制 ztor 信号通路还会阻碍内皮细胞增殖和血管生成。Ras p21 蛋白激活因子 1（rasa1）和 Ephrin 型 B 受体 B4a（ephb4a）对血管生成至关重要，这两种蛋白的缺乏会导致节间血管缺陷、动静脉畸形和尾侧血管畸形。相应地，用 mTOR 抑制剂雷帕霉素进行预处理可以逆转异常的血管表型，这表明 ztor 的激活会导致血管畸形。ztor 的激活会导致血管畸形。

已有研究报道了ztor在成年斑马鱼心血管疾病发生发展中的作用。有研究表明，杀虫剂狄氏剂的广泛使用会使人类极易患上心血管疾病。近期，研究人员在6个月大的AB品系斑马鱼体内，通过狄氏剂诱导出了心脏骤停和心室纤颤的症状。在狄氏剂暴露的斑马鱼中，ztor信号通路也被持续激活，同时其溶酶体生理功能受损。在狄氏剂诱导的ztor激活过程中，炎症基因表达上调，而溶酶体基因表达下调，这导致炎症反应增强、自噬活性降低，而这两者正是斑马鱼心肌细胞损伤的危险因素。该研究证实，ztor与其同源蛋白mTOR一样，在自噬过程中对清除毒性或功能异常的蛋白质聚集体发挥着重要作用。

结论

本综述总结了斑马鱼衰老的表型变化。这些表型变化与人类高度相似，使斑马鱼成为研究人类衰老及年龄相关疾病的合适模型。mTOR 是人类细胞过程的主要调控因子。越来越多的证据表明，其斑马鱼同源基因 ztor 在正常发育过程以及某些年龄相关疾病的发病机制和进展中发挥作用。然而，仍有许多在斑马鱼疾病模型中理解mTOR在年龄相关性疾病发病机制中的作用，进而将这些发现转化并与高等脊椎动物（尤其是人类）关联起来，这方面仍存在诸多有待填补的空白。一旦明确了mTOR在年龄相关性疾病中的作用，便可建立相应的斑马鱼疾病模型，用于高通量药物筛选和测试，以识别具有潜力的治疗靶点。总体而言，本综述为利用斑马鱼来理解衰老过程及其相关疾病提供了重要参考。