标题：Lens autophagy protein ATG16L1: a potential target for cataract treatment

期刊：Theranostics 2024, Vol. 14, Issue 10

原文链接：https://www.thno.org/v14p3984.htm

摘要

研究依据：白内障是全球致盲和视力低下的首要原因，但其病理机制尚未完全阐明。尽管巨自噬（即自噬）被认为对晶状体稳态至关重要，且在缓解白内障方面显示出潜力，但其具体作用机制仍不明确。揭示晶状体自噬的分子细节，有望为手术之外的白内障治疗提供靶向干预策略。

方法：我们通过免疫荧光染色、蛋白质印迹法和透射电子显微镜监测了晶状体中的自噬活性，并鉴定出关键自噬蛋白ATG16L1。通过免疫共沉淀和蛋白质印迹法分析了ATG16L1泛素化的调控机制。我们利用E3连接酶轴突蛋白的晶体结构，开展了化学文库的对接筛选。在体外细胞实验和体内动物模型中测试了所鉴定化合物核黄素的作用。

结果：本研究采用人晶状体上皮细胞（HLE细胞）和连接蛋白50（cx50）缺陷型白内障斑马鱼模型，证实ATG16L1对晶状体自噬至关重要。通过减弱ATG16L1的泛素化依赖性降解来稳定其表达，可增强自噬活性并缓解cx50缺陷型斑马鱼的白内障表型。机制研究发现，在此过程中E3泛素连接酶轴突蛋白与ATG16L1的相互作用被削弱。基于上述机制，我们筛选出核黄素这一靶向E3泛素连接酶的药物，该药物可抑制ATG16L1泛素化、促进自噬，最终在自噬相关模型中减轻白内障表型。

结论：本研究发现了ATG16L1泛素化在自噬调控中参与白内障形成的未被认知的机制，为白内障的治疗提供了新的见解。

关键词：ATG16L1；自噬；白内障；泛素化；E3 连接酶

引言

白内障由晶状体混浊引起，是全球失明和视力低下的首要原因。迄今为止，唯一成熟的治疗方法是白内障手术，该手术可能引发一系列并发症，如后囊混浊和眼内炎。因此，迫切需要阐明潜在的分子发病机制并确定有效的靶向治疗方法。

自噬是一种在进化上保守的自我降解过程，对维持细胞内稳态至关重要。在晶状体中，在晶状体上皮细胞和纤维细胞的整个分化过程中均存在持续激活的自噬，这一过程参与细胞器降解并维持晶状体的透明度。与自噬相关的基因（如FYCO1、EPG5等）发生突变已有研究在先天性白内障患者中发现了CHMP4B基因的相关异常。在转基因小鼠模型中，白内障相关基因的自噬缺陷也得到了证实。例如，先天性白内障致病基因TDRD7发生突变后，会破坏自噬体与溶酶体的融合，导致晶状体纤维细胞内的细胞器无法被清除。年龄相关性白内障患者中也存在自噬紊乱的情况，60岁以上患者的自噬紊乱发生率达54.38%。这些研究结果揭示了自噬在维持晶状体透明性中的复杂作用，并明确白内障是一种与自噬缺陷相关的疾病。然而，自噬的复杂调控网络及其异常导致晶状体混浊的具体机制，目前仍不明确。

据信有超过30个进化保守的自噬相关基因（ATGs）参与该调控网络，其中ATG16L1是自噬体延伸的关键决定因素。它与ATG5-ATG12结合物相互作用以组装类E3复合物，并促进高等真核生物中膜生物发生所需的LC3脂化过程。尽管其自噬功能已得到广泛研究，但调控ATG16L1蛋白的机制仍知之甚少。

近期一项研究证实，在COS 7细胞中，ATG16L1的周转是一种泛素依赖性过程]。本研究证实，ATG16L1的泛素化对调控晶状体自噬通路至关重要。研究发现，通过减弱ATG16L1泛素化依赖性降解来稳定其表达，可促进连接蛋白50（cx50）缺陷斑马鱼的自噬并减轻白内障表型，而cx50缺陷斑马鱼是一种自噬过程异常的典型白内障模型。从机制层面来看，这一过程会减弱E3泛素连接酶gigaxionin与ATG16L1之间的相互作用。靶向E3泛素连接酶的药物（尤其是核黄素）能够有效降低ATG16L1的泛素化水平并激活自噬，从而减轻cx50缺陷斑马鱼的白内障表型。此外，研究人员还在另外两种自噬相关白内障模型（包括一种由氧化应激诱导的模型）中验证了这一机制。综上，研究结果为潜在的非手术白内障治疗提供了一种极具前景的策略。

材料与方法

实验动物

本研究使用了中国斑马鱼资源中心提供的AB野生型和cx50缺陷型斑马鱼（Ensembl 编号：ENSDARG00000015076）。斑马鱼（受精后60天前无明确性别）饲养于28.5℃的循环水系统中，光照周期为每日14小时光照/10小时黑暗。收集胚胎并将其置于添加亚甲蓝的E3培养基中，在恒温培养箱中培养。

我们先前的研究证实，斑马鱼中cx50的缺乏会导致自噬功能异常，进而引起细胞器降解出现严重缺陷，最终造成白内障的形成。因此，本研究将cx50缺陷型斑马鱼作为存在自噬缺陷的白内障模型进行研究。

在拯救实验中，于受精后12小时（hpf）向斑马鱼加入80微摩尔核黄素或二甲基亚砜，每24小时更换一次培养基，直至72小时（hpf）。显微注射时，向受精卵注射3-4纳升ATG16L1质粒（50纳克/微升），并在72小时（hpf）收集斑马鱼。

针对由(H_{2} O_{2})诱导的白内障斑马鱼模型，按照以往研究的方法，使用32G针头向斑马鱼晶状体前房注射2微升3%的(H_{2} O_{2})。对照组斑马鱼则注射0.5微升磷酸盐缓冲液（PBS）。斑马鱼的培养基中添加或不添加80微摩尔的核黄素负载脂质体，培养24小时后，将其置于10厘米培养皿中继续观察并拍照。

本研究采用6周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠（体重200g，购自上海斯莱克实验动物有限公司）构建低温性白内障大鼠模型。晶状体取自大鼠尸体，于4℃条件下在含10%胎牛血清（FBS，澳大利亚布里斯班AusgeneX公司）和1%青霉素-链霉素的Hibernate™-A培养基（货号A1247501；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司）中孵育24小时。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤晶状体3次，再在添加了10%FBS、含或不含80μM核黄素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，货号10-090-CV；美国纽约康宁公司）中孵育24小时。完成复温处理后，将大鼠晶状体置于细胞外液（货号C0216；中国上海碧云天生物技术有限公司）中，进行后续观察与拍照。

本研究中的所有动物实验均按照ARRIVE指南进行，并经浙江大学动物护理与使用委员会方案批准（编号：2019-069）。

细胞培养与转染

HLE细胞（SRA01-04）取自理化学研究所细胞库（RCB1591），HEK293T细胞购自美国模式培养物集存库（CRL-3216）。细胞在添加10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（10-090-CV；Corning）中培养。RNA干扰实验中，使用的小干扰RNA按照制造商的说明书，使用 Lipofectamine 3000（L3000015；赛默飞世尔科技，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市）转染 48 小时。随后，通过实时荧光定量聚合酶链反应（Q-PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测 RNA 干扰效率。所用的小干扰 RNA（siRNA）如下：CX50 siRNA#1：GCCAGGTCAGACGATCTAA；CX50 siRNA#2：TGTCCCTATTCCTCAACGT。为进行基因过表达，使用 Lipofectamine 3000 将指定质粒瞬时转染细胞 24 小时。所用其他试剂如下：氯喹（CQ，HY-17589A），30 微摩尔/升，处理 6 小时；MG132（HY-13259），10 微摩尔/升，处理 6 小时；核黄素（HY-B0456），80 微摩尔/升，处理 24 小时，均购自美国新泽西州的 MedChemExpress 公司。核黄素脂质体，80 微摩尔/升，处理 24 小时，购自 AVT 制药科技公司。

免疫沉淀（IP）与蛋白质印迹法

对于免疫沉淀（IP），细胞在含有1%苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解缓冲液（P0013；碧云天生物技术）中裂解，然后在12000倍重力下离心30分钟。将所得上清液与指定抗体在4℃下孵育4小时，随后在4℃下加入A/G磁珠（B23202；Bimake，美国得克萨斯州休斯顿市）孵育过夜。用RIPA裂解缓冲液洗涤磁珠3次后，将其重悬于50微升2×上样缓冲液中，进行蛋白质免疫印迹分析，方法如前文所述。简要而言，等量样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，再与相应抗体孵育。使用的抗体如下：抗ATG16L1（PM040；日本MBL公司）、抗LC3（3868；美国马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号技术公司）、抗P62（ab56416；英国剑桥市Abcam公司）、抗CX50（33-4300；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市赛默飞世尔科技公司）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（60004-1-Ig；美国伊利诺伊州芝加哥市Proteintech公司）、抗ATG12（2011；细胞信号技术公司）、抗ATG5（12994；细胞信号技术公司）、抗Flag标签（F3165；美国密苏里州圣路易斯市默克公司）、抗HA标签（ab9110；Abcam公司）、抗泛素（PM040；MBL公司）以及抗MYC标签（2276；细胞信号技术公司）。使用图像分析系统对免疫印迹膜进行分析。

RNA提取与实时逆转录聚合酶链反应

按照先前描述的方法进行总RNA提取和实时逆转录聚合酶链反应。所用引物如下：

ATG16L1-F：CAGGCACGAGATAAGTCCCG，ATG16L1-R：ACTCCCCACGTTTCTTGTGT；ATG5-F：AAAGATGTGCTTCGAGATGTGT，ATG5-R：CACT TTGTCAGTTACCAACGTCA；

免疫荧光

将 HLE 细胞或斑马鱼用 4% 多聚甲醛（P1110，Solarbio）在室温下固定 15 分钟，随后在含 10% 山羊血清白蛋白和 0.4% Triton X-100（P0096，碧云天生物技术）的 PBS 中封闭 1 小时。随后，如所示，将细胞与相应的一抗、二抗以及 DAPI（C0065，Solarbio）共同孵育。使用尼康 A1 共聚焦显微镜采集共聚焦图像。

透射电子显微镜（TEM）

透射电子显微镜（TEM）操作按照先前描述的方法进行。将细胞和斑马鱼眼睛用2.5%戊二醛在4℃下固定过夜，随后用1%四氧化锇（02595-BA；SPI Chem）进行后固定，接着通过梯度乙醇和无水丙酮进行脱水处理。将组织包埋在Spurr树脂中，切片至65纳米厚度，再用2%醋酸铀（02624-AB；SPI Chem）和碱性柠檬酸铅染色。使用日立H-7650型透射电子显微镜拍摄透射电子显微镜图像。

计算筛选

人巨轴索神经蛋白结构的数据文件从AlphaFold数据库下载。移除所有杂原子后进行分子对接。由中国上海的MCE公司在HTVS、SP和XP模式下开展高通量虚拟筛选。化合物基于评分值、构象和结构多样性进行筛选。蛋白-配体相互作用通过PyMOL 1.7.4.5版本获得。

细胞热位移分析（CETSA）

将 HLE 细胞接种于 10 厘米培养皿中，并用 80 微摩尔核黄素或二甲基亚砜孵育 24 小时。加入 RIPA 裂解缓冲液，将相应的裂解液分装至 PCR 管中（100 微升）。使用热循环仪将裂解液分别在不同温度（55、60、65、70、75、80 和 85 摄氏度）下加热 5 分钟，随后在室温下冷却 3 分钟。将加热后的裂解液在 4 摄氏度、12000 倍重力加速度条件下离心 15 分钟。将上清液转移至新的离心管中，用于后续的蛋白质印迹法分析。

统计分析

数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析，以三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。采用Shapiro-Wilk正态性检验评估数据集的正态性，通过Levene检验检验方差齐性。如果数据呈正态分布时，采用Student氏t检验对两组进行比较。数据非正态分布时，则采用Mann-Whitney U检验对两组进行比较。以(^{*} p<0.05)为显著性标准。

结果

ATG16L1 对 CX50 体外及体内诱导的晶状体自噬至关重要

自噬在晶状体的细胞器降解和稳态维持中发挥着至关重要的作用。我们研究了白内障相关基因CX50对动态自噬流的影响，并使用两种不同的CX50小干扰RNA（siRNA）结合溶酶体抑制剂氯喹（CQ），检测了人晶状体上皮细胞（HLE细胞）中的自噬体形成情况。无论是否使用CQ处理，CX50敲低细胞中特征明确的自噬体标志物MAP1LC3B/LC3B的表达水平均有所降低（图1A-B）。与这一表达模式一致，我们观察到无论是否使用CQ处理，LC3斑点和SQSTM1/p62斑点的积累均显著减少，这表明HLE细胞的自噬流遭到破坏（图1C-D）。这些结果提示CX50缺乏会导致晶状体自噬功能缺陷。

基于我们之前的研究，我们推测CX50可能影响自噬体生物发生的早期阶段。我们检测了ATG12、ATG5和ATG16L1的mRNA水平，这三种是自噬体早期形成所必需的三种核心自噬蛋白，但在CX50过表达的人晶状体上皮细胞中未发现其mRNA水平有显著变化（图1E）。然而，对其蛋白水平的分析显示，CX50过表达的人晶状体上皮细胞中ATG16L1的表达升高（图1F-G）。此外，免疫共沉淀（Co-IP）实验证实了HEK293T细胞中Flag标签的CX50与HA标签的ATG16L1存在相互作用（图1H）。我们还在人晶状体上皮细胞中检测到了内源性的CX50-ATG16L1复合物，证实了二者的直接结合（图1I）。更重要的是，透射电子显微镜（TEM）结果显示，CX50小干扰RNA+ATG16L1组中出现了增大的双层膜结构聚集，这表明补充ATG16L1可挽救CX50敲低对自噬的抑制作用（图1J-K）。与透射电子显微镜分析结果一致，人晶状体上皮细胞的挽救实验表明，过表达ATG16L1可显著提高LC3蛋白水平，并恢复CX50缺乏所诱导的自噬功能障碍（图1L-M）。综上，我们的研究结果表明，ATG16L1是CX50在晶状体中诱导自噬的关键下游分子。我们之前的研究证实，cx50基因敲除斑马鱼是一种典型的白内障模型，其发病部分由自噬功能缺陷引起。我们开展了体内拯救实验，以进一步验证ATG16L1在CX50诱导的自噬过程中的作用。将ATG16L1质粒注射到cx50基因敲除斑马鱼体内，并在受精后72小时（72 hpf）评估晶状体缺陷的严重程度。如图2A和2B所示，ATG16L1的过表达有效缓解了cx50基因敲除斑马鱼的晶状体分化缺陷。透射电镜（TEM）验证了这一结果，显示ATG16L1过表达的cx50基因敲除斑马鱼晶状体中自噬体数量增加（图2C-D）。

ATG16L1 主要通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解

在哺乳动物细胞中，蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）或自噬途径进行降解。通过使用这两条通路的抑制剂，我们发现蛋白酶体抑制剂MG132可恢复ATG16L1的降解（图3A-B），表明在人晶状体上皮（HLE）细胞中，ATG16L1的更新主要由泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导。此外（图3C-D），过表达CX50的人晶状体上皮（HLE）细胞中ATG16L1的半衰期长于生理条件下的人晶状体上皮（HLE）细胞（图3E-F），而敲低CX50的人晶状体上皮（HLE）细胞则表现出更短的半衰期（图3G-H），这说明CX50可能通过影响ATG16L1的泛素依赖性降解来调控其蛋白水平。

泛素化被描述为哺乳动物细胞中通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）进行蛋白质降解的标志性事件。免疫沉淀（IP）实验结果显示，CX50的过表达显著降低了ATG16L1的泛素化水平（图4A）。cx50基因敲除斑马鱼晶状体中心出现的泛素蛋白异常积累，进一步验证了这一发现（图4B）。此前已有研究报道，不同的泛素链可能发挥不同的生物学功能[23]。为确定ATG16L1的泛素化修饰类型，我们在HEK293T细胞中共转染了HA-ATG16L1、Myc-Ub（野生型，WT）以及Myc-K48或Myc-K63质粒（图4C）。随后，通过抗K48和K63连接型多泛素化抗体检测，我们进一步证实CX50的过表达特异性降低了ATG16L1的K48连接型泛素化，而非K63连接型泛素化（图4D-E）。此外，使用K48R泛素突变体进行的免疫沉淀实验表明，CX50介导的ATG16L1泛素化过程被减弱（图4F）。综上，这些结果验证了CX50通过K48连接型泛素化抑制ATG16L1的降解，进而诱导靶蛋白的蛋白酶体降解。

图1. ATG16L1对CX50诱导的晶状体自噬至关重要。(A) 用或不用30 µM氯喹（CQ）处理6小时的阴性对照（NC）或CX50敲低的人晶状体上皮（HLE）细胞中，LC3-I/II和CX50的蛋白质印迹分析。(B) LC3水平的定量分析，n=3。曼-惠特尼检验。(C) 用或不用CQ处理的阴性对照和CX50敲低的人晶状体上皮细胞中LC3和p62斑点的代表性图像（n=3，每次实验>30个细胞），比例尺：10微米。(D) 每个细胞中LC3和p62斑点的定量分析，n=3，每次实验>30个细胞（曼-惠特尼检验）。(E-G) CX50过表达的人晶状体上皮细胞中ATG5、ATG12和ATG16L1的mRNA(E)和蛋白水平(F、G)。(H) 人胚肾293T细胞中Flag-CX50与HA-ATG16L1的免疫共沉淀（Co-IP）免疫印迹图。WCL：全细胞裂解液。(I) 人晶状体上皮细胞中CX50与ATG16L1相互作用的免疫沉淀（IP）分析。(J) 人晶状体上皮细胞的电镜照片和(K) 每个细胞自噬泡（AVs）的定量分析。黄色箭头指示自噬泡（AVs）。每次实验≥8个细胞（学生t检验分析），比例尺：1微米。(L) 转染空载体或ATG16L1的阴性对照或CX50敲低的人晶状体上皮细胞中LC3-II和HA的蛋白质印迹分析。(M) LC3水平的定量分析，(n=3) n=3。平均值±标准差，(^{*} p<0.05)、(^{*} p<0.01)。无显著差异（N.S.，曼-惠特尼检验）。

图2. ATG16L1可有效缓解cx50缺陷型斑马鱼的晶状体分化缺陷。(A) 代表性图像显示72 hpf野生型（WT）、cx50缺陷型斑马鱼以及注射空载体或ATG16L1质粒的cx50缺陷型斑马鱼晶状体中细胞核和F-肌动蛋白的分布。比例尺：10微米。(B) 各组晶状体缺陷严重程度和细胞核数量的定量分析（每组n=(n>25)条斑马鱼）。曼-惠特尼检验。(C) 72 hpf野生型（WT）、cx50缺陷型斑马鱼以及注射ATG16L1质粒的cx50缺陷型斑马鱼晶状体的电镜照片。黄色箭头指示自噬泡（AVs），比例尺：1微米。(D) 每组单位面积内自噬泡（AVs）的数量（((40 mu m^{2}))，从5个晶状体中选取≥30个细胞）。均值±标准差，(^{*} p<0.05)。N.S. 无显著性差异（曼-惠特尼检验）。

CX50过表达会减弱ATG16L1与E3泛素连接酶巨轴索蛋白的相互作用

据报道，轴突蛋白是ATG16L1唯一的E3连接酶。免疫共沉淀（Co-IP）实验显示，过表达的轴突蛋白会增强ATG16L1的泛素化水平（图5A）。然而，在体外实验中，CX50的过表达显著抑制了这一过程（图5A）。我们对CX50的ATG16L1结合结构域进行了研究，以揭示其潜在的调控机制。ATG16L1包含三个主要结构域：N端结构域、卷曲螺旋结构域（CCD）和C端WD40结构域（WDD）。我们在293T细胞中与HA标记的全长ATG16L1或四种ATG16L1缺失构建体（ATG16L1-M、ATG16L1-C、ATG16L1-△N和ATG16L1-△C）共表达Flag-CX50，并进行了CoIP实验（图5B）。如图5C所示，包含WDD结构域的ATG16L1-C和ATG16L1-△N与CX50的结合亲和力与全长ATG16L1蛋白相似，表明CX50是一种WDD-相互作用蛋白。由于已有研究报道巨轴索蛋白通过WD40结构域与ATG16L1相互作用[19]，我们探究了CX50与巨轴索蛋白之间的潜在关联。结果显示，巨轴索蛋白从ATG16L1上解离的程度与加入的CX50剂量呈正比（图5D）。这些数据表明，CX50会减弱巨轴索蛋白与ATG16L1的相互作用，进而抑制巨轴索蛋白介导的ATG16L1泛素化。

鉴定核黄素为ATG16L1泛素化的潜在调控因子

E3泛素连接酶被广泛认为是治疗多种疾病的可行药物靶点。我们利用E3连接酶轴突蛋白的晶体结构，通过对化学文库进行对接筛选，探索了其在白内障治疗中的潜在应用。研究发现轴突蛋白与核黄素之间存在潜在相互作用。如图6A所示，核黄素通过ALA522、CYS570、TYR416、ALA463、VAL321和ILE369这些氨基酸与轴突蛋白结合。随后，我们证实了二者之间存在直接的利用细胞热位移测定法（CETSA）在人晶状体上皮细胞中研究核黄素与轴突蛋白的结合情况。图6B-C显示，添加80微摩尔核黄素可提高轴突蛋白的稳定性。这些结果表明核黄素直接以轴突蛋白为作用靶点。

Co-IP 实验表明，核黄素可减弱 ATG16L1 的泛素化（图 6D）。此外，核黄素以剂量依赖性方式导致巨轴索蛋白从 ATG16L1 上解离（图 6E）。用不同浓度的核黄素检测 ATG16L1 蛋白表达和自噬活性时，观察到 ATG16L1 和 LC3 蛋白水平呈剂量依赖性升高，而 p62 水平降低（图 6F-I）。一致的是，核黄素处理显著增加了人晶状体上皮细胞中自噬体的形成（图 6J-K）。这些数据表明，核黄素可减弱 ATG16L1 的泛素化，从而提高 ATG16L1 蛋白水平，促进人晶状体上皮细胞的自噬。

图3. ATG16L1主要泛素-蛋白酶体系统降解。(A) 人晶状体上皮细胞用10微摩尔每升MG132或30微摩尔每升CQ处理6小时后进行蛋白质印迹检测。(B) LC3水平定量分析，(n=3) (^{*} p<0.05)（曼-惠特尼检验）。(C) 人晶状体上皮细胞用30微克每毫升环己酰亚胺处理指定时间，通过蛋白质印迹检测ATG16L1表达，(n=3)。(D) 定量分析相对于GAPDH的ATG16L1表达量。(E) 过表达CX50的人晶状体上皮细胞或(G) 敲低CX50的人晶状体上皮细胞用30微摩尔每升环己酰亚胺处理不同时间，(F和H) 定量分析以GAPDH为参照的ATG16L1表达水平，n = (n=) 3，均值±标准差。

图4. CX50介导ATG16L1的K48连接泛素化。(A) 向HEK293细胞中转染HA-ATG16L1或Myc-Ub，同时共转染或不共转染Flag-CX50。转染24小时后，对经MG132处理6小时或未处理的细胞，利用HA亲和凝胶进行免疫沉淀（IP），并使用抗Myc抗体分析泛素化情况。WCL：全细胞裂解液。(B) 72小时pf野生型（WT）和cx50缺陷型斑马鱼晶状体中ATG16L1和Ub分布的代表性图像。比例尺：10微米。(C-F) 向HEK293细胞中转染所示质粒24小时，利用HA亲和凝胶进行免疫沉淀（IP），再用所示抗体进行免疫印迹分析。

核黄素可缓解自噬相关白内障模型中的晶状体混浊

基于在细胞中观察到的核黄素具有前景的体外实验结果，我们对其展开了进一步研究在自噬相关白内障模型中的体内疗效。首先，我们观察到核黄素处理可促进cx50缺陷型斑马鱼的晶状体脱核和细胞骨架丢失，并缓解晶状体混浊（图7A-B）。有趣的是，(H_{2} O_{2}) 诱导的斑马鱼模型在核黄素处理后症状也得到缓解（图7C-D）。同样，在冷诱导的白内障大鼠模型中也观察到了化学挽救效果。与对照组相比，核黄素处理后透光率得到有效改善（图7E-F）。综上，这些结果表明核黄素处理可缓解多种自噬相关白内障模型的症状。

讨论

晶状体是一种透明且无血管的组织，其发育和维持依赖于细胞器的程序性降解，这一过程涉及自噬及其他复杂机制。本研究的一项重要发现是，在(c ×50)缺陷型白内障模型中，由E3泛素连接酶轴突蛋白催化的泛素-蛋白酶体系统对ATG16L1的过度降解会破坏自噬。此外，我们还发现核黄素可调控ATG16L1的泛素化，在多种自噬相关白内障模型中促进自噬并减轻晶状体混浊，这些模型包括(c ×50)缺陷型斑马鱼、(H_{2} O_{2})诱导型白内障斑马鱼以及冷诱导型白内障大鼠模型。这些研究结果表明，ATG16L1泛素化可作为白内障治疗的潜在靶点。

自噬在维持晶状体稳态方面发挥着关键作用，有助于保持其透明度。通过清除细胞器发挥作用，是对抗紫外线等因素的一种保护机制。通过敲除核心自噬蛋白或调控因子（如Atg5和TBC1D20）来破坏自噬，与白内障的发生有关。研究表明，晶状体中ATG5的缺失会导致受损蛋白和不溶性晶体蛋白积累，进而引发年龄相关性白内障]。此外，在人晶状体上皮细胞的衰老过程中，氧化应激会触发异常的自噬反应。

我们此前的研究证实，在cx50突变体斑马鱼白内障模型中，自噬缺陷会导致细胞器降解异常。本研究进一步验证了CX50缺失的人晶状体上皮细胞中自噬流和自噬体形成受损的现象。我们通过体外和体内实验证据，证实ATG16L1是CX50调控晶状体自噬的下游靶点。我们的发现与此前一项研究结果一致，该研究表明连接蛋白可与质膜上的特定自噬相关基因（ATG）产物相互作用，进而影响基础自噬功能。此外，另一种在晶状体中广泛表达的蛋白CX43，也被发现可与ATG16L1的C末端相互作用，作为自噬的负调控因子发挥作用。

图5. CX50过表达会减弱ATG16L1与E3泛素连接酶巨轴索蛋白的相互作用。(A) 向HEK293细胞转染指定质粒，通过HA亲和凝胶和蛋白质印迹分析免疫沉淀（IP）结果。(B) ATG16L1缺失构建体。(C) 在HEK293T细胞中，对CX50-Flag分别与Atg16L1-HA、ATG16L1-M、ATG16L1-C、ATG16L1-△N及ATG16L1-△C进行免疫沉淀，对免疫沉淀物进行蛋白质印迹分析。WCL：全细胞裂解液。(D) 向HEK293细胞转染CX50-GFP、ATG16L1-HA或巨轴索蛋白-Flag，培养24小时后，用抗HA抗体免疫沉淀ATG16L1-HA，通过蛋白质印迹分析结合的巨轴索蛋白与ATG16L1。

 图6. 核黄素——一种潜在的ATG16L1泛素化调控因子的鉴定。(A) 核黄素对接模型与轴突蛋白叠加图，与轴突蛋白相互作用的氨基酸以绿色棒状表示。(B) 核黄素与轴突蛋白的细胞热转移分析。(C) 轴突蛋白的熔解曲线，n=3。(D-E) HEK293细胞转染所示质粒24小时；随后用二甲基亚砜或核黄素处理细胞24小时。经HA亲和凝胶免疫沉淀的蛋白质免疫印迹结果。(F) 用二甲基亚砜或核黄素（40微摩尔和80微摩尔）处理的HLE细胞中ATG16L1、LC3和p62蛋白水平的蛋白质免疫印迹结果。(n=3)。(G-I) ATG16L1、LC3和p62水平的定量分析，(n=3)（曼-惠特尼检验）。(J-K) HLE细胞的电子显微照片及每细胞自噬泡数量的定量分析。黄色箭头指示自噬泡。每次实验统计28个细胞，比例尺：1微米。均值±标准差，(^{*} p<0.05)、(^{x} p<0.01)（曼-惠特尼检验）。

图7. 核黄素可缓解自噬相关白内障模型中的晶状体混浊。(A) 代表性图像显示72小时pf野生型、cx50缺陷型斑马鱼以及经二甲基亚砜或80微摩尔核黄素处理的cx50缺陷型斑马鱼晶状体内细胞核和F-肌动蛋白的分布。比例尺：10微米。(B) 对各组晶状体缺陷严重程度和细胞核数量进行定量分析（每组(n>25)条斑马鱼）（曼-惠特尼检验）。(C) 代表性图像显示核黄素可缓解(H_{2} O_{2})诱导的白内障斑马鱼模型中的晶状体混浊（每组(n>6)条斑马鱼）。(D) 缓解效率定量分析（曼-惠特尼检验）。(E) 代表性图像显示核黄素可缓解冷诱导白内障大鼠模型的白内障表型。(F) 透光率定量分析（每组(n>5)只大鼠）。均值±标准差，(^{*} p<0.05)。无显著差异（曼-惠特尼检验）。

值得注意的是，我们的体内实验表明，向cx50缺陷型斑马鱼中注射ATG16L1质粒可增加自噬体数量、改善细胞器降解情况并缓解白内障症状。这些发现凸显了ATG16L1在白内障形成过程中的重要性。ATG16L1是一种关键的自噬相关蛋白，在多种疾病中发挥着重要作用，从克罗恩病等炎症性肠病，到阿尔茨海默病等神经退行性疾病均有涉及。此外，靶向ATG16L1轴能够有效调节自噬，并克服癌症中的耐药性。本研究为ATG16L1参与白内障形成提供了直接证据。

泛素化是一种关键的翻译后修饰，它调控自噬相关蛋白（如Beclin1、ULK1和p62）以及控制自噬过程的关键调控因子（如AKT、mTORC1和AMPK）的活性。泛素化涉及一系列反应，包括E1、E2和E3泛素连接酶，其中E3连接酶决定底物特异性。近期研究证实，轴突蛋白E3连接酶可调控ATG16L1的泛素化，进而影响神经退行性疾病中的自噬过程。本研究发现，在人晶状体上皮细胞中，ATG16L1的降解主要通过泛素-蛋白酶体系统完成。免疫共沉淀实验结果显示，CX50与ATG16L1结合，使其与轴突蛋白分离，减少ATG16L1的K48泛素化，从而维持其在晶状体中的稳定性，这一发现揭示了晶状体稳态中自噬调控的潜在机制。

E3泛素连接酶被认为是多种疾病潜在的多药作用靶点。我们采用了在肝癌、结直肠癌等其他疾病中常用的虚拟筛选技术，发现轴突蛋白与核黄素（一种水溶性B族维生素）之间存在潜在相互作用。值得注意的是，我们的研究结果证实，核黄素可通过降低ATG16L1的泛素化水平来增加其表达，从而促进自噬，并在cx50缺陷型斑马鱼模型中挽救白内障表型。此外，我们验证了在另外两种与自噬相关的白内障模型中，核黄素治疗的效果如下：一是过氧化氢诱导的白内障斑马鱼模型，该模型的特征是氧化应激诱导的自噬紊乱被过度激活；二是冷诱导的白内障大鼠模型，在该模型中，自噬在冬眠过程中发挥保护作用。我们的研究结果表明，核黄素能有效缓解所有测试模型中的晶状体混浊。值得注意的是，有研究报道80%的白内障患者存在核黄素缺乏情况。核黄素作为一种已知无毒性的安全药物，已广泛用于圆锥角膜、唇炎和败血症等疾病的抗氧化和抗炎治疗中。我们的研究表明，核黄素有望成为白内障治疗的一种潜在替代疗法。

总之，自噬在白内障形成中发挥作用这一点已得到充分证实。我们的研究结果强调了ATG16L1泛素化在白内障发生过程中调节自噬的关键作用，为泛素-蛋白酶体系统与自噬通路之间的复杂关系提供了证据。本研究凸显了以E3泛素连接酶为靶点设计药物以调节自噬的潜力，为自噬相关疾病的治疗提供了新方向。