题目：Rapgef1 paralog-mediated regulation of Wnt/βcatenin signaling orchestrates early embryo tissue patterning and morphogenesis

原文链接:https://doi.org/10.1186/s12964-026-02905-0

期刊:Cell Communication and Signaling

摘要

RAPGEF1是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，可调控哺乳动物细胞中的信号传导和细胞骨架动态变化，但其在发育过程中的作用尚不明确，因为Rapgef1基因敲除的小鼠胚胎无法在着床后存活。本研究证明斑马鱼rapgef1为母源表达基因，其旁系同源基因rapgef1a和rapgef1b呈现组织和发育阶段特异性的剪接模式。敲除rapgef1b会导致斑马鱼出现脑和体节缺陷、颅神经嵴特化受损以及小头畸形样表型，揭示了其在形态发生和组织模式建成中此前未被发现的功能。转录组分析和差异基因表达研究表明，rapgef1b可通过调控Wnt/β-连环蛋白信号通路，在体节前中胚层和体节发生过程中发挥发育作用，为相关机制提供了新见解。Rapgef1b缺陷胚胎还出现纺锤极紊乱和染色体错误排列现象，将Rapgef1与中心体介导的有丝分裂保真度关联起来。综上，本研究证实Rapgef1b是神经嵴发育、中胚层形态发生和早期有丝分裂的关键调控因子，揭示了其在脊椎动物胚胎发生过程中的组织特异性功能。

关键词：神经发育、斑马鱼、鸟嘌呤核苷酸交换因子、rapgef1、异构体表达、体节前中胚层、Wnt信号通路

引言

鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）是激活小GTP酶的关键信号中心，可使多种效应蛋白功能调控细胞黏附、细胞骨架动态变化及信号传导。其中一种GEFs——RAPGEF1（C3G），主要以140千道尔顿的蛋白质形式表达，其模块化结构包含C端催化结构域、富含脯氨酸-rich Crk结合基序（CBR）的中央蛋白相互作用区域，以及N端E-钙粘蛋白结合结构域。RAPGEF1定位于皮质下细胞骨架、高尔基体、核斑点和中心体，并存在核质交换现象。其活性通过分子内相互作用、磷酸化等翻译后修饰以及分子间蛋白质相互作用受到严格调控。RAPGEF1通过与多种信号蛋白结合，兼具酶和支架蛋白的功能。在分子层面，它在哺乳动物细胞中与GRB2、CRK、CAS、Src家族激酶、β-连环蛋白、GSK3β以及cenexin相互作用，调控染色质组织、剪接、细胞骨架重塑和转录。RAPGEF1表达水平失调及错义突变与多种人类疾病相关，包括癌症和神经系统疾病。尽管已在小鼠中发现组织特异性的Rapgef1可变剪接异构体，但其功能仍不明确。值得注意的是，近期在成年小鼠大脑和人类脑类器官中鉴定出一种新型的大脑特异性长异构体Rapgef1。

功能丧失研究凸显了Rapgef1在发育过程中的重要性。缺失Rapgef1的小鼠胚胎干细胞表现出增强的自我更新能力，但无法进行谱系分化。此外，Rapgef1基因敲除小鼠的胚胎在着床后无法存活，这凸显了其在早期胚胎发生中的关键作用。表达人类Rapgef1等位基因的低活性小鼠在细胞黏附、血管生成和分化方面出现严重缺陷。然而，Rapgef1在细胞命运特化、谱系确定、组织模式形成和形态发生等早期胚胎事件中的作用仍未明确。

为了填补这一研究空白，我们以斑马鱼为模型探究了rapgef1的功能，斑马鱼体内存在两个该基因的旁系同源物rapgef1a和rapgef1b。有研究报道，敲低rapgef1a会引发全身性发育缺陷，包括脑部与血管异常、运动神经元缺陷以及运动能力受损。相比之下，另一个同源物的功能rapgef1b的相关功能尚未得到深入探究。本研究检测了两个旁系同源基因产生的转录本的时空表达模式，证实rapgef1a与rapgef1b均在胚胎早期表达，并揭示了二者在发育过程及成年组织中存在异构体特异性表达模式的差异。我们明确了rapgef1b在早期有丝分裂过程中，对维持纺锤极完整性、结构以及染色体精准分离具有关键作用。此外，研究结果表明rapgef1b对胚胎存活不可或缺，能够维持颅神经嵴细胞的祖细胞命运及头部大小。值得注意的是，rapgef1b还可通过调控Wnt/β-连环蛋白信号通路，参与协调体节前中胚层的模式形成与体节发生。本研究确立了rapgef1b作为胚胎早期发育关键调控因子的地位，其介导β-连环蛋白调控近轴中胚层及其衍生物的谱系特化。

结果

Rapgef1 在斑马鱼的胚胎发育过程和成体组织中均有表达。位于8号和21号染色体上的斑马鱼旁系同源基因rapgef1a和rapgef1b，其编码区同源性极高，且编码的蛋白质结构域组成相似（图1A）。这两个旁系同源基因均包含高度保守的Crk结合区（CBR），该区域存在额外外剪接的热点区域（橙色箭头，图1A）。本研究采用对应5'端（N端）序列的引物，对rapgef1a和特定基因产物1b进行扩增，以此检测rapgef1在胚胎发育过程及成体组织中的表达情况（图1B、图S1A）。这些引物可识别多种同工型，预计能分别从rapgef1a和0efd1890-e595-4ece-a2d4-3c51fe5a7bd2中扩增出130bp和167bp的产物。半定量PCR结果显示，在所有发育阶段（32细胞期至受精后2天，dpf）均扩增出预期大小的条带。研究结果表明，两个旁系同源基因的转录本在32细胞期等早期发育阶段即有表达，提示rapgef1 mRNA为母源沉积。rapgef1的表达持续至囊胚中期（256细胞期-受精后3.3小时）和体节形成期（6-21体节期），直至受精后2天（图1B）。近期有研究报道，敲低Rapgef1a会导致斑马鱼出现严重的发育缺陷，以及脑部和血管系统异常。然而，另一旁系同源基因Rapgef1b的功能目前仍未知。因此，本研究重点探究Rapgef1b这一旁系同源基因在早期胚胎发育中的功能。首先，为明确rapgef1b的时空表达模式及发育基因表达谱，我们采用了序列特异性反义核糖探针进行原位杂交（ISH）技术，结果显示rapgef1b在斑马鱼各个发育阶段均有广泛表达（红色星号，图1C），且在受精后1天（1dpf）其前端表达水平更高（红色箭头，图1C）。以有义核糖探针作为对照，证实了rapgef1b表达的特异性（图1C）。蛋白质印迹分析结果显示，在斑马鱼所有早期发育阶段，均检测到与哺乳动物细胞及组织中大小一致的150千道尔顿（150kD）Rapgef1多肽（图1D）。成年斑马鱼的脑组织中则表达出一条特异性多肽条带，这表明其存在可变剪接异构体的组织特异性表达，这一现象与此前在小鼠组织中的研究报道一致，也暗示了该异构体在神经功能中具有特异性作用（图S1B）。

图1：rapgef1及其异构体在斑马鱼胚胎发生过程和成体组织中的表达谱。A：示意性图解显示zRAPGEF1a和zRAPGEF的蛋白质结构域1b，三角形（橙色）表示CBR区域中额外外显子的热点。数字表示总氨基酸和备用异构体中额外氨基酸的插入位置。B：Rapgef1a和1b5'端与引物位置（黑色箭头）和外显子编号的示意性表示。不同发育阶段 rapgef1a 和1b转录本的RT-PCR分析。斑马鱼rpl7（核糖体蛋白L 7）是加载对照。NTC表示没有模板对照。C：全安装RNA原位杂交显示在早期发育期间rapgef1b表达。比例尺，200µm。D：蛋白质印迹显示胚胎发育期间Rapgef1水平。βTubulin和Gapdh用作加载对照。E：rapgef1a和b外显子的示意图，展示了 rapgef1a 和1b的预测可变剪接转录本（核苷酸ID：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）。图中显示了异构体特异性引物的位置（黑色箭头），这些引物根据可变剪接异构体中额外外显子的有无，扩增出不同长度的产物。F：使用 rapgef1a 和1b异构体特异性引物，对不同发育阶段的rapgef1转录本进行RT-PCR分析。β肌动蛋白作为加载对照。G：在成年组织（脑、心脏、肝脏、卵巢、鳍、肌肉）中对rapgef1a和1 b转录本进行的异构体特异性扩增。斑马鱼rpl7作为加载对照。NTC代表无模板对照。

胚胎和成体组织中rapgef1旁系同源物的异构体特异性差异表达

成年斑马鱼脑中高分子量Rapgef1同工型的表达（图S1B）表明，可能存在包括一组盒式外显子在内的可变同工型的产生。斑马鱼rapgef1转录本的长度分别为3257bp（rapgef1a）和3566bp（rapgef1b），最长的变体分别由25个外显子（rapgef1a）和28个外显子（rapgef1b）组成。NCBI等公开数据库显示，通过包含一对外显子（rapgef1a中的10号和11号外显子，rapgef1b中的12号和13号外显子）可产生可变剪接同工型。研究可变同工型的表达时，使用了针对rapgef1a和1b的同工型特异性引物，这些引物根据一个或两个外显子的包含情况，预期能扩增出不同大小的PCR产物（图1E）。缺少额外外显子的rapgef1a转录本（X4，405bp扩增产物）在整个胚胎发育过程中均有表达，直至早期体节形成期（6体节阶段）（图1F）。有趣的是，rapgef1a包含1个或多个外显子的长同工型（X3-498bp、X2-570bp、X1-633bp扩增子）的表达始于晚期体节形成期（18-21体节阶段）（图1F）。包含10号和11号外显子的最长同工型主要在幼鱼头和成年脑中表达，其他产物的表达较弱，这表明rapgef1a在成年脑中具有同工型特异性功能（图S1C）。成年期的其他组织，如卵巢、心脏、肝脏和肾脏，除胚胎型同工型外，还表达多种同工型（图1G）。

相比之下，直到2天胚胎期（2dpf），仅表达rapgef1b缺乏外显子12和13的最小亚型（X5，200bp扩增子），且其表达水平会随胚胎发育而降低（图1F）。值得注意的是，存在动态的亚型转换现象，这使得幼体和成体大脑中表达rapgef1b的大脑特异性长亚型，该亚型包含外显子12和13。随年龄增长而变化（图S1C）。心脏、肝脏、卵巢和肾脏等成体组织主要表达缺乏盒式外显子的异构体，未检测到rapgef1b较长转录本的存在（图1G）。我们还通过序列特异性反义核糖探针进行原位杂交（ISH），研究了脑特异性异构体的表达模式（图S1D）。在3天受精期（3dpf）的幼虫中，rapgef1b（针对外显子3和4的反义核糖探针）在间脑（双红色星号）、视杆细胞和视锥细胞（红色箭头）、神经节细胞层（红色箭头头）、肠道以及肌节（红色星号）中均有表达（图S1D）。相比之下，脑特异性异构体的表达仅局限于间脑和眼睛的神经节细胞层，在视杆细胞、视锥细胞和肌节中则无表达（红色箭头，图S1D）。因此，rapgef1b脑特异性异构体的表达仅限于头部区域，在肌节等中胚层来源的组织中不存在。

Rapgef1b 缺失会导致神经发育及前后轴模式建成缺陷

为确定rapgef1b在胚胎发生过程中的功能作用，我们采用了两种功能缺失策略：一是利用序列特异性反义吗啉代寡核苷酸（ATG/翻译阻断剂）进行敲低，二是针对zRapgef1b开展基于CRISPR的敲除策略。我们采用吗啉代敲低法实现基因表达的快速有效敲低，以探究其在胚胎发生中的发育功能。此外，鉴于基于吗啉代的敲低策略可能引发脱靶效应，我们又采用了基于CRISPR的基因编辑方法，构建crispant（F0代）以验证吗啉代 morphant 的表型（图2）。注射ATG阻断剂吗啉代的rapgef1b morphant 以及rapgef1b crispant 均表现出Rapgef1蛋白的耗竭。rapgef1b敲除鱼出现366bp的片段缺失，证实其基因表达被有效敲除（图2C、图S2A）。两种策略均产生了相似的表型，morphant 表型分为P0（正常，与野生型WT一致）、P1（脑部和体轴缺陷）和P2（严重的脑部与体轴畸形）三类（图2B、图2D、图S2D）。两种策略介导的rapgef1b耗竭均导致受精后24小时胚胎出现脑、眼和内耳发育缺陷。P2型胚胎体积更小，眼部发育不良，脑结构存在异常，且缺乏正常的中脑-后脑边界（红色星号，图2B）。crispant 与morphant 还表现出体节缺陷（红色箭头，图2B）以及前后体轴异常，特征为体轴缩短、尾部变短（红色箭头，图2B）。本研究中，我们选取发育时间匹配、表型严重程度归为P2的胚胎进行对比基因表达分析。我们观察了表型严重程度及存活率与吗啉代浓度的关系随时间呈现出相应变化（图S2B、S2C）。为确定该表型是Rapgef1b敲低所特有的，我们通过导入人源rapgef1 mRNA进行了拯救实验，结果实现了对严重表型的部分但显著的拯救（39%），即P2表型（图2D、E）。相比之下，人源rapgef1 mRNA的预测有害突变体Y485C（Mutagenetix与ClinVar数据库收录），其对应残基在斑马鱼Rapgef1中高度保守，且该突变体存在稳定性改变、Abl介导的磷酸化受损的情况（本实验室未发表结果），无法拯救rapgef1b特异性表型（图2D、E）。这些结果表明，rapgef1b对大脑、眼睛、体节的早期发育和形态发生，以及身体轴和尾部的伸长至关重要。

图2：Rapgef1b 对大脑和前后轴的发育至关重要。A：分别通过吗啉代和基于CRISPR-Cas9的方法实现rapgef1b敲低和敲除策略的示意图。吗啉代结合翻译起始位点，阻断蛋白质合成。单导向RNA（sgRNA）被设计用于在外显子3和4之间产生366bp的缺失。B：与1天龄（1dpf）对照胚胎相比，展示吗啉代和CRISPR策略下rapgef1b耗竭胚胎总体形态外观的代表性图像，图中标注了中脑-后脑边界（红色星号）和体轴缺陷（红色箭头）。框选区域展示了中脑-后脑缺陷（红色星号）和体轴缺陷（红色箭头）的缺陷放大图像。比例尺为500微米。C：上图通过蛋白质印迹法显示了rapgef1b吗啉代寡核苷酸注射的 morphant 胚胎和rapgeflb CRISPR 突变体中Rapgef1的水平，并与野生型（WT）对照组进行对比。β-微管蛋白作为上样对照。下图展示了基于PCR的分析，以验证CRISPR突变体中的外显子缺失。D：量化结果显示了拯救实验中morphant胚胎的表型百分比。数据以平均值±标准误（SEM）呈现，实验重复了n=3次生物学重复，每次实验至少分析了60个胚胎。E：拯救实验证实了人类Rapgef1作为斑马鱼胚胎中rapgef1b直系同源基因的功能等效性。

Rapgef1b 对维持颅神经嵴的祖细胞命运、颅神经嵴衍生物的形成以及头部大小的维持至关重要。由于 rapgef1b 在发育早期表达，且其敲低会导致脑部和前后轴异常，我们推断 rapgef1b 是早期神经发育和轴特化所必需的。为验证这一假设，我们对 rapgef1b  morphants（吗啉代寡核苷酸敲低胚胎）和 crispants（CRISPR 敲除胚胎）中关键的颅神经嵴特化标志物及模式形成相关基因进行了基因表达分析。这些敲低/敲除胚胎中，神经嵴特化标志物 twist1a（红色星号，图3A）和神经板标志物 sox2（红色箭头，图3D）的表达均显著降低。Twist1a 表达于颅神经嵴来源的头部间充质和间脑，对神经嵴细胞的迁移及其分化至关重要。Sox2 参与耳基板和上鳃基板的诱导，维持细胞多能性，并调控感觉上皮和神经管的发育。twist1a 和 sox2 表达的显著降低强烈表明，rapgef1b 在维持颅神经嵴和感觉基板的祖细胞群中发挥关键作用，并参与神经管的模式形成。我们还观察到，迁移前神经嵴标志物 sox10 的表达降低（红色箭头，图3B）。而向敲低胚胎中注射人 Rapgef1 mRNA 后，sox10 的表达得到恢复（红色箭头，图3B）。这些结果表明，敲低胚胎中以 sox10 表达为标志的迁移前神经嵴细胞数量减少，这可能是脑部发育不良的潜在原因（图2B）。吖啶橙染色结果显示，胚胎前部区域（前脑、中脑-后脑边界/中脑-后脑交界区及中脑）的细胞死亡增加（白色星号，图S3A）。

Pax家族成员是细胞特化、分化和形态发生的其他关键调控因子。Pax2a在眼睛、中脑-后脑边界、耳基板和原肾中表达。Pax2a与pax8共同参与维持耳细胞命运，且高浓度的pax2a会促进耳细胞分化。rapgef1b敲低型胚胎中，Pax2a在眼睛、耳泡和中脑-后脑边界的表达区域出现扩张（红色星号，图3C）。由此可见，rapgef1b对维持祖细胞命运至关重要，其缺失会导致pax2a等分化诱导信号的水平升高。同时，我们还观察到egr2b的表达上调，egr2b是分节后脑的菱节3和菱节5特化因子（图S3B）。我们还探究了rapgef1b是否对神经元分化具有关键作用。神经元核抗原（NeuN）定位于成熟中枢神经系统神经元的细胞核，可标记有丝分裂后神经元。因此，NeuN是神经元终末分化和神经元表型确定的标志。敲低型胚胎中NeuN阳性细胞数量减少（白色星号，图3E），这表明rapgef1b缺失会导致有丝分裂后成熟神经元数量减少，充分证明了其在神经元终末成熟和分化过程中的必需作用。

在发育的幼虫阶段（受精后4-5天），rapgef1b 敲低胚胎表现出心脏水肿、严重的颅面骨骼异常以及角鳃骨骨骼结构缺陷（红色星号，图3F）。颅面骨骼结构源自 sox10 阳性的颅神经嵴，间充质则源自生骨节和侧板中胚层。rapgef1b 敲除的胚胎中 sox10 阳性神经嵴细胞数量减少，这可能是观察到的颅面缺陷的潜在原因。此外，受精后5天的幼虫还表现出与小头畸形相关的颅面特征，如整体头部面积（HA）、瞳间距（IPD）和虹膜间距（ID）减小（图3G），这表明 rapgef1b 在胚胎颅面骨骼的形成以及整体头部大小的维持中发挥关键作用。

图3：Rapgef1b 对颅神经嵴特化及头部大小维持至关重要。1天龄时对照组和rapgef1b morphants/突变体中通过原位杂交进行的基因表达分析。A：对照组和rapgef1b morphants/突变体中Twist1a的表达（红色星号）。B：rapgef1b morphants、突变体（红色箭头）和拯救胚胎（红色箭头头）中sox10的表达。比例尺，200微米。C：rapgef1b morphants/突变体中Pax2a的表达，显示在视泡、中脑-后脑边界（红色星号，插图）和耳泡（插图）中的表达。D：rapgef1b morphants神经管中sox2的表达（红色箭头）。比例尺，200微米。E：对照组和rapgef1b morphants中后有丝分裂神经元标志物neuN的表达（白色星号）。比例尺，200微米。F：rapgef1b morphants的骨骼制备（红色星号，插图），分别使用茜素红S和阿尔辛蓝对骨骼和软骨进行染色。比例尺，500微米。G：rapgef1b morphants中小头畸形特征的定量分析——头部面积（HA）、瞳间距（IPD）和虹膜间距（ID）。所有数据均以平均值+标准误均值表示。*p<0.05、**p<0.01、p<0.001为生物学重复实验，每张图片中标注了样本量。

Rapgef1b 在体节中胚层分化中发挥重要作用

为进一步探究rapgef1b的发育功能，我们进行了转录组测序分析，以鉴定rapgef1b morphant中差异表达基因（DEGs）以及导致观察到的表型的改变过程和通路。主成分分析（PCA）和相关矩阵显示了三种重复样本在不同条件下的变异和一致性（图S4A、B）。火山图展示了差异表达基因的分布——有76个基因下调，106个基因上调在假发现率校正后的p-value <=0.05范围内，rapgef1b缺陷胚胎的转录水平呈现出清晰的聚类模式（图4A）。图中列出了发生改变的差异表达基因，并标注了其P值（图S4C）。我们还进行了基因本体（GO）通路分析，以进一步探究差异表达基因之间的功能关联。基因本体分析显示，前/后模式特化、体节发育、体节形成及中胚层形态发生相关基因显著富集，表明rapgef1b在体旁中胚层的特化、模式形成与分化过程中发挥关键作用（图4B）。热图展示了上述过程中筛选出的上调和下调基因（图4C）。为验证转录组分析结果，我们检测了对照组和rapgef1b morphant（吗啉代敲低胚胎）中部分上调及下调基因的转录水平（图4D-H）。rapgef1b morphant中上调基因组（msgn1、tbx16、cdx4、tbx6和bbc3）的转录水平有所升高。Msgn1和tbx16通过降低祖细胞维持标志物fgf8和ntl的表达，并诱导tbx6的表达，从而启动体节前中胚层（PSM）细胞的分化程序。因此，msgn1对于在体节形成完成前调控祖细胞库数量至关重要。Rapgef1b morphant中msgn1和tbx16表达上调（图4D，红色星号；图4E）。我们观察到morphant中tbx6转录本整体水平升高，尤其是在尾芽区域（红色箭头，图4E）。Tbx6在体旁中胚层特化、体节模式形成及肌发生过程中发挥重要作用。研究表明，异位表达tbx6会促进中胚层命运的形成。Tbx6表达水平的这种升高会导致中胚层命运减弱，这可能是尾芽中胚层体节形成失败的潜在原因。综上，转录组分析显示rapgef1b morphant中msgn1和tbx16上调，表明rapgef1b缺失后，祖细胞命运受到抑制，且未到时机的分化程序被启动（图4D、4E）。

早期中胚层细胞命运也受Cdx家族调控，该家族还在轴伸长、前后模式形成以及躯干和尾部的发育中发挥关键作用(52)。体节中胚层的分化和体节发生还需要其他Tbx家族成员，以及Wnt和FGF信号通路。Cdx4也是早期躯干神经嵴的特化因子，在躯干神经嵴细胞祖细胞和发育中的尾芽中表达。有趣的是，转录组分析、qPCR和原位杂交结果显示，敲除rapgef1b的胚胎中Cdx4的转录水平上调（图4C、4D，红色星号；图4E），这表明形态缺陷胚胎中的躯干神经嵴细胞维持在祖细胞命运。这使我们得出结论，rapgef1b对于启动分化至关重要在神经嵴细胞群体中的命运。我们的研究结果表明，rapgef1b 对于维持颅神经嵴的祖细胞命运至关重要（图3），然而，它对于中胚层谱系分化命运的起始是必需的（图4）。

我们在转录组分析和qPCR验证中还观察到bbc3等内源性凋亡基因的上调（图4F） 。因此，rapgef1b morphant（吗啉代敲低胚胎）中促凋亡的mRNA表达上调，导致凋亡细胞数量增加，这一现象在rapgef1b morphant的头部区域也通过吖啶橙染色得到了印证（图S3A）。相比之下，rapgef1b morphant中myhc4、myoz1b和pvalb1等骨骼肌基因的转录水平降低（图4G）。此外，所有体节边界形成所必需的her13在morphant中也出现了下调（图4H）。上述基因的表达差异很可能是rapgef1b morphant体节结构异常的根本原因（红色箭头，图2B）。综上，转录组分析表明rapgef1b在体节（近轴）中胚层的发育过程中发挥关键作用，且可能对其衍生组织的发育也具有重要意义。

图4：比较转录组和差异基因表达分析表明rapgef1b在旁轴中胚层分化中的作用。A：对照组和rapgef1b morphant中差异表达基因（DEGs）的火山图。红点代表倍数变化为>1 or <-1且p-value <0.05的差异表达基因。绿圆点代表具有显著倍数变化的基因，倍数变化编号为>1 or <-1；蓝色圆点代表具有不显著倍数变化的基因，倍数变化编号为p-value >0.05和p-value <0.05。黑色圆点代表根据p值和对数倍数变化标准，差异表达基因（DEGs）表达水平不显著的基因。B：展示在rapgef1b形态发生缺陷的胚胎中上调基因的基因本体论（GO）分析的点图。C：对照组和rapgef1b形态发生缺陷的胚胎中差异表达基因（DEGs）的热图。颜色映射至每个基因集的对数倍数变化的z分数标准化值。D：通过qPCR验证rapgeflb敲低后msgn1、tbx16、cdx4和tbx6的表达情况。数据以平均值±标准误（SEM）表示，实验重复次数分别为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001次。***p<0.001。每个生物学重复实验的样本量n=3。E：与对照组相比，rapgef1b形态发生缺陷的胚胎中cdx4（红色星号）、tbx6（红色箭头）、msgna1（红色星号）和tbx16（红色星号）的基因表达模式。比例尺为200微米。F：通过qPCR验证rapgef1b敲低后bbc3的表达情况。G：通过qPCR验证rapgef1b敲低后myhc4、myoz1b和pavlb1的表达情况。H：通过qPCR验证rapgef1b敲低后her13的表达情况。所有数据均以平均值±标准误（SEM）表示，实验重复次数分别为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001次。每个实验的样本量n=n=3。每个n代表100个胚胎。

Rapgef1b 参与前体体节中胚层模式形成与体节发生

转录组分析显示，rapgef1b 在体节发生和中胚层发育中发挥重要作用。因此，我们检测了1天龄斑马鱼胚胎（1dpf）中rapgef1b 敲低胚胎的体节发育及生肌程序。鬼笔环肽568染色结果显示，rapgef1b 敲低胚胎中F-actin阳性肌纤维出现破坏（图5A）。为确定rapgef1b 在肌发生和体节模式建成中的作用，我们检测了敲低胚胎中myoD1的表达情况。MyoD1在体节中表达，是建立和维持体节来源肌肉祖细胞谱系所必需的。Rapgef1b 敲低胚胎的体节组织和结构存在缺陷。与对照组中规则且清晰的体节边界（红色虚线，图5B）相比，敲低胚胎的体节体积增大、形态不规则，边界不完整（红色箭头，图5B）。而注射人源rapgef1 mRNA的敲低胚胎中，这些体节缺陷得到了挽救（图5B）。我们还检测了体节中胚层的模式建成情况。Tbxta在早期发育过程中的中胚层以及形成躯干和尾部脊髓与近轴中胚层的神经中胚层祖细胞中表达。在发育后期，tbxta的表达仅局限于脊索和尾芽。1dpf的敲低胚胎出现脊索缺陷，且尾芽中tbxta的表达范围扩大（红色箭头，图5C）。其表达呈弥散且紊乱状态

在体节形成早期也观察到了体节边界（红色箭头头，图5D），同时伴随节段性myoD1表达的缺失（红色星号，图5E）。我们还观察到芽期时体节前体中myoD1的表达降低，这表明rapgef1b的敲低会导致体节前中胚层模式形成受损（红色箭头，图5E）。此外，我们在芽期和6体节阶段也观察到tbxta表达范围扩大（红色箭头，图5F），这说明形态缺陷胚胎中神经中胚层前体细胞群得以维持，而rapgef1b是诱导中胚层分化所必需的。

体节由 presomitic 中胚层（PSM）在振荡基因网络的调控下分节形成，该网络涉及 her 基因、Wnt、Notch 以及成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路。her1 与 her7 在 PSM 和尾芽中以两条条纹的模式表达，是体节形成的关键基因。her 基因缺陷的胚胎会出现体节增大、边界薄弱的表型。这两个基因存在部分功能冗余，其中 her1 对前部体节的形成至关重要，her7 则对后部体节的形成起关键作用。与对照组相比，rapgef1b  morphants 胚胎中 her1 在前部体节的表达以两条条纹的模式缺失（红色星号，图5G）。在发育后期，胚胎尾部区域的 her1 表达也有所降低（红色箭头，图5G）。我们还观察到体节和 PSM 中 her7 的表达量下降（红色箭头，图5H）。由此可见，her1 与 her7 分节条纹的消失表明 rapgef1b  morphants 胚胎 PSM 中的分节钟被破坏。原肠胚期在背部中胚层细胞中表达的 papc 参与了细胞的汇聚运动以及 PSM 的形成。morphants 胚胎中前部体节（红色星号、红色箭头，图5I）和 PSM 区域的 papc 表达完全缺失（红色箭头，图5I）。此外，在体节期，morphants 胚胎尾芽中无法检测到近轴中胚层的 papc 阳性细胞（红色箭头，图5I）。rapgef1b 敲低胚胎中 papc 的表达下调，提示中胚层的汇聚运动受损，最终导致体节发育异常。另一个 PSM 标志物 fgf8 在 PSM 成熟和体节形成过程中发挥关键作用。rapgef1b  morphants 胚胎在芽期时，中脑-后脑边界处的 fgf8 表达区域扩大（红色星号，图5J）。发育后期，后部体节体积增大、边界不完整（红色箭头），头部区域（双红色星号）和尾芽（红色箭头，图5J）的 fgf8 表达范围也出现扩张。综上，rapgef1b 对 PSM 的模式建成、分节钟基因的表达以及体节的结构形成均不可或缺。

图5：Rapgef1b耗尽导致有缺陷的体节形成和涉及前胚层规范的基因的失调。A： 1dpf对照和形态胚胎中的Phalloidin染色。插图显示了F肌动蛋白肌纤维的组织。B：1dpf处的myoD1表达，显示了形态和救援胚胎的体节结构（红色箭头，插图中的红色虚线）。比例尺，200μm。C：rapegf1b形态的脊索和尾芽（红色箭头）中的Tbxta表达1dpf。比例尺，200微米。D：6体节期对照组和rapgef1b morphant的明场图像（红色箭头）。E：6体节期（红色星号）和芽期（红色箭头）对照组及morphant中myoD1的表达。F：芽期（红色箭头）和体节期（红色箭头）tbxta基因的表达。比例尺，200微米。G：6体节期对照组和rapgef1b morphant前体节中her1的表达（红色星号），以及18体节期尾部体节前体中PSM的表达（红色箭头、红色星号）。H：体节发生早期对照组和rapgef1b morphant中her7的表达，显示前体节中表达降低（红色箭头）。I：6体节期对照组和morphant前体节中papc的表达模式（红色箭头、红色星号）、PSM（红色箭头），以及18体节期PSM（红色箭头）。J：芽期对照组和morphant中中脑-后脑边界（红色星号）的Fgf8表达模式，以及14体节期头部（双红色星号）、体节（红色箭头）、尾芽（红色箭头）的Fgf8表达。

Rapgef1b通过调控经典Wnt信号通路调节中胚层特化 为探究观察到的体节中胚层缺陷上调的潜在原因，我们检测了rapgef1b吗啉代寡核苷酸处理胚胎中的Wnt/β-连环蛋白信号通路。Wnt信号通过β-连环蛋白/LEF1/TCF通路参与中胚层诱导、体节形成和模式建成。经典Wnt信号通路的阻断会损害体节发生和体节前分节过程。事实上，在囊胚中期，我们观察到间期和有丝分裂期细胞核与皮质中Wnt信号效应分子β-连环蛋白的水平降低（白色星号，图6A）。蛋白质印迹分析显示，rapgef1b吗啉代寡核苷酸处理胚胎中磷酸化GSK-3β（丝氨酸9）的水平降低，这表明其激酶活性增强，进而导致磷酸化β-连环蛋白（丝氨酸33/37）的水平升高（图6B）。因此，处理胚胎中总β-连环蛋白的水平下降（图6B），提示经典Wnt信号通路下调。此外，rapgef1b敲低的胚胎中Wnt效应因子轴蛋白2的蛋白水平也降低（图6B）。Wnt效应因子轴蛋白2、LEF1和细胞周期蛋白D1的转录水平在处理胚胎中同样降低，表明经典Wnt反应整体下调（图S3F）。以往研究表明，体外培养的哺乳动物细胞中，RAPGEF1定位于中心体并调控中心粒的正常复制。因此，我们在囊胚中期检测了rapgef1b在胚胎有丝分裂过程中对中心体动态的作用。γ-微管蛋白染色（白色星号，图6C、S3E）和中心蛋白3染色（图S3C）分别显示，处理胚胎存在严重的中心体和中心粒缺陷。由此可见，rapgef1b是早期胚胎有丝分裂过程中维持纺锤极完整性、中心体结构和组织所必需的（图6C）。rapgef1b敲低的胚胎还表现出纺锤体长度延长（红色虚线，图6C）和中期染色体列队异常（图6C）。这些缺陷可能导致rapgef1b吗啉代寡核苷酸处理胚胎的有丝分裂进程受损和染色体不稳定性。有丝分裂进程关键基因 plkl 的转录水平整体降低也证实了这一点（图S3D），该基因对有丝分裂进程、染色体的忠实分离以及纺锤体的正常组装至关重要。值得注意的是，向rapgef1b吗啉代寡核苷酸处理胚胎中注射人β-连环蛋白mRNA后，γ-微管蛋白染色显示中心体周围缺陷得到部分挽救（白色星号，图6D）。这些结果表明，rapgef1b的中心体功能，尤其是纺锤极完整性的维持，是由Wnt/β-连环蛋白信号通路介导的。

为了进一步探究中胚层模式形成中rapgef1b介导的Wnt信号通路，我们将吗啉代注射的胚胎暴露于Wnt激活剂CHIR99021或Wnt抑制剂XAV939中（图6E）。暴露于XAV939的吗啡啉修饰胚胎出现P1和P2表型的数量增加（红色箭头，图6E），而CHIR99021的给药可逆转这一现象，与导入人rapgef1 mRNA的效果相似（蓝色箭头，图6E）。此外，在注射了rapgef1 mRNA的rapgef1b敲低胚胎中，体节中胚层特化因子tbx6的表达也得到恢复（红色星号，图6F），CHIR99021处理后该表达进一步回升（双红色星号，图6F）。相反，用XAV939处理的rapgef1b敲低胚胎，tbx6的表型表达出现叠加效应（红色箭头，图6F）。在18体节期（体节发生的后期阶段），也在rapgef1b吗啡啉修饰胚胎中观察到体节缺陷（红色星号，图6G、H）。Wnt抑制剂处理后，体节缺陷的严重程度加剧，进一步证实了rapgef1缺失与减弱的Wnt信号通路之间存在协同作用（双红色星号，图6H）。Wnt激活剂处理后，体节的组织和结构得以恢复（红色箭头，图6H）。此外，Wnt信号通路的抑制还会导致轴突伸长减少，这与rapgef1b吗啡啉修饰胚胎中Wnt信号减弱的结果一致。综上，rapgef1b的敲低会降低经典Wnt/β-连环蛋白信号通路，这是中胚层模式形成受损和体节缺陷的根本原因。

图6：Rapgef1b在胚胎早期发育过程中通过调控Wnt/β-连环蛋白信号通路发挥功能。蛋白质免疫印迹分析显示 Rapgef1、Gsk3β/磷酸化 Gsk3 beta 水平，以及 A：256 细胞期对照组和 rapgef1b  morphant 胚胎共聚焦图像的最大投影图，显示间期（上图）和有丝分裂期（下图）的β-连环蛋白（白色星号）。比例尺为 50 微米。每个实验对应 n=3。每个 n 代表 50 个胚胎 B。对照组和rapgef1b morphant胚胎中β-连环蛋白/磷酸化β-连环蛋白的水平。β-微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为上样对照。C：256细胞期对照组和rapgef1b morphant胚胎的共聚焦最大投影图像，显示γ-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色/4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的中心体染色。定量分析rapgef1b morphant与对照组相比的纺锤体长度（红色虚线）和染色体列队缺陷。比例尺为50微米。所有数据以平均值±标准误表示。每个实验对应*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、n=3。每个n代表40个胚胎。D：注射rapgef1b吗啉代寡核苷酸和β-连环蛋白mRNA的256细胞期胚胎的共聚焦最大投影图像，显示γ-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色/4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的中心体染色（白色星号）。注射β-连环蛋白mRNA的胚胎作为对照。比例尺为50微米。定量分析rapgef1b morphant与对照组相比的纺锤体极完整性（白色星号）。所有数据以平均值±标准误表示。每个实验对应*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、n=3。每个n代表40个胚胎。E：定量分析Wnt激活剂和Wnt抑制剂处理后morphant的表型百分比。F：对照组、rapgef1b morphant、Wnt抑制剂和激活剂处理的morphant中tbx6的基因表达模式（红色星号、红色箭头）。仅用Wnt激活剂和仅用抑制剂处理的野生型胚胎作为阳性对照。G：18体节期对照组和rapgef1b morphant的明场图像（红色星号）。H：对照组、rapgef1b morphant、Wnt抑制剂和激活剂处理的morphant中myoD1的基因表达模式（红色星号、红色箭头）。仅用Wnt激活剂和仅用抑制剂处理的野生型胚胎作为阳性对照。所有数据以平均值±标准误表示，每个生物学重复实验对应n=3。每个n代表20个胚胎。

讨论

胚胎发生的特征是动态的时空基因表达，这种表达驱动祖细胞的命运特化和后续的分化。Rapgef1 可调控细胞黏附、细胞骨架组织和细胞增殖，因此很可能在胚胎发育中发挥关键作用。然而，它在胚胎发生中的确切作用仍不明确，这主要是因为鼠类 Rapgef1 缺失的胚胎无法在着床阶段之后继续发育。因此，我们以斑马鱼胚胎为研究对象探究 rapgef1 的功能，斑马鱼中有两个旁系同源基因 rapgef1a 和 rapgef1b。敲低 Rapgef1a 会导致斑马鱼存活率下降、血管生成和中枢神经系统发育出现明显的形态缺陷，同时运动能力降低。这些斑马鱼旁系同源基因可能具有独特以及重叠的功能，但目前尚不清楚 rapgef1b 在各类生物过程中的作用。

我们发现这两个旁系同源基因均经历组织和阶段特异性的可变剪接，在发育转变过程中可观察到异构体转换。与 rapgef1a 不同，rapgef1b 的短异构体在各个发育阶段均特异性表达，这强烈表明其在早期发育过程中具有独特且不重叠的功能（图1E）。此外，短型 rapgef1b 异构体在大脑发育的增殖阶段占主导地位，而含有盒式外显子的较长同工型在分化已完成的成体大脑中富集。带有盒式外显子的较长同工型在分子内相互作用上存在差异，据预测这种差异会改变鸟苷酸交换因子（GEF）的活性。这种时间和组织特异性的同工型表达，为胚胎发生过程中微调Rapgef1介导的信号传导以及GTP酶调控提供了一种机制。脊椎动物中剪接热点的进化保守性进一步证实了不同同工型之间的功能差异。这也凸显了本研究目前存在的一些局限性，因为目前尚无针对同工型的特异性试剂（如抗体）。未来采用同工型特异性试剂开展的研究，对于解析这些转录本在胚胎发育中的独特作用和冗余功能，以及阐明其进化意义至关重要。由两个旁系同源物产生的同工型在时间表达上的差异，可能是由于两个连锁群上存在不同的调控元件所致，这表明它们的产物发挥着独立的作用。

本研究首次证实rapgef1b对颅神经嵴和体节中胚层的谱系特化至关重要（图7）。本研究采用CRISPR-Cas9介导的基因敲除和吗啉代敲低技术，发现rapgef1b缺失会破坏早期胚胎发生，引发神经发育异常和前后轴伸长缺陷（图2）。Rapgef1b基因敲除胚胎和吗啉代敲低胚胎中，神经嵴特化基因twist1a和sox10的表达水平降低，细胞凋亡增加，最终导致头部体积缩小。Twist1a和sox10是未分化颅神经嵴的标志物，可调控祖细胞库的特化、维持及迁移过程。而sox10的缺失会引发细胞凋亡，使其无法分化形成中枢神经系统及颅神经嵴来源的颅面骨骼。 除调控神经嵴细胞特化外，rapgef1b在神经嵴衍生物的形成过程中也发挥关键作用。研究观察到，敲低胚胎和基因敲除胚胎中均未出现神经嵴来源的黑素细胞（图2、3）。转录组分析也显示，与黑素细胞分化和色素沉着相关的基因存在差异表达（图S4D）。Rapgef1b敲低胚胎出现严重的颅面畸形，这可能由心脏水肿以及sox10表达降低导致其无法分化形成颅面骨骼和软骨所致。此外，rapgef1b的缺失还会引发有丝分裂异常，包括斑马鱼囊胚中纺锤体极完整性受损和染色体分离错误。已有研究表明，中心粒扩增会影响斑马鱼神经祖细胞的增殖与存活。这些结果表明，rapgef1的中心体功能在胚胎发育过程中同样具有保守性。斑马鱼中的有丝分裂，其方式与小鼠和人类细胞中的类似。总之，rapgef1b  morphant 中神经嵴基因表达的降低，再加上凋亡的增强，可能是有丝分裂受损的结果。头部变小、瞳间距缩短、有丝分裂异常以及凋亡增加，都表明rapgef1b  morphant 存在类似小头畸形的表型。综合来看，这些研究结果表明，Rapgef1b 是维持颅神经嵴细胞祖细胞特性以及在早期发育过程中维持有丝分裂保真度所必需的。此外，必须阐明胚胎大脑中 Rapgef1b 对有丝分裂的调控机制，以深入了解其神经发育功能的分子机理。

图7：rapgef1b调控斑马鱼胚胎发生过程中神经嵴的维持、有丝分裂保真度及体节中胚层分化。rapgef1b在早期发育中功能的示意图总结。左侧（蓝色部分）：rapgef1b维持神经嵴祖细胞，并支持神经管与中脑-后脑边界（MHB）的模式建成（涉及twist1a、sox10、pax2a、sox2基因），这些过程参与颅面骨骼发生与神经元分化（涉及sox2、NeuN基因）。中间（橙色部分）：rapgef1b保证有丝分裂的保真性与纺锤极的完整性（涉及cen3、plk1基因），实现细胞存活并维持头部正常大小（涉及sox10、bbc3a基因）。右侧（绿色部分）：rapgef1b调控经典Wnt/β-连环蛋白信号通路，进而调节体节中胚层（PSM）的模式建成（涉及msgn1、tbx16、her1、her7、papc、tbxta、fgf8基因）、体节发生（涉及tbx6、myoD1、her13、fgf8基因）以及肌源性分化（涉及myhc4、myoz1b、pvalb3基因）。综上，这些研究结果证实rapgef1b是连接祖细胞维持、有丝分裂调控与中胚层组织分化的关键调控因子。

除中枢神经系统外，我们的RNA测序和表达分析表明，rapgef1b还调控着体节中胚层模式形成、体节发生和轴突形成。与果蝇中维持幼虫肌肉完整性所需的Rapgef1类似，斑马鱼rapgef1b morphant表现出脊索和体节缺陷。这些缺陷与体节前中胚层（PSM）基因的表达降低相关，尤其是在前体体节中，与体节分割受阻的情况一致。体节前中胚层源自躯干中胚层祖细胞，这些祖细胞通过激活Wnt信号通路和tbxta表达维持在未分化状态。经典Wnt信号通过调控谱系决定因子的表达，是体节前中胚层成熟和体节形成的关键调节因子。哺乳动物RAPGEF1与β-连环蛋白以及 GSK3ß 相互作用，调控Wnt信号通路。rapgef1b敲低会导致Wnt信号下调，破坏增殖与分化之间的平衡，进而在中胚层祖细胞中诱导过早的促分化信号。因此，rapgef1b morphant出现体节前中胚层特化紊乱，以及体节组织和结构异常。鉴于体节前中胚层祖细胞由经典Wnt信号维持，我们的药理学实验表明，rapgef1b可能通过 GSK3ß 和β-连环蛋白的调控来调节该通路。Rapgef1b敲低会抑制Wnt活性并降低Wnt效应因子的表达，从而在中胚层祖细胞中产生过早的分化信号。此外，Wnt/β-连环蛋白信号的减弱会降低神经嵴特化因子的表达，这表明Wnt信号与BMP信号协同作用对神经嵴祖细胞的扩增至关重要，并能维持其多能性。Wnt/β-连环蛋白信号的下调还会导致中枢神经系统细胞凋亡激增，这与此前关于Wnt信号缺失与中脑和小脑细胞死亡相关的研究结果一致。事实上，β-连环蛋白信号促进神经嵴细胞分化为色素细胞类型，并抑制迁移前神经嵴中的神经元细胞命运。有趣的是，对 rapgef1b  morphant 进行的转录组分析还显示，与黑素细胞分化和色素沉着相关的基因表达下调，同时 morphant 和 crispant 中神经嵴来源的黑素细胞整体数量减少。这表明 rapgeflb 介导的 β-连环蛋白信号通路减弱，导致黑素细胞分化相关基因的表达降低。

总之，本研究通过详细的时空基因表达分析、转录组 profiling 以及药物干预实验，证实 rapgef1b 是颅神经嵴和中胚层谱系特化的关键调控因子，其部分作用是通过调控 Wnt 信号通路实现的。研究数据凸显了 rapgef1b 在早期发育过程中维持祖细胞状态、保障有丝分裂完整性及细胞存活的重要作用。本研究发现，尽管存在同源性极高的重复基因，但 rapgef1b 旁系同源基因对斑马鱼早期发育至关重要。同时，我们也观察到 rapgef1b 基因敲减突变体存在部分重叠的冗余表型特征，如存活率降低、脑部整体形态及体轴发育缺陷，这与针对 rapgef1a 基因敲减胚胎的研究报道一致。因此，为深入解析 rapgef1b 在斑马鱼血管生成、体节发生及运动神经元活性调控中的发育意义，有必要对 rapgef1b 两个旁系同源基因的独特功能与冗余功能展开详细研究。除两个旁系同源基因的独立功能外，基因敲低或敲除实验所呈现的表型效应也可能源于剂量不足效应。最后，由于谱系特化同样受染色质重塑调控（这一功能是 RAPGEF1 在哺乳动物细胞中所具备的），因此探究 rapgef1b 如何在斑马鱼胚胎发生过程中通过调控染色质修饰来改变谱系决定因子的表达，将是极具研究价值的方向。

方法

斑马鱼品系、吗啉寡核苷酸注射及表型鉴定

图宾根品系（TU-AB）斑马鱼按照之前描述的标准方案饲养。所有实验均按照印度细胞与分子生物学中心、科学与工业研究委员会机构动物伦理委员会批准的方案进行。所有实验均至少进行了三次生物学重复，统计分析详见图注。胚胎由成鱼自然产卵获得，置于28.5℃环境下培养，并按受精后小时数进行分期（95）。通过吗啉代寡核苷酸（rapgef1b 翻译阻断剂，5’）耗竭内源性 rapgef1 水平。

CTTGCTTTCTATTTTCCCCGACATG-3′（Gene Tools），每个胚胎使用浓度为0.25mM、0.5mM和1mM，同时以标准对照MO 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′（Gene Tools）作为阴性对照，浓度同样设置为0.25mM、0.5mM和1mM。除非另有说明，所有实验均使用1mM的翻译阻断剂进行。在挽救实验中，在单细胞阶段向每个胚胎中共同注射50皮克的人源RAPGEF1或β-连环蛋白（β-CATENIN）mRNA以及rapgef1b MO。随后在发育后期（1天胚胎期，1dpf）分析胚胎的整体形态缺陷及存活情况。

rapgef1b基因敲除品系的构建

利用CRISPOR在线工具（网址：www.https://crispor.tefor.net/）设计了用于CRISPR/Cas9介导的敲除、靶向rapgef1b基因（Ensembl编号：ENSDART00000123759.3）的单链向导RNA（sgRNAs）。选用两条靶向rapgef1b基因第3外显子和第4外显子的sgRNA，其靶序列分别为5′-GAGATACTTTAAGACGATTG -3′和5′GCTTGGCGACTCTGATTCGC-3′。基因特异性寡核苷酸在PCR仪中进行退火，采用从95°C逐步降温至4°C的程序，并通过琼脂糖凝胶电泳验证退火是否成功。将这两条sgRNA均克隆至pDR274质粒（Addgene编号：42250）中。按照制造商的说明书，使用Maxiscript SP6/T7试剂盒（货号AM1322）对两种克隆的RNA进行体外转录。向单细胞阶段的斑马鱼胚胎中注射3纳升的溶液，该溶液含600皮克的Cas9蛋白（TrueCut™ Cas9蛋白v2，货号A36498）以及每种sgRNA各150皮克。CRISPR/Cas9技术诱导产生了366个碱基对的缺失，导致第4外显子中出现提前终止密码子。用于基因分型的基因组DNA提取方法为：将样本（完整胚胎或成年斑马鱼尾鳍碎片）置于添加了1毫摩尔每升EDTA和10微克每毫升蛋白酶K的TE缓冲液中孵育。K（货号193981）在55摄氏度下处理1小时（胚胎）或4小时（鱼鳍），95摄氏度下处理10分钟，随后于4摄氏度下保存。用于基因分型的引物序列见图S5。

RNA提取、半定量RT-PCR及测序

每组取100个胚胎，按照RNA提取试剂盒（MN；740955.50）的制造商说明书，提取总RNA。按照RNAiso Plus试剂（TaKaRa，货号9109）的制造商说明书，制备斑马鱼不同成年组织的总RNA。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa，货号6110A）以总RNA合成cDNA。以制备好的cDNA为模板进行PCR，扩增斑马鱼rapgef1异构体和rpl7（内参基因）。使用针对斑马鱼rapgef1a和rapgef1b的异构体特异性引物，鉴定胚胎和成年斑马鱼组织中这些异构体的剪接变体。本研究使用的所有引物均列于图S2。PCR反应在BioRad C1000 Touch热循环仪中进行，使用Taq DNA聚合酶（TaKaRa，货号R500A）。rapgef1的PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟，随后30个循环，每个循环包括94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒；最后72℃终延伸10分钟。使用Vilber-Lourmat凝胶成像系统（德国）检测PCR扩增产物并拍摄照片。按照Macherey-Nagel NucleoSpin凝胶与PCR纯化试剂盒（MN；740609.50）的制造商说明书，洗脱PCR片段并测序，以确认扩增子来源于可变剪接变体。本研究使用的所有引物均列于图S5。

反义核糖探针制备

为克隆序列特异性外显子片段以合成核糖探针，使用RNA提取试剂盒（MN；740955.50）从TU-AB品系1天龄胚胎（1dpf）中提取总RNA。使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa，货号6110A）以总RNA制备cDNA。使用序列特异性引物扩增特定基因片段，将其克隆至pGEMT easy载体，并对序列进行验证。使用NcoI对序列验证后的质粒进行线性化处理，使用地高辛（DIG）RNA标记试剂盒（Roche货号11175025910）合成反义地高辛标记的核糖探针。本研究使用的所有引物列于图S5中。

全胚RNA原位杂交

将不同发育阶段的胚胎用4%多聚甲醛固定过夜，随后进行甲醇固定。经甲醇固定的胚胎用50%甲醇/PBT（1×磷酸盐缓冲盐水和0.1%吐温20）复水。胚胎先用PBT冲洗，再用1:1的PBT/杂交洗涤液冲洗，接着用杂交洗涤液（50%甲酰胺、1.3×标准盐溶液、5毫摩尔乙二胺四乙酸、0.2%吐温20、水）冲洗。将胚胎与杂交混合液（50%甲酰胺、1.3×标准盐溶液、5毫摩尔乙二胺四乙酸、0.2%吐温20、50微克/毫升酵母tRNA、100微克/毫升肝素、水）在55摄氏度下孵育1小时。加入杂交混合液中制备的核糖探针，于55摄氏度下孵育16小时。随后，将胚胎置于55摄氏度下用预热的杂交洗涤液冲洗30分钟（重复2次），再在室温下用1×三溴化三羟甲基氨基甲烷缓冲液（5摩尔氯化钠、1摩尔氯化钾、1摩尔三羟甲基氨基甲烷，pH值7.5，以及10%吐温20）洗涤。接着，用10%胎牛血清（吉科公司；货号16210-064，热灭活胎牛血清）在室温下封闭1小时。之后将胚胎与稀释比例为1:5000的抗地高辛-碱性磷酸酶抗体（罗氏公司；货号11093274910）在4摄氏度下孵育过夜。次日，将胚胎转移至6孔板中，用1×三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20缓冲液（0.1摩尔氯化钠、0.1摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH值9.5、0.05摩尔氯化镁、1%吐温20和水）洗涤两次，每次10分钟；然后与1:1的氮蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐溶液（货号PI34042）/三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20缓冲液混合液孵育进行显色。在此显色反应过程中持续观察胚胎，反应结束后用1×PBT作为终止液终止反应。使用蔡司Stemi 2000CVR明场显微镜，以5倍放大倍数（搭配AxiocamICc1相机）拍摄胚胎图像。将3天胚胎发育阶段经原位杂交处理后的胚胎用含30%蔗糖的磷酸盐缓冲盐水进行冷冻保护，包埋于莱卡公司的组织冷冻培养基中，切成15微米厚的冷冻切片。

蛋白质印迹分析

将完整的斑马鱼胚胎 n=100 及成年组织使用RIPA裂解液（20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.4；150毫摩尔/升氯化钠；5毫摩尔/升乙二胺四乙酸；1% 壬基酚聚氧乙烯醚-40；0.4% 脱氧胆酸钠、0.1% 十二烷基硫酸钠以及1× 蛋白酶抑制剂混合物）进行匀浆处理，置于冰上15分钟，期间涡旋震荡3次。将匀浆后的裂解液离心（4℃条件下12000转/分钟离心20分钟），取上清液用于后续分析。随后，将样品在1× 拉埃姆利缓冲液中煮沸，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。在8%的SDS-PAGE凝胶的每个泳道上样20微克总蛋白，以检测内源性蛋白。通过电转印将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（默克密理博，ISEQ00010）上。将膜置于含3%牛血清白蛋白（BSA）的三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20缓冲液（TBST，20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.5；150毫摩尔/升氯化钠；0.1% 吐温20）中，室温封闭2小时，并用一抗孵育过夜（图S6）。用TBST洗涤三次后，将印迹膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗共同孵育加入抗体孵育1小时，随后用TBST洗涤。使用化学发光试剂（Bio-Rad）检测印迹膜的化学发光信号，并在德国Vilber-Lourmat化学发光成像系统中进行成像。采用Image-J软件进行光密度分析。在所有样本中，以β微管蛋白作为蛋白上样量均一化的对照。数据以相对于野生型的归一化蛋白水平均值绘制，误差棒表示标准差。至少三次独立实验的数据均被绘制，采用Prism 8.0软件进行非配对t检验计算显著性差异。所用全部抗体列于图S6。

实时荧光定量PCR

对于实时荧光定量PCR（RT-PCR），我们使用Power SYBR Green PCR预混液（赛默飞世尔科技）搭配ViiA 7实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技），严格按照制造商的说明书进行PCR扩增实验。定量数据以三次独立实验的平均值±标准误（means ± SEM）表示。归一化数据的分析采用2−δδCT算法（即ΔΔCt算法）进行。除非另有说明，所有基因均以zrpl7为内参基因进行归一化。数据分析使用GraphPad Prism软件完成。为检验数据的统计学显著性，通过非配对t检验（unpaired Student t-test）计算p值。本研究中使用的所有引物均列于图S5。

斑马鱼胚胎的免疫组织化学染色

将不同发育阶段的胚胎用4%多聚甲醛固定过夜，随后用甲醇进行固定。经甲醇固定的胚胎先用50%甲醇/PBST（1×磷酸盐缓冲盐水和0.1% Triton X-100）复水，再置于1%牛血清白蛋白/PBST封闭液中，于室温孵育2小时。接着将胚胎与一抗在4℃条件下孵育过夜。次日用1×PBST洗涤，再与相应的二抗在4℃条件下孵育过夜。洗涤完成后，加入1微克/毫升的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10分钟，随后用1×磷酸盐缓冲盐水洗涤，于-20℃保存，直至进行共聚焦/荧光成像检测。利用IMARIS软件对共聚焦图像进行三维重建，对有丝分裂表型进行定量分析。所用全部抗体详见图S6。

吖啶橙染色

采用吖啶橙（AO）染色法检测1天龄胚胎中的凋亡细胞。将胚胎脱膜后，在黑暗中用5毫克/升的吖啶橙染色1小时，随后用胚胎水洗涤。接着用三卡因对胚胎进行麻醉，通过蔡司AxioZoom.V16显微镜进行拍照，观察胚胎内的亮绿色斑点指示凋亡细胞。使用 Image J 软件对头区域域的凋亡细胞数量进行计数。

阿尔新蓝与茜素红染色的骨骼标本制备

野生型对照组和 morphant 5日龄幼虫在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PFA/PBS）中于4℃固定过夜。胚胎用1×磷酸盐缓冲液（1XPBS）洗涤后，于-20℃在100%甲醇中保存过夜。配制以下染色液——A液（0.04%阿尔辛蓝、125mM氯化镁溶于70%乙醇）和B液（1.5%茜素红S）。向幼虫中加入1毫升A液和10微升B液，在室温下持续振荡孵育过夜。移除染色液，幼虫先用清水洗涤两次，随后置于漂白液中室温处理1小时，再经梯度甘油-氢氧化钾溶液处理。胚胎随后于室温在50%甘油/0.25%氢氧化钾（KOH）溶液中保存2小时。染色后的幼虫使用蔡司Stemi508体视显微镜进行成像。针对斑马鱼小头畸形分析，5日龄（dpf）幼虫的头部区域分别以听囊和眼的半圆作为后界和下界。使用ImageJ软件测量并定量测量瞳距（IPD）以及虹膜间距。

鬼笔环肽染色

将胚胎去除绒毛膜后，使用4%多聚甲醛在4℃下固定过夜。用磷酸盐缓冲液-0.1%吐温20（PBT）将胚胎从4%多聚甲醛中洗涤至少三次。在鬼笔环肽染色前，将胚胎在含1%曲拉通的磷酸盐缓冲液中于室温透化30分钟。将胚胎置于鬼笔环肽-四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（货号P1951）中，以1:500的稀释度在4℃下孵育过夜。成像前，用含0.1%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤胚胎三次。

Wnt/β-连环蛋白信号通路的药理调控

斑马鱼胚胎在盾期用溶解于二甲基亚砜（DMSO）的10微摩尔XAV939和10微摩尔CHIR99021处理，以抑制（XAV939）或激活（CHIR99021）Wnt/β-连环蛋白信号通路。在24小时胚胎期（hpf），计算所有这些处理组胚胎的表型百分比。

基于RNA测序的基因表达分析

使用RNA提取试剂盒（MN；740955.50）从1天龄（1dpf）的对照组和rapgef1b基因敲低胚胎中提取总RNA。按照制造商的说明书，使用MGIEasy RNA文库制备套装（MGI）构建测序文库。本实验以500纳克总RNA为起始材料，通过MGIEasy核糖体RNA（rRNA）去除试剂盒去除rRNA。将去除rRNA的样品进行片段化、逆转录，合成第二链并转化为互补DNA（cDNA）。随后使用试剂盒配套的DNA纯化磁珠纯化DNA，再进行末端修复和加A尾处理。完成条形码标记和接头连接后对样品进行纯化。使用接头特异性引物扩增样品，并通过Qubit双链DNA高灵敏度试剂盒（赛默飞世尔科技）进行定量。使用4200 TapeStation生物分析仪（安捷伦）检测样品片段大小。将1皮摩尔（1pMol）的双链DNA（dsDNA）文库变性并环化，制备单链环状DNA。通过滚环扩增生成DNA纳米球（DNBs）。将DNA纳米球上样至 patterned 流动池，在MGISEQ-2000测序仪（MGI）上采用PE100测序方案进行测序。

使用FASTQC对对照组和rapgef1b敲低胚胎的原始序列数据进行了读长质量评估。RNA测序数据已上传至基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE28361。使用CUTADAPT进行接头修剪和读长过滤，过滤标准设定为最小长度（50bp）和最低质量分数（Q20）阈值。随后使用STAR比对工具将修剪后的读长比对至斑马鱼参考基因组（GRCz11）。STAR以定量模式运行，指示该工具生成读长计数和比对结果。使用DESeq2软件包进行差异基因表达分析，对每种条件的三个生物学重复样本（对照组[野生型]和rapgef1b敲低组[rapgef1b KD]）进行检测。

原始计数总和小于10的转录本被排除在下游分析之外。研究人员计算了相关矩阵，以确定不同条件下各重复样本的一致性。为确保不同条件和重复样本间的一致性，基于deseq2标准化计数进行了主成分分析（PCA）。通过筛选错误发现率（FDR），以p值校正阈值p<=0.05进行筛选，获得显著差异表达的转录本。随后，根据各自的对数倍变化（L.F.C）值将这些转录本分为上调和下调两类，该值可反映其调控状态；倍变化大于1 (L.F.C >=1)的转录本被视为上调，而倍变化小于-1 F . C<=-1的转录本则被视为下调。研究人员利用enrichGO进行了基因本体（GO）富集分析。使用 ClusterProfiler 包的模块分析这些基因子集对代谢网络的影响。使用 ClusterProfiler 包的模块分析这些基因子集对代谢网络的影响。