题目：β-Sitosterol β-d-glucoside (BSSG) triggers intestinal inflammation in zebrafish and mouse models prior to neurodegeneration onset

原文链接：https://jbiomedsci.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12929-026-01249-8

期刊：Journal of Biomedical Science

摘要

背景：葡萄糖基甾醇可内源性合成、通过饮食吸收或源自细菌感染。尽管其失衡与整个生命周期内神经退行性疾病风险增加相关，但目前其临床相关性被低估。本研究探讨了饮食摄入植物来源的β-谷甾醇β-D-葡萄糖苷（BSSG）所引发的有害影响，已知该物质与肌萎缩侧索硬化症-帕金森痴呆复合体（ALS-PDC）的发生相关，旨在阐明其潜在的作用机制。

方法： 斑马鱼幼鱼与成体以及小鼠分别通过直接置于水中或喂食定制颗粒饲料的方式接受BSSG处理。鉴于肠道被确定为主要靶组织，研究人员对其形态和功能特征进行了评估，同时开展了转录组分析与肠道微生物组测序。通过对斑马鱼肠道收缩性进行离体分析，评估肠道神经肌肉反应。利用突变体和转基因斑马鱼品系探究BSSG潜在的作用机制。

结果显示，BSSG 会在斑马鱼和小鼠模型中诱发肠道炎症。肠道运动障碍和炎症反应证实了这一此前未知的作用。转录组学分析显示，斑马鱼和小鼠肠道内炎症相关基因的表达均有所增加，而初步的肠道菌群分析则表明菌群失调已经出现。敲除参与糖皮质激素合成与活性相关基因的转基因和突变斑马鱼品系证实，BSSG 可能与糖皮质激素受体相互作用，潜在削弱其经典的抗炎活性。

结论： 我们发现了饮食中BSSG暴露所改变的新通路。该分子似乎会首先诱发肠道炎症，进而导致肠道形态和功能发生改变，并可能通过破坏众所周知的肠-脑轴，对神经退行性变产生影响。

引言

肌萎缩侧索硬化-帕金森病痴呆综合征（ALS-PDC）是一种罕见的神经退行性疾病，其症状与肌萎缩侧索硬化（ALS）相似，包括运动神经元丢失和进行性肌肉萎缩，在疾病晚期还会出现帕金森样症状和痴呆症状。ALS-PDC 于20世纪60年代初首次在关岛原住民中被发现，随后在日本本州岛纪伊半岛以及西新几内亚也有相关病例报道。 值得注意的是，居住在这些地区的人群将苏铁植物种子——美叶苏铁、琉球苏铁和华南苏铁——磨成的面粉作为饮食和传统医药的一部分。因此，这种共同的饮食习惯被认为是引发该疾病的主要环境诱因。值得一提的是，二战后，随着西方生活方式的普及以及苏铁类制品摄入量的减少，ALS-PDC 的发病率显著下降。 研究确定该疾病的关键危险因素是β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷（BSSG），这一化合物在苏铁种子中含量极高。实验证实，该分子在体外和体内均具有神经毒性，可诱导谷氨酸介导的兴奋性毒性损伤，促进神经元中过度磷酸化tau蛋白的积累，并加剧培养的星形胶质细胞的凋亡。因此，通过饮食摄入的内源性BSSG水平升高，似乎是导致神经毒性和神经炎症的重要因素，最终促成了ALS-PDC的发生发展。

BSSG是一种糖基化甾醇，由与葡萄糖基团连接的类固醇骨架构成。类似分子主要存在于植物、真菌和藻类中，在细菌和动物中则较为罕见，在后者中它们以胆固醇的糖基化形式存在。值得注意的是，在携带GBA1基因突变的帕金森病（PD）主要遗传风险因素患者体内，发现了人体内源性合成的糖基化甾醇——β-D-葡萄糖基胆固醇( beta) -GlcChol）水平升高。同样，α-D-葡萄糖基胆固醇（α-GlcChol）由幽门螺杆菌在胃部感染期间产生，而胃部感染被视为与终身患帕金森病风险增加相关的环境因素。尽管这些糖基化甾醇具有临床重要性，但其失调对神经系统产生有害影响的机制仍知之甚少。

本研究采用斑马鱼和小鼠模型，旨在阐明 BSSG 可能如何导致神经毒性。出乎意料的是，研究结果表明肠道是其主要的靶组织。我们证实，该分子可诱发持续性肠道炎症，其特征为肠道生理功能、运动能力及基因表达发生改变。在两种动物模型中均有表达。鉴于经 BSSG 处理的小鼠是 ALS-PDC 已确立的症状前模型，且结合本文观察到的肠道炎症反应以及此前未被报道的相关情况，我们提出脑-肠轴失调可能会影响肠道与大脑之间的生理平衡。

最后，我们发现BSSG与糖皮质激素受体（GR）之间存在潜在相互作用，这种相互作用可能由其与类固醇分子的结构相似性介导，这表明了一种新的作用机制。

方法

β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷合成

β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷（BSSG）的合成过程及化学表征详见补充文件1。

斑马鱼与小鼠的饲养及处理

本研究中使用的斑马野生型（WT）品系，包括用于构建稳定突变体品系的品系，均源自图宾根（Tuebingen）和焦托（Giotto）品系的杂交。斑马鱼的胚胎、幼体和成体均饲养于帕多瓦大学斑马鱼设施中心，饲养过程遵循标准流程。胚胎通过野生型、突变体或转基因成体斑马鱼自然交配获得，在含斑马鱼水（50倍浓缩液：1升水中加入25克速溶海盐、39.25克(CaSO_{4})以及5克(NaHCO_{3}）的培养皿中，于28.5℃、12小时光照/12小时黑暗（LD）周期下培养至受精后72小时（hpf）。在该发育阶段，必要时对幼体进行荧光筛选，随后进行处理或给予对照溶剂处理。

帕多瓦大学动物设施中饲养的野生型C57BL/6雄性小鼠，在断奶（出生后1个月）后至6月龄期间，接受了15周的喂食处理，分别喂食富含BSSG的饲料颗粒或商品化饲料作为对照。小鼠饲料颗粒由Mucedola公司制备。此前在文献中确立的处理方案为：每周5天，每天给小鼠喂食1毫克BSSG。实验周期结束时，通过颈椎脱臼法处死小鼠，称量体重并解剖以收集器官。所有饲养及实验方案均符合国家和欧盟实验动物使用指南，并获得了帕多瓦大学动物护理与使用伦理委员会以及意大利卫生部的批准（授权号：112/2015PR；授权号：12/2023-PR；授权号：690/2020-PR）。

化学品制备

BSSG粉末(MW=576.86 ~g / mol）溶于二甲基亚砜（Sigma-Aldrich）中，而β-谷甾醇粉末β-谷甾醇（货号 (MW=414.71 ~g / mol)；产品编号 85451，Sigma-Aldrich）溶解于乙醇（EtOH）中，最终浓度均为10毫摩尔，超声处理直至完全溶解。超声浴温度维持在26–27摄氏度左右。储备液分装后于-20摄氏度保存。所有化学品均稀释至10微摩尔的最终工作浓度后施用于斑马鱼幼体，对照组幼体则暴露于相同体积的溶剂载体，其体积分数最高为0.1%。

斑马鱼幼鱼的处理

为进行急性处理，斑马鱼幼鱼自受精后3至5天（dpf）起，在含有BSSG、β-谷甾醇或赋形剂的养鱼水中孵育。每24小时更换一次处理液，以避免分子沉积和浓度变化。

对斑马鱼幼鱼从受精后第15天至第30天进行了为期15天的慢性BSSG处理。简要来说，从三次独立产卵中获得的幼鱼，在帕多瓦大学斑马鱼设施中按照标准流程饲养至受精后第15天。随后将其分为3个处理组和3个对照组，实验期间置于玻璃烧杯中培养，烧杯内装有300毫升养鱼水，水温保持28.5摄氏度，光照周期为12小时光照:12小时黑暗，每日投喂三次。处理剂直接加入水中，使其终浓度达到10微摩尔，每两天更换一次水并补充处理剂。

成年斑马鱼的BSSG富集饲料

比萨大学兽医学系参照文献所述方法，通过在对照饲料中添加该复合物，制备了实验用富含BSSG的饲料。简要来说，首先将对照饲料（由50% TetraMin薄片饲料和50% GEMMA Micro (300^{circ }) 混合而成）精细研磨(<100 mu m)，随后与BSSG粉末混合以实现均匀分散。加入蒸馏水制成均匀的面团状物质，经制粒后置于干燥箱中40℃干燥24小时。最后将干燥后的颗粒重新研磨以恢复饲料粒径，于-20℃保存备用。不含BSSG的商业饲料按相同流程处理作为对照。从三次独立产卵获得的受精后4个月的成年雄性斑马鱼，按体重均一性分组(N ≥4))分为处理组和对照组。参照文献，每日按鱼体重的5%投喂饲料，使每尾鱼每日摄入约15微克BSSG。实验持续30天。

突变体斑马鱼的DNA提取与基因分型

采用 HotSHOT 法提取基因组 DNA，并利用位点特异性引物对突变斑马鱼在早期阶段进行基因分型使用5× HOT-FIREPol® 混合预混液（货号04–25-00125，Solis BioDyne）通过PCR进行。用于基因分型的引物列于附加文件2：表1。

幼虫表型的形态学表征

处理组和对照组的幼虫（每个重复中每个条件下为 (N=10) 只）用三卡因麻醉，置于载玻片凹槽中 (H_{2} O) 浓度的 2% 甲基纤维素中，在配备尼康 DS-Fi2 数码相机的徕卡 M165 FC 显微镜下进行成像。使用 FijiImageJ 软件（2.14.0/1.54p 版）对主要形态特征（标准体长、眼部面积和鱼鳔面积）进行定量分析。实验重复进行了 3 次。

用于质谱分析（液相色谱-质谱联用）的脂质提取

用锋利的刀片将处理组和对照组幼虫的头部与躯干（每个条件下均为 (N=30）分离，合并后迅速置于液氮中冷冻，并在 -80℃ 下保存至使用。采用 Folch 法进行提取脂质。简要来说，冷冻沉淀用密理博®水重悬将Q水加入其中，使用颗粒研磨杵马达（Kimble）匀浆30秒，随后在冰上孵育10分钟，重复此步骤三次。匀浆完成后，加入由氯仿:甲醇:水按8:4:3体积比组成的溶剂溶液。收集有机相，重悬于相同溶液中并再次处理以去除污染物。最后，将样品用冻干机干燥，氮气吹扫后密封，于-80℃保存。随后进行液相色谱-质谱（LC-MS）检测，以测定处理组幼虫头部和躯干中BSSG的内部浓度，并与对照组进行对比。脂质提取物溶解于90:10的甲醇/氯仿溶液中，取5微升注入惠普1100系列液相色谱仪（惠普发展公司，加利福尼亚州），该色谱仪连接光电二极管阵列（PDA）检测器（安捷伦科技，安捷伦1100系列）以及布鲁克Esquire-LC四极杆离子阱质谱仪（布鲁克光学有限公司），该质谱仪配备大气压电喷雾离子源。定量液相色谱-质谱检测也在正离子模式下进行，使用配备电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆（QQQ）质谱仪（应用生物系统公司，API 3000 QQQ），并结合岛津高效液相色谱系统（CBM-20A，二元泵LC-20AB）。在两种质谱检测条件下，均于室温下在Kinetex-C8 100×4.6毫米、2.6微米色谱柱（菲诺美尼克斯公司，意大利）上进行色谱分析。洗脱液（流速1.0毫升/分钟）由（A）甲醇:水/10毫摩尔乙酸铵（70:30）和（B）甲醇:异丙醇/10毫摩尔乙酸铵组成(90:10)，采用线性梯度洗脱：40分钟内B相浓度从65%升至100%，随后以等度B相洗脱维持10分钟。

中性红染色

用BSSG、β-谷甾醇或对照溶剂处理的斑马鱼幼体，在黑暗条件下与终浓度为4微克/毫升的中性红溶液（553-24-2，西格玛-奥德里奇公司）孵育3小时，随后在养鱼水中快速冲洗。幼体经三卡因麻醉后，使用配备尼康DS-Fi2数码相机的徕卡M165 FC体视显微镜进行成像。利用斐济-ImageJ软件测量中肠染色部分的长度。每个处理组均进行四次实验，每组条件下至少使用10条幼体。

斑马鱼幼虫的阿尔辛蓝染色

经处理与未处理的野生型斑马鱼幼虫以及 (g r{-1-}) 斑马鱼幼虫在4%多聚甲醛（PFA，Sigma-Aldrich公司）的磷酸盐缓冲液（PBS）中4℃固定过夜。按照文献所述的方法进行阿尔新蓝染色（阿尔新蓝8GX–A5268，Sigma-Aldrich公司）。从肠球与中肠的连接处开始，手动计数杯状细胞的数量。实验重复三次，每个条件下至少使用10条幼体。

中性粒细胞计数与荧光分析（Tg (mpx:GFP)、Tg (NFκB:GFP)、Tg (Stat3:EGFP) 及 cyp11c1;Tg (GRE:EGFP) 幼鱼）

将Tg(mpx:GFP)ᵢ¹¹⁴、Tg (8xHs.NFκB:GFP, Luciferase)ʰᵈᵇ⁵（下文简称 Tg (NFκB:GFP)）、**Tg (7xSREHSV.Ul23:EGFP)ⁱᵃ²⁸（下文简称 Tg (Stat3:EGFP)）分别与野生型斑马鱼杂交；同时将cyp11c1⁺/⁻杂合子相互杂交，并与Tg (9xGCREHSV.U123:EGFP)ⁱᵃ²⁰（下文简称 Tg (GRE:EGFP)）** 品系杂交，以获得实验用转基因幼鱼。在受精后 3 天（3 dpf），对幼鱼进行特异性荧光筛选，仅将GFP 阳性个体随机分配至处理组与对照组。处理结束后，对幼鱼进行麻醉处理，并用1% 低熔点琼脂糖固定。在尼康 C2 共聚焦显微镜下，使用 NIS ELEMENTS 软件对同一肠道区域进行 Z 轴层扫成像（层厚 5 µm）：该区域始于肠球与中肠交界处，至少覆盖 4 个体节。其中，Tg (mpx:GFP)、Tg (NFκB:GFP) 及 cyp11c1;Tg (GRE:EGFP) 幼鱼采用20 倍物镜拍摄，Tg (Stat3:EGFP) 幼鱼采用40 倍物镜拍摄。参照文献 的方法，在 FijiImageJ 软件中使用细胞计数工具，逐帧浏览 Z 轴层扫图像，人工计数 Tg (mpx:GFP) 幼鱼中的荧光中性粒细胞，以避免重复计数。仅统计沿 5 个体节分布于肠壁内的中性粒细胞。

为了量化 Tg(NFkB:GFP)、Tg(Stat3:EGFP) 以及 cyp11c1;Tg(GRE:EGFP) 幼虫中的荧光信号，将Z轴堆叠图像转换为最大值进行Z轴投影的强度分析，并使用Fiji-ImageJ软件在相同的感兴趣区域（ROI）测量平均荧光值。图像采集完成后，对cyp11c1;Tg(GRE:EGFP)幼虫进行基因分型，以区分(cyp11c1 1{+/+})与(cyp11c1 1{-1-});Tg(GRE:EGFP)同窝幼虫。

每个实验均重复三次，每个条件下至少有10条斑马鱼幼体。

cyp11c1;Tg(GRE:EGFP) 成鱼的荧光分析

cyp11c1 1{+/+}；Tg(GRE:EGFP)和 cyp11c1 1{-1-})4日龄的Tg(GRE:EGFP)雄性斑马鱼被随机分为处理组（喂食含BSSG的饲料15天）和对照组。实验期结束时，在处死鱼体前对其禁食24小时，以减少肠道内的食物残渣。鱼体处死后，取出肠道，将其置于1%低熔点琼脂糖中用于成像。使用尼康C2共聚焦显微镜，在20倍物镜下通过Z轴堆栈（步长7微米）对样本进行成像。为了量化肠道荧光强度，将Z轴堆栈图像转换为最大强度投影图像，并设定阈值分离荧光区域后测量平均荧光强度。随后将数值标准化至未处理的 cyp11c1 1{-1-}；Tg(GRE:EGFP)，被视为背景信号。

斑马鱼幼虫的吖啶橙染色

对照组和经 BSSG 处理的 5 日龄斑马鱼幼虫在黑暗中与终浓度为 15 微克/毫升的吖啶橙溶液（A6014，西格玛-奥尔德里奇公司）孵育 10 分钟，随后在养鱼水中充分冲洗。接着将幼虫麻醉并固定在 1% 低熔点琼脂糖中。在尼康 C2 共聚焦显微镜下，使用 NIS 元素软件，以 20 倍物镜对同一肠道区域进行 Z 轴堆叠成像（步长 5 微米）。为量化荧光，将 Z 轴堆叠图像转换为最大强度 Z 投影，并使用 Fiji-ImageJ 软件在覆盖 4 个体节的同一感兴趣区域（ROI）中测量平均荧光强度。

蠕动分析

根据中描述的实验方案，在记录蠕动运动前，将对照组和经BSSG处理的5天龄（dpf）斑马鱼幼虫与终浓度为1毫克/升的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFHDA，Sigma-Aldrich公司产品）在黑暗中孵育过夜。随后将幼虫在养鱼水中冲洗三次，在三卡因（Tricaine）中麻醉1分钟以限制其对肌肉收缩的影响，并用2%甲基纤维素固定。在徕卡M165 FC荧光显微镜下录制6至8分钟的视频。通过统计蠕动收缩次数对每只幼虫进行两次分析，蠕动收缩的定义为肠球的部分或完全内陷。取平均值计算2分钟内蠕动运动的频率。实验重复进行三次，每种条件下至少有10只幼虫。

胃肠道转运实验

参照中描述的方案并稍作修改，本研究通过观察食团在摄食后24小时内沿消化道的行进情况，来评估胃肠道转运时间。处理组和对照组的5天龄（dpf）斑马鱼幼虫于上午8:00喂食商品化饲料，取食2小时后记为“时间0”。选取明场下可见肠球部充盈食团的幼虫进行分析，并分别在摄食后4、8和24小时，使用Leica M165 FC显微镜对其成像。随后依据中描述的评分体系评估食团的行进情况。本研究共检测了(N=32)号对照组幼虫以及(N=24)号处理组幼虫。

斑马鱼肠道收缩性的体外分析

采用离体器官浴槽技术通过测量张力变化，对成年斑马鱼的肠道收缩性进行了体外分析，具体方法参考此前针对小鼠和鱼类标本的研究。实验选取处死前禁食24小时的斑马鱼全长肠道，以减少肠腔食物残留量。肠道取出后，置于克氏溶液（氯化钠118毫摩尔/升、氯化钾4.7毫摩尔/升、<(CaCl_{2} cdot 2 H_{2} O)> 2.5毫摩尔/升、<(MgSO_{4} cdot 7 H_{2} O)> 1.2毫摩尔/升、<(K_{2} HPO_{4})> 1.2毫摩尔/升、<(NaHCO_{3})> 25毫摩尔/升、<(C_{6} H_{12} O_{6})> 11毫摩尔/升）中保存。用丝线将肠道沿其纵轴制成两个环，固定于装有10毫升含氧（95% <(O_{2}+5%)> <(CO_{2})>）且温度维持在28.5摄氏度的克氏溶液的器官浴槽中。通过等长张力换能器（德国柏林精密仪器公司）连接至PowerLab 4/30数据采集系统，并借助LabChart 8软件（意大利贝索佐ADInstruments公司）记录肌肉张力变化。将肠道标本拉伸至初始张力0.1克，平衡45分钟以使其产生节律性自发收缩。平衡期结束后，向克氏溶液中直接加入1微摩尔/升卡巴胆碱（CCh，一种非选择性胆碱能受体激动剂）以激活标本。为评估平滑肌收缩情况，将每段肠道暴露于40毫摩尔/升氯化钾（一种去极化剂，可引发<(Ca{2+})>释放并触发后续的平滑肌收缩）。为检测胆碱能受体介导的兴奋性反应，随后向器官浴槽中累积加入不同浓度的卡巴胆碱（0.001–100微摩尔/升），使标本逐步暴露于不同浓度的卡巴胆碱中。绘制浓度-效应曲线。通过连接至S88刺激器（Grass仪器公司）的铂电极，采用递增频率、恒定电压（0–40赫兹；1毫秒脉冲持续时间；10秒脉冲序列，80伏特）的电场刺激（EFS）评估神经元介导的收缩，诱导膜去极化和神经递质释放。最后，为表征抑制性神经肌肉反应，将斑马鱼肠道暴露于0.1微摩尔/升异丙肾上腺素（一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂）中。对浓度-反应曲线进行非线性回归分析（拟合至S型方程），计算最大张力（Emax）值。收缩反应以克张力/克干组织重量表示。共分析了(N ≥4)只实验动物。

微生物群测序

斑马鱼肠道微生物组测序

用富含BSSG的食物处理30天的成年斑马鱼及其相应对照组在禁食24小时后被处死，以清除肠道内的食物残留。提取整个肠道，在液氮中快速冷冻，并在−80 °C下保存直至使用。按照制造商的说明，使用DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（Qiagen）进行细菌DNA提取，仅做了轻微修改：为确保为高效破坏细菌细胞壁，样本需™使用BeadBug微量管匀浆器（默克生命科学公司）对样本进行反复匀浆，随后持续涡旋震荡20分钟，直至组织完全破碎。后续步骤均按照试剂盒说明书操作。使用Qubit荧光计（赛默飞世尔科技）对DNA样本进行定量，并稀释至10纳克/微升。随后采用巢式PCR扩增方案对细菌DNA进行扩增，以获得16S rRNA基因序列。在第一轮PCR反应（PCR I）中，使用Platinum™高保真Taq DNA聚合酶（赛默飞世尔科技），搭配正向引物Eub8F和反向引物984yR对DNA进行扩增。取1微升该PCR I产物作为第二轮PCR（PCR II）的模板，使用内部引物515F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V4高变区，该区域可用于区分不同的细菌类群。PCR反应条件如下：94℃预变性1分钟以激活DNA聚合酶；随后进行25个循环，每个循环包含94℃变性30秒、53℃（PCR I中）或57℃（PCR II中）退火30秒、68℃延伸45秒；最后在68℃下终末延伸7分钟。引物序列详见附加文件2的表2。利用Illumina测序平台对16S区域进行测序，获得150 bp的双端序列。采用文献[29]中描述的分析流程对测序读长进行处理，将扩增子序列变体（ASVs）对应到细菌类群。针对这些分析，3将野生型（WT）和3只编号为(3 gr{-1-})的雄性对照组斑马鱼，与4只野生型（WT）和(4 g r{-1-})处理的雄性斑马鱼进行对比。

小鼠粪便微生物群测序

使用 QIAamp 快速粪便 DNA 迷你试剂盒（51604，凯杰公司）按照病原体检测方案从粪便样本中提取细菌DNA，该方案经过优化以实现最大效率非小鼠DNA的比例。随后提取的DNA®使用Phusion高保真DNA聚合酶（BioLabs公司），以正向引物515 F和反向引物806 R（补充文件2：表2）进行扩增，反应条件如下：98℃预变性3分钟，随后进行25个循环，每个循环包括95℃变性45秒、58℃退火45秒、72℃延伸50秒，最后在72℃下最终延伸5分钟。16S区域的测序由帕多瓦大学生物学系测序中心依托Illumina测序平台完成，获得150 bp的双端测序序列。随后将扩增子序列变体（ASVs）匹配至细菌分类群，并计算门和科水平的平均相对丰度。数据来源于(N=2)对应的雄性小鼠/实验条件。

RNA提取、逆转录与实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

使用TRIzol试剂（货号15596026，赛默飞世尔科技）从不同组织样本中提取总RNA，具体样本包括：5天post-fertilization（dpf）的混合完整幼虫（每个样本至少含(N=15)个个体）；30天post-fertilization（dpf）的混合完整幼虫（每个样本含(N=14)个个体）；单条成年斑马鱼的肠道或脑组织；以及长度约1.5厘米的小鼠小肠样本。采用NanoDrop 2000c分光光度计（赛默飞世尔科技）和TapeStation 4150系统（安捷伦）对提取的RNA的浓度和质量进行检测。取1微克（用于斑马鱼幼虫和小鼠组织样本）或500纳克（用于成年斑马鱼组织样本）总RNA，用RQ1无RNase DNase（货号M6101，普洛麦格）处理后，通过HighCapacity cDNA逆转录试剂盒（货号4368814，赛默飞世尔）进行cDNA合成。将cDNA按1:10比例稀释（小鼠肠道样本按1:5比例稀释），并使用5× HOT FIREPol EvaGreen qPCR预混液（货号08–36-00001，索利斯生物科技）结合位点特异性引物进行扩增。采用SybrGreen法在CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统（伯乐）中检测基因表达水平，自动生成引物熔解曲线和循环阈值（Ct）。采用相对定量Ct法（2{-Delta Delta C t}）计算相对基因表达水平，并以持家基因作为内参进行标准化（成年斑马鱼组织用β-肌动蛋白，斑马鱼幼虫样本用延伸因子1α，小鼠肠道样本用Tbp）。RT-qPCR分析所用引物详见补充文件2：表3。

RNA测序（RNAseq）

使用Illumina QuantSeq 3ʹ mRNA-Seq文库制备试剂盒（货号015UG009V0260，Lexogen），按照制造商的操作流程，对从30天胚胎期（dpf）斑马鱼幼鱼中提取的RNA进行了文库构建。简要来说，将500纳克总RNA与寡聚d(T)引物进行逆转录，RNA降解后，使用随机引物合成第二条cDNA链。对双链DNA进行扩增，以引入测序接头和文库条形码。 对于小鼠样本，使用Illumina Ribo-Zero Plus核糖体RNA去除试剂盒（Illumina），从至少500纳克总RNA出发，先进行核糖体RNA去除，随后构建文库。经核糖体RNA去除的RNA随后通过乙醇沉淀纯化，用于文库制备。简要步骤为：RNA片段化后，使用随机六聚体引物合成第一条cDNA链（NEBNext Ultra II RNA第一链合成模块；NEB）。接着合成第二条cDNA链，并在反应缓冲液中用dTTP替换dUTP（NEBNext Ultra II定向RNA第二链合成模块；NEB）。使用磁珠纯化双链DNA，进行末端修复并加A尾，以促进接头连接。经凝胶片段大小筛选（250–800个碱基对）后，使用USER酶（NEB）消化，以去除含UTP的第二条cDNA链。测序前，使用Qbit（双链DNA定量，高灵敏度；赛默飞世尔科技）对文库进行定量，并通过高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦科技）评估片段大小分布。 斑马鱼文库由帕多瓦大学生物学系测序平台使用NextSeq 500（Illumina）测序平台，采用单端测序法进行测序。相反，小鼠文库由诺禾致源（Novogene）平台使用Novoseq X plus（Illumina）测序仪，采用双端测序法进行测序。

转录组数据分析

使用 Cutadapt（版本 4.7） 完成接头修剪后，采用 Salmon 方法（版本 1.10.3） 对转录本表达量进行定量分析。将得到的计数矩阵导入 R 统计分析环境，借助 edgeR 包（版本 4.0.2） 进行基因表达标准化处理，并识别处理组与对照组样本之间的差异表达基因（DEGs），相关结果见附加文件 4 和附加文件 5(FDR ≤0.05)。利用斑马鱼和小鼠的差异表达基因，通过 R 软件中的 enrichplot 包进行基因本体（GO）富集分析，并借助 ShinyGO 工具绘制柱状图。原始 RNA 测序数据已提交至 SRA 数据库。

小鼠微绒毛的电子显微镜观察及超微结构分析

处死小鼠后，取出小肠，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗。将小鼠小肠切成0.5厘米长的小段，在4℃下用卡诺夫斯基固定液（0.1摩尔/升二甲胂酸缓冲液中含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛）固定过夜，随后用0.1摩尔/升二甲胂酸缓冲液洗涤，再用四氧化锇后固定2小时，包埋于EMbed 812树脂（电子显微镜科学公司产品）中。超薄切片经乙酸铀和柠檬酸铅染色后，使用飞利浦M400显微镜在100千伏电压下进行观察。用FijiImageJ软件从微绒毛尖端到基部测量其长度。每种条件下均取自3只小鼠，对多张图像进行重复分析。

小鼠小肠组织学切片的阿尔辛蓝染色

处死小鼠后，提取其小肠并用冷PBS轻轻冲洗。取约1.5厘米长的肠段，置于Bouin固定液（42毫升配方：(ddH_{2} O)中含30毫升饱和苦味酸、10毫升甲醛、2毫升冰醋酸）中固定24小时，随后用70%乙醇冲洗。样本在梯度乙醇（去离子水中配置80%−90%−100%浓度）中于室温脱水1小时，经二甲苯（Sigma-Aldrich）透明处理，再置于二甲石蜡混合液（体积比1:1）中渗透并包埋于石蜡中。使用Leica切片机切取7微米厚的切片。组织切片脱蜡后复水至(ddH_{2} O)，置于3%冰醋酸溶液中孵育3分钟，随后用阿尔辛蓝染液（1%阿尔辛蓝8GX——Sigma-Aldrich公司货号A5268，溶于3%冰醋酸，pH值2.5）染色30分钟。切片经3%冰醋酸溶液快速冲洗，再用流动自来水冲洗5分钟，最后用伊红Y（Sigma-Aldrich，美国）复染。随后经100%乙醇脱水并封片用于观察。在每种实验条件下，选取6只小鼠，分别在间距100微米的3张切片中，沿肠绒毛计数阿尔辛蓝染色的杯状细胞数量。

小鼠小肠组织学切片上的巨噬细胞染色

小鼠小肠经石蜡包埋、切片处理（方法同前），并贴附于Super-® frost Plus显微镜载玻片（货号J1800AMNZ，赛默飞世尔科技）。切片脱蜡后，经梯度乙醇系列（在双蒸水中配置为100%−90%−70%）复水，每级处理5分钟，随后置于淬灭液(NH_{4} Cl) 50 mM）中孵育15分钟以降低自发荧光。抗原修复步骤为：置于亚沸柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸0.01 M，pH 6）中孵育10分钟，随后在含1%吐温的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（TBS-1% Tween）中于室温孵育10分钟。之后将载玻片置于饱和溶液中封闭1小时（含0.5% Triton X-100的PBS中添加15%山羊血清、2%牛血清白蛋白、0.25%明胶、0.2%甘氨酸）。切片在稀释比例为1:50的F4/80单克隆一抗（货号14–4801-82，赛默飞世尔科技公司）中于4℃孵育过夜。在含1%吐温的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（TBS-1% Tween）中洗涤5分钟，共洗涤3次后，切片在室温下与终稀释比例为1:200的山羊抗大鼠Alexa Fluor 568二抗（货号A-11077，赛默飞世尔科技公司）孵育1小时。为减少自发荧光，玻片用苏丹黑溶液（70%乙醇中浓度0.1%）处理10分钟，随后在含1%吐温的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中充分洗涤。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5分钟，切片使用™ SlowFade Diamond抗褪色封片剂（货号S36967，赛默飞世尔科技公司）封片。使用配备Axiocam 305单色相机的蔡司AXIO Zoom.V16荧光显微镜采集图像。每种条件下，对3只小鼠的切片中的巨噬细胞进行人工计数。

放射性配体结合实验

为验证 BSSG 在 10 微摩尔浓度下结合类固醇激素受体的能力，欧陆法 Panlabs 发现服务公司采用核受体结合激动剂放射性配体分析法开展了放射性配体结合实验。BSSG 对人雄激素受体、雌激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体和孕激素受体的选择性，以对各受体特异性放射性标记配体结合的抑制百分比计算，具体分别为：([{3} H]) - 甲睾烯酮、([{3} H]) - 雌二醇、([{3} H]) - 地塞米松、([{3} H]) - 醛固酮以及 ([{3} H]) - 孕酮。

斑马鱼全 mounts 免疫荧光

BSSG 处理后，将 5 日龄后仔鱼在 4% 多聚甲醛（PFA，Sigma-Aldrich 公司产品）的磷酸盐缓冲液（PBS）中于 4 ℃ 固定过夜，随后用 100% 甲醇进行脱水处理。 用梯度甲醇溶液（PBS 中分别含 75%、50%、25% 甲醇）和含 0.2%  Triton X-100 的 PBS（PBT）依次对仔鱼进行复水，每步室温（RT）处理 5 分钟；之后进行脱色处理：用含 2% 氢氧化钾和 3% (H_{2} O_{2}) 的 PBT 处理 5 分钟，再用 (ddH _{2} O) 洗涤 5 分钟；接着进行通透处理：在 -20 ℃ 预冷的 100% 丙酮中处理 15 分钟，随后用 (ddH_{2} O) 和 PBT 洗涤。 将仔鱼置于封闭液（PBT 中含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 5% 羊血清）中，室温封闭 4 小时；再加入按 1:200 比例稀释于封闭液中的全神经元抗 HuC/D 一抗（A-21272，赛默飞世尔科技公司）或抗 Sox10 一抗（GTX128374-S，GeneTex 公司），4 ℃ 孵育 48 小时。 之后用 PBT 在室温洗涤仔鱼四次，每次 20 分钟；再用相同的封闭液饱和处理 4 小时，随后在 4 ℃ 避光条件下，与针对 HuC/D 的链霉亲和素偶联 Alexa Fluor 555 二抗（S32355，赛默飞世尔科技公司）或针对兔源的山羊抗 Alexa Fluor 488 二抗（A11034，赛默飞 Invitrogen 公司）孵育过夜。Sox10 稀释比例为 1:1000。用 PBT 充分洗涤后，将幼虫固定在 1% 低熔点琼脂糖中，在尼康 C2 共聚焦显微镜下使用 20 倍物镜通过 Z 轴堆叠（步长 3 微米）进行成像。对所有幼虫均拍摄同一身体区域。通过滚动查看 Z 轴堆叠图像，手动计数肠道腹侧可见的所有 (HuC / D{+}) 肠神经元和 (Sox10) 神经元前体细胞，借助 Fiji-ImageJ 软件中的细胞计数工具避免重复计数。每个条件下统计 (N ≥10) 只动物。该实验重复进行了三次。

斑马鱼胚胎急性毒性试验

依据经济合作与发展组织（法国巴黎）第236号指南（2013年）开展FET测试，以确定适用于斑马鱼处理的非致死性且无毒性的BSSG浓度，从而避免致畸或发育相关问题。

简要来说，将6小时post-fertilization（hpf）的斑马鱼胚胎单独转移至24孔板中（每孔1个胚胎，1毫升溶液），并用浓度递增的BSSG（2.5–5–10–20–40微摩尔）或相应的溶剂对照（二甲基亚砜浓度为0.1%–0.2%–0.4%）进行孵育。每个浓度下，20个胚胎分别与BSSG共同孵育，剩余4个孔作为内部阴性对照（养鱼水）。同时还设置了阴性和阳性对照（1.5%乙醇）进行测试。每日更换胚胎培养基，持续监测斑马鱼胚胎和幼体的发育状态，直至4天post-fertilization（dpf）。根据存活胚胎的总数，统计存活率、孵化率，并观察是否存在心脏水肿及鱼鳔异常情况。

统计分析

使用 Graph Pad Prism V10.2.3 进行统计分析。数据以均值±标准误（SEM）表示，两组间比较采用非配对Student t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）后行Tukey事后检验。离体肠道收缩性分析采用双因素方差分析（ANOVA）后行Bonferroni事后检验检验用于多重比较。组间差异在(P<0.05)时被认为具有显著性。仅当F值达到(P<0.05)且方差同质性无显著差异时，才进行事后检验。对于胃肠道转运实验，基于幼虫绝对计数，采用2×5列联表的费希尔精确检验，在每个时间点评估对照组和处理组幼虫的食团在转运区域的分布差异。p值用以下符号表示：*P<0.05；**P<0.01；中 <0.001；(中国人民银行)；ns，无显著性差异。

结果

BSSG 给药会引发斑马鱼幼鱼的肠道炎症

暴露于10微摩尔BSSG的斑马鱼幼体发育正常（补充文件3：图1A、B），对从幼鱼头和躯干中提取的脂质进行的质谱分析证实，该化合物在处理动物的躯干区域发生了积累（补充文件3：图1C）。

几乎所有暴露于BSSG的幼虫肠道中都存在深色聚集体，这促使我们提出假设：肠道可能是其首个作用靶点（图1A）。一致的是，对酸化溶酶体的体内分析显示，经处理的幼虫中富含溶酶体的肠上皮细胞（LREs）数量有所减少（图1B）。为确定这些肠道效应是否特异性由BSSG引起，而非可能的代谢物所致，我们用β-谷甾醇处理幼虫并开展了相同实验，该物质与BSSG具有相同化学结构，但缺乏葡萄糖部分。此分子并未对LREs产生影响（附加文件3：图2A），这表明有害效应仅取决于BSSG的摄入。

肠道中段分泌黏液的杯状细胞对于保护肠道免受消化酶和外界损伤至关重要，暴露于BSSG后这类细胞的数量有所减少（图1C）。相反，经处理的幼虫肠道中段浸润的中性粒细胞数量显著增加（图1D），这表明肠道炎症开始发作。这一结论得到了进一步的佐证BSSG 处理的转基因 Tg(NFκB:GFP) 幼虫肠道荧光增强，表明 NF-κB 通路被激活（图1E）。与炎症表型的出现一致，我们还观察到中肠细胞凋亡增加（图1F）。

图1 斑马鱼幼虫肠道炎症的证据。A 5天龄（dpf）斑马鱼幼虫的代表性肠道形态及对照组（CTR，左侧）和BSSG处理组（右侧）的对应放大图像。箭头头指示BSSG处理幼虫中肠内的深色团块。B 中性红染色的中肠区域分析及其长度定量。C 对照组和BSSG处理幼虫中肠内阿利新蓝染色的杯状细胞数量分析。D 对照组和BSSG处理的Tg(mpx:GFP)幼虫中肠内荧光中性粒细胞的分布与数量代表性显微图像。E 对照组和BSSG处理的Tg(NFkB:GFP)幼虫中肠内荧光信号分析。F 吖啶橙染色的对照组和BSSG处理幼虫的荧光信号分析。G 对照组和BSSG处理的Tg(Stat3:EGFP)幼虫中肠内Stat3表达标记的荧光干样细胞分布与数量代表性显微图像。虚线标示分析区域。H (N≥3)生物学重复中，对照组和BSSG处理幼虫全组织中炎症相关基因的RT-qPCR分析。数据以平均值+标准误（SEM）表示。采用非配对Student's t检验进行统计学分析：* *P<0.05 *P<0.01。比例尺：200微米

此外，位于肠褶基部的类干细胞（与哺乳动物的隐窝基底柱状细胞类似）的 Stat3 特异性荧光强度降低，可能反映了增殖细胞的耗竭（图1G）。

为进一步表征BSSG对肠道稳态的影响，我们分析了急性暴露后完整幼虫中炎症相关标志物的表达情况。我们观察到基质金属肽酶9（mmp9）的表达呈上升趋势，同时信号转导与转录激活因子3（stat3）和肽转运蛋白1（pept1）的表达显著上调。参与杯状细胞黏液生成的前梯度蛋白2（agr2）表达降低，进一步证实肠道上皮屏障存在缺陷（图1H）。

我们还观察到自噬相关基因 atg5（自噬相关5）和 lc3b（微管相关蛋白1轻链3b）的表达水平降低，这表明自噬可能受到损伤（补充文件3：图2B）。

综合来看，这些结果描绘出这样一种情况：BSSG 给药会诱发肠道炎症，破坏关键的细胞过程，进而可能加剧肠道内环境失衡。

BSSG处理改变肠道动力和微生物组成

为研究BSSG对肠道生理的影响，我们首先分析了蠕动频率。经处理的幼虫肠道收缩波数量更少与对照组相比（图2A）。为了证实这一发现，我们监测了幼虫沿消化道的胃肠道转运过程，理想情况下将其划分为转运区域（图2B，上图）。随着时间推移，食物团定位的差异表明，经处理的幼虫表现出胃肠道转运延迟（喂食24小时后采用Fisher精确检验，(P<0.001）（图2B，下图）。

由于蠕动活动由肠神经系统（ENS）调控，我们评估了分化的肠神经元和神经元前体细胞的数量（分别用HuC/D和Sox10标记），但发现处理组与对照组幼虫之间无差异（附加文件3：图2C），这表明BSSG可能影响肠神经支配的功能而非其密度。

因此，我们研究了长期喂食富含BSSG的饲料以模拟慢性暴露的成年斑马鱼中，肠道神经传递在肠道动力障碍中的作用。这是首次在斑马鱼中评估离体完整肠道的受体介导和非受体介导神经肌肉反应。通过将斑马鱼肠道暴露于去极化剂KCl来分析肌肉收缩反应一种诱导(Ca{2+})释放并随后发生的平滑肌收缩。在处理组个体的肠道组织中，观察到氯化钾（KCl）诱导的收缩显著增强（图2C）。为进一步评估胆碱能兴奋性反应，将肠道样本暴露于浓度递增的卡巴胆碱（CCh）——一种非选择性胆碱能激动剂中。累积浓度-反应曲线显示，处理组肠道中卡巴胆碱（CCh）介导的收缩显著增强（图2D），这表明经BSSG处理后胆碱能神经传递发生了改变。随后，为验证其对肠神经系统（ENS）神经元活动的影响，以恒定电压、递增频率对肠道组织进行电场刺激（EFS），以诱导神经元去极化及随后的神经递质释放。经治疗的个体表现出增强的兴奋性神经肌肉反应，导致频率-反应曲线向电场刺激显著上移（图2E）。10赫兹电场刺激介导的收缩增强证实了兴奋性胆碱能反应发生了改变。相反，由异丙肾上腺素（一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂）诱导的肌肉松弛未受治疗影响（图2F）。

图2 肠道动力损伤与肠道菌群变化。A 上图：显示肠道蠕动的视频帧。星号标记肌肉收缩起始点。箭头头指示肠球内陷。sb，鱼鳔；a，肛门。下图：从活体成像视频中对肠道蠕动进行评分，计算每2分钟的频率。数据来自(N=3)的生物学重复。箱线图展示中位数和最小值/最大值。B 上图：斑马鱼幼鱼肠道分区定义为“区域”的示意图。1：肠球位于鱼鳔前方的部分；2：鱼鳔下方的肠球；3：肠球与中肠的连接处；4：中肠和后肠。肠道为空时记为E。下图：柱状图展示胃肠道转运情况，基于对活体个体的视觉分析，以不同时间点食物团最前端到达指定区域的幼鱼百分比表示。统计学显著性为基于绝对计数采用Fisher精确检验评估的整体差异。**P<0.001 N=32 < 0.001。对照组（CTR）32尾、BSSG处理组24尾幼鱼，均来自不同产卵批次。C–F 成年斑马鱼离体肠道制备物（经或未经体内BSSG处理）的离体神经肌肉收缩分析：40 mM氯化钾（C）；乙酰甲胆碱（CCh，0.001—100 μM）的浓度-效应曲线（D）；电场刺激（EFS；0–40 Hz，80 V）（E）；0.1 μM异丙肾上腺素诱导的肠道松弛（F）。每个点代表单个成年个体的组织样本。每个处理条件n ≥ 8尾动物。数据以平均值±标准误（SEM）表示。统计学分析采用未配对Student t检验进行两组比较，或双向方差分析（ANOVA）后进行Bonferroni事后检验进行多组比较；*P < 0.05；* *P<0.01 : **P<0.001；ns，无显著性差异。G、H 成年斑马鱼肠道菌群分析。柱状图展示细菌门（G）和科（H）的相对丰度百分比

接下来，鉴于微生物群在维持肠道稳态中的重要性，以及其改变与人类和动物模型肠道炎症之间已被充分证实的关联，我们分析了BSSG暴露后成年斑马鱼的微生物群组成。在门水平上，变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门的丰度增加，而厚壁菌门和放线菌门的丰度降低（图2G），这导致厚壁菌门/拟杆菌门比例降低，该比例是肠道健康的一个广泛认可的指标。在科水平上，我们观察到巴恩西氏菌科、气单胞菌科和红杆菌科的丰度增加，而丹毒丝菌科、肠杆菌科和威尔斯菌科的相对丰度降低（图2H）。总体而言，尽管这些结果未达到统计学显著性（可能是由于样本量有限），但表明BSSG处理可能影响肠道微生物组成，潜在地导致菌群失调的发生。

对长期处理的幼虫进行转录组分析发现其存在肠道动态失衡，这可能是神经退行性病变的前驱症状

对长期处理的斑马鱼幼虫进行RNAseq分析发现，与对照组相比，有261个差异表达基因（168个上调，93个下调）。上调的基因主要参与急性炎症反应、活性氧反应以及细菌防御反应（图3A）。mmp9和pept1均上调，同时saa（血清淀粉样蛋白A）和s100a10a（S100钙结合蛋白A10A）的表达也随之增加（图3B），这与之前在处理过的幼虫中得到的研究结果一致（图1H），表明存在肠道炎症。

BSSG处理下调的基因主要与侧线神经发育和氧运输相关（图3A）。氧结合功能的下降也出现在下调的分子功能类别中（附加文件3：图3A，右面板）。值得注意的是，血红蛋白相关的全部基因（hb)）在处理组个体中均出现显著下调（图3B；附加文件3：图3B），这一现象近期被发现与多种神经退行性疾病的病理生理机制相关。杯状细胞分泌的、用于中和消化酶和病原体的黏蛋白5.3（muc5.3）表达下调（图3B），与处理组幼虫中杯状细胞数量减少的观察结果一致（图1C）。

为验证转录组结果，我们检测了成年斑马鱼肠道中特定基因的表达，证实炎症相关标志物（mmp9、mmp13、il-4、il-13）和细胞应激标志物（casp8、半胱天冬酶8；nupr1、核蛋白1）的上调（图3C，上图）。

由于RNA测序分析证实了可能参与神经退行性病变的基因发生改变，我们还对成年斑马鱼的大脑进行了评估。与肠道的研究结果不同，处理后大脑中mmp9的表达水平下调，这可能会影响其在中枢神经系统（CNS）可塑性中的作用。我们还观察到自噬相关基因atg5、lc3b以及(p62)的表达下调（图3C，下图）。

喂食BSSG的小鼠体重下降并出现肠道炎症特征

为了探究BSSG饮食摄入是否也能在小鼠模型中引发肠道改变，我们让野生型（WT）小鼠喂食富含BSSG的饲料15周，随后对其肠道表型进行了表征。我们观察到，处理组小鼠小肠固有层中驻留和/或募集的巨噬细胞数量有所增加（附加文件3：图4A）。接着，我们对杯状细胞数量进行了评估，发现处理组小鼠的杯状细胞数量显著减少（图4A），这也证明了在该模型中，小鼠通过饮食摄入BSSG后会出现肠道炎症的相关特征。超微结构分析研究显示，喂食BSSG的小鼠微绒毛长度明显短于对照组（图4B），这可能意味着其肠道吸收能力受损。一致的是，尽管食物摄入量与对照组相近（补充材料3：图4B），但经处理的小鼠体重低于对照组（图4C）。

图3 斑马鱼转录组分析。A 来自30天pf长期处理的斑马鱼幼鱼混合样本的RNA样品的RNA测序分析柱状图。上调基因的基因本体论富集分析（基因本体论生物学过程）。Aʹ 下调基因的基因本体论富集分析（基因本体论生物学过程）。B 长期处理幼鱼差异表达基因的火山图。蓝色代表下调的差异表达基因，红色代表上调的差异表达基因。灰色代表未达到(P<0.01)统计阈值的无显著差异表达基因。以虚线标注Log2（倍数变化）=±0.5。C 成年斑马鱼肠道（上图）和大脑（下图）RNA样品中不同炎症、细胞应激和自噬相关基因的RT-qPCR分析。每个点代表单个个体的组织样本。每个条件下n≥3只动物。数据以平均值±标准误表示。采用非配对双样本t检验进行统计学分析。(*P<0.05)；(**P<0.01)

对肠道组织进行的RNAseq分析显示，经处理与未处理的小鼠之间存在1835个差异表达基因（经处理的动物中有982个基因上调、853个基因下调）。上调的基因主要与免疫系统过程的调控及免疫应答相关（图4D、E；补充文件3：图4C，左图），并与肌动蛋白细胞骨架、膜侧和微绒毛相关（补充文件3：图4D），从而证实BSSG直接影响肠上皮细胞刷状缘结构相关基因。相反，下调的基因参与小分子代谢过程、细胞生长调控、含血红素/卟啉化合物的生物合成以及神经元投射发育的调控（图4D、E），并与谷胱甘肽转移酶活性和跨膜转运体活性相关（补充文件3：图4C，右图）。RT-qPCR分析证实了炎症和免疫应答的激活，结果显示Nod1（NOD样受体1）、Tlr-2、Tlr-4、Tlr-6（Toll样受体-2、-4、-6）、Nlrp3（含NLR家族吡啉结构域3）、Il-1β（白介素-1β）和Ifn-γ（干扰素-γ）表达上调，而Ikb-α（核因子-κB抑制蛋白α）和Reg3-γ（胰岛再生相关蛋白3-γ）表达下调。研究还观察到Plp1（蛋白脂质蛋白1）表达上调，该基因在肠胶质细胞中高表达（图4F）。

最后，对粪便微生物群的分析显示，喂食BSSG的小鼠与对照组小鼠在细菌组成上存在一些差异。经处理的小鼠表现出潜在致病性细菌科的相对丰度更高，包括拟杆菌科、螺杆菌科和普雷沃氏菌科，这些细菌科通常与肠道炎症相关，而抗炎类群如毛螺菌科的丰度则有所降低（补充文件3：图4E）。与斑马鱼中的观察结果一致，这些数据可能反映了早期本研究探究了该症状前ALS-PDC小鼠模型中肠道微生物群的变化。但由于样本量有限导致缺乏统计学意义，目前无法得出明确结论。

BSSG 与糖皮质激素受体的相互作用：一种潜在的作用机制

为探究BSSG可能的作用机制，鉴于其与已知类固醇激素受体的结构相似性，我们检测了它是否能与这些受体相互作用。放射性配体结合实验结果显示，BSSG可使糖皮质激素受体（GR）与其放射性标记的特异性配体([{3} H])-地塞米松的结合受到12.5%的抑制，同时使雄激素受体（AR）与其放射性标记的特异性配体([{3} H])-甲泼尼龙的结合受到4.7%的抑制。实验未观察到其对雌激素受体（ER）、盐皮质激素受体（MR）或孕激素受体（PR）产生干扰（补充文件3：图3C）。

为验证 BSSG 是否在体内有效结合 Gr，我们利用了实验室近期构建的 cyp11c1 斑马鱼突变品系。与其他已发表的 cyp11c1（细胞色素 P450 家族 1 亚家族 C 成员 1）斑马鱼突变品系一样，纯合子cyp11c1 1{-1-} 无法合成活性糖皮质激素(GCs)，同时保留功能性的糖皮质激素受体（Gr）。为了可视化Gr的活性，将该cyp11c1突变体品系与转基因Tg(GRE:EGFP)品系进行杂交，该品系在Gr激活后会表达绿色荧光蛋白（GFP）（图5A）。因此，cyp11c1 1{-1-}；Tg(GRE:EGFP) 动物，缺乏内源性内源性的GCs，可用于在体内视觉区分BSSG与Gr的有效结合。在BSSG之后处理后，cyp11c1 1{-1}；Tg(GRE:GFP) 幼虫表现出肠道荧光显著增强，表明BSSG可有效调控Gr激活（图5B）。在喂食含BSSG饮食的成年转基因突变体中进行的相同分析也显示，肠道荧光显著增强（图5C）。肠道荧光的定量分析在cyp11c1 1^{+/+}；Tg(GRE:GFP)的幼虫和成体中表现出，与预期一致，基线信号更高cyp11c1 1{-/-}；Tg(GRE:GFP)，这是由于Gr被内源性糖皮质激素组成性激活由内源性糖皮质激素介导的糖皮质激素受体（Gr）激活。因此，对cyp11c1 1{+/+} ;Tg(GRE:GFP)品系的幼虫进行BSSG处理未能引起肠道荧光出现任何可检测的进一步增强。

图4 小鼠模型肠道炎症证据及肠道转录组分析。A 阿尔辛蓝染色的小鼠小肠组织切片放大图及杯状细胞数量定量（每种条件下取动物的3张图像，对应编号(N=6）。比例尺：200微米。B 小鼠肠上皮细胞顶端表面微绒毛的透射电镜图像。比例尺：1微米。放大框内为处理组小鼠的微绒毛，比例尺：500纳米。微绒毛长度定量（每种条件下取动物，对应编号(N=3）。C 喂食富含BSSG的食物15周后小鼠的体重变化。D 从小鼠小肠提取的RNA样本进行RNA测序分析的柱状图：上调基因的基因本体（GO）富集分析（GO生物学过程）。Dʹ 下调基因的基因本体（GO）富集分析（GO生物学过程）。E 差异表达基因的火山图：蓝色代表下调的差异表达基因，红色代表上调的差异表达基因，灰色代表未达到统计阈值（阈值对应编号(P<0.01）的无显著差异基因。Log2（倍数变化）的阈值（对应编号(Change) = pm 0.5）以虚线标示。F 小鼠小肠RNA样本中不同炎症相关基因的实时荧光定量PCR分析。每个点代表单个个体的组织样本，柱状图表示平均值±标准误。每种条件下动物数量N≥3。采用非配对t检验进行统计分析（对应编号*P<0.05、7、**P<0.01：**P<0.001

图5 体内BSSG与糖皮质激素受体的相互作用。A 用于获得cyp11c (1^{-1 /-} ;Tg(GRE: EGFP))个体的突变体和转基因斑马鱼品系杂交示意图。B (cyp11c+/+)和(cyp11c1) Tg(GRE:EGFP)斑马鱼幼鱼中肠的代表性放大图像，以及处理组幼鱼与对照组相比的平均荧光定量结果。虚线标注了分析区域。(N=3)次生物学重复。C 成年未处理（UT）的(cyp11c1t+)和(cyp11c1) Tg(GRE:EGFP)斑马鱼在喂食富含BSSG的食物15天后，其GC响应性肠道的20倍共聚焦代表性成像及积分光密度定量结果。(N≥3)只动物/处理组。柱状图显示平均值±标准误（SEM）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析。*P<0.05、****P<0.001、F ****P<0.0001 1。比例尺：200微米

糖皮质激素受体缺陷可减轻BSSG对基因表达的负面影响

为了确认糖皮质激素受体（Gr）在介导BSSG作用中的功能，我们利用了(n r 3 c 1{i a 30 / i a 30})斑马鱼突变体该品系（以下简称 (g r{-1-}），此前由我们实验室成功构建实验室中，(g r) 基因已被敲除（图6A）。

有趣的是，杯状细胞的数量没有差异与经 BSSG 处理的 (g r{-1-}) 幼虫相比，未观察到与经处理的野生型个体中观察到的情况相反（图1C），对照组（图6B）的情况则不同。同样，在喂食富含BSSG饲料的成年(g r{-1-})斑马鱼的肠道中，未检测到mmp9、il-4以及(il-13)的表达出现显著变化。这些研究结果表明，BSSG可能会干扰抗炎性粒细胞相关的活性。相反，与野生型动物中观察到的情况类似，casp8和nupr1的表达显著上调，这说明BSSG可能会通过粒细胞相关活性之外的多种途径和细胞靶点发挥作用（图6C上半部分和图6C'）。

有趣的是，经治疗和未治疗的 Tg ʎ (g r{-1-}) 斑马鱼的大脑中，mmp9、p62、atg5 和 lc3b 的 mRNA 水平也没有差异（图 6C 下方面板及图 6C）。

在体内实验证实BSSG与Gr之间存在潜在相互作用后，我们进一步探究了BSSG是否也会影响糖皮质激素/糖皮质激素受体（GCs/Gr）信号通路通常介导的基因表达精细调控。为此，我们检测了喂食BSSG的野生型（WT）成鱼肠道中Gr靶基因（如FKBP脯氨酰异构酶5基因fkbp5和叉头框蛋白O 3b基因foxo3b）的表达水平。结果显示，fkbp5的表达量显著降低，而foxo3b在处理组个体中呈下降趋势（图6D），这进一步验证了我们的假设。

Gr缺乏可缓解肠道肌肉收缩力和菌群组成的改变

为了评估BSSG对肠道神经肌肉功能的影响是否受Gr调控，我们采用了管理后(g r{-1-})成年斑马鱼的离体方法喂食富含BSSG的饲料后。我们观察到肠道来自(g r{-1-})动物的样本未显示任何变化BSSG 处理后，在氯化钾（KCl）、1 微摩尔氯化胆碱（CCh）以及 10 赫兹电场刺激（EFS）作用下的肌肉及神经元诱导收缩性维持与未处理的 (g r{-1-}) 相当的反应对照组（图7A-C；浓度-反应曲线见补充文件3：图2D、E）。这些数据表明，肠道动力障碍可能受BSSG的影响与Gr的相互作用，并在(g r{-1-})突变体中被消除品系此外，BSSG 处理似乎诱导的数量更少(g r{-1-}) 动物肠道微生物群组成的变化与野生型（WT）报道的结果相比，这些小鼠的相关指标有所不同（图7D、E）。在门水平上，除了厚壁菌门（Firmicutes）略有增加外，未检测到明显变化（图7D右侧）。在科水平上，我们观察到巴恩西埃拉菌科（Barnesiellaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和红球菌科（Rubritaleaceae）的丰度相似，这表明BSSG暴露对其具有有限的对(g r{-1-})个体中的这些细菌菌株产生影响（图7E，右侧）值得注意的是，Gr基因的缺失与肠道微生物群组成的基线差异相关。具体而言，(g r{-1-}) 号动物体内的梭杆菌门丰度更高，而厚壁菌门和放线菌门的占比则更低，这与野生型（WT）中观察到的结果相反。在科水平上，(g r{-1-}) 号样本中，梭杆菌科、丛毛单胞菌科和希瓦氏菌科的丰度高于野生型（WT）。尽管如此，我们的研究结果表明，BSSG 对肠道微生物群落的影响存在差异与野生型相比，(g r{-1-}) 动物的相关指标也得到了二维分析的支持对所有实验组进行了PCoA分析，并计算了扩增子序列变体（ASVs）的相对丰度（补充文件3：图5），其中无论是否进行BSSG处理，(g r{-1-})这些个体彼此之间的相似性都更高。

图6 (gr-)斑马鱼品系的杯状细胞分析与基因表达。A 利用(gr-1-)成年斑马鱼的实验设计示意图。B 对(gr-r)对照组和BSSG处理的幼鱼中肠进行阿尔辛蓝染色的杯状细胞数量分析。C 对来自(gr-)成年斑马鱼肠道（上图）和大脑（下图）RNA样本中不同炎症、应激和自噬相关基因的RT-qPCR分析。Cʹ 野生型和(gr-)成年斑马鱼肠道和大脑中关键标志物差异表达的示意图总结。细胞数值代表mRNA的含量及与各自未处理的野生型或(gr-)相比的统计学显著性（星号），二者均设为1。D 野生型成年斑马鱼肠道中Gr调控基因的RT-qPCR分析。每个点代表单个个体的组织样本。N ≥ 3只动物/条件。柱状图显示平均值±标准误。采用非配对t检验进行统计学分析。*P<0.05：**P<0.01；ns，无显著性差异

图7 gr-斑马鱼品系的肠道动力和肠道微生物群分析。A–C 对野生型（图表左侧）和gr-1-（图表右侧）成年斑马鱼离体肠道标本，经或未经BSSG处理后，40 mM氯化钾（KCl）（A）、1 μM卡巴胆碱（CCh）（B）、10 Hz电场刺激（EFS）（C）诱导的肠道收缩反应进行体外分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示，每个点代表单个个体的组织样本。每个实验条件下动物数量N≥4。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学分析。*P<0.05 8 *P<0.0 1；ns，无显著性差异。D、E 成年斑马鱼肠道微生物群分析。柱状图展示了野生型（图表左侧−/−侧）和gr-1-（图表右侧）斑马鱼肠道细菌门（D）和科（E）的相对丰度占比。

讨论

在本研究中，我们利用斑马鱼和小鼠模型，探究了BSSG摄入与被称为ALS-PDC的复杂神经退行性疾病发病之间的关联。

我们发现BSSG能被斑马鱼和小鼠有效吸收，并在体内引发与肠道内环境失衡相关的多种效应。受损的肠道上皮屏障、促炎状态、肠道功能受损以及微生物群改变，都是连接肠神经系统（ENS）和中枢神经系统（CNS）的肠-脑轴紊乱的典型特征。因此，我们提出以下假设：BSSG可能通过诱发肠道炎症、增加神经退行性病变的易感性来影响这一通路。

促炎活性似乎是由BSSG特异性引起的，这与已报道的单个糖基存在相关的毒性相符，因为β-谷甾醇未对LREs产生炎症效应，而LREs是不同斑马鱼模型中肠道炎症的标志物。杯状细胞数量减少以及agr2表达下降进一步证实了肠道动态平衡失调，agr2编码一种对肠道黏液生成至关重要的蛋白质。已知类似的改变会通过削弱上皮屏障来诱发肠道炎症。

此外，中性粒细胞向中肠募集、NF-κB通路的激活、细胞凋亡增加、肠样干细胞增殖能力下降以及免疫相关基因的上调，共同表明存在持续的炎症反应（图1）。事实上，基质金属蛋白酶9（mmp9）和信号传导与转录激活因子3（stat3）在免疫激活中发挥作用，而肠道肽转运体1（pept1）则受促炎细胞因子刺激。值得注意的是，炎症性肠病（IBD）患者及相关动物模型中这些基因的表达均有所上调。

向斑马鱼幼鱼和成体长期施用 BSSG 证实了肠道炎症表型，这与转录组学分析的结果一致（图 3）。除了基质金属蛋白酶9（mmp9）和肽转运体1（pept1）外，我们还重点关注了血清淀粉样蛋白A（saa）的上调——该蛋白参与核因子κB（NF-kB）信号通路的激活、促进基质金属蛋白酶9（mmp9）等下游基因表达，并调控中性粒细胞的迁移。同样，在消化道中表达的S100钙结合蛋白A10a（s100a10a）在肠道感染的幼鱼模型中可介导中性粒细胞的募集。S100a10a蛋白被认为是人类钙卫蛋白的同源蛋白，而钙卫蛋白是炎症性肠病（IBD）的另一项标志物。值得注意的是，帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）患者的粪便样本中该蛋白水平也会升高。

基于这些结果并参考先前的研究，我们构建了ALS-PDC症状前小鼠模型，重点研究经BSSG处理的动物的小肠（图4）。与在斑马鱼中的观察结果一致，对小鼠小肠的RNA测序分析显示，大多数差异表达基因（DEGs）均参与免疫反应的调控。Toll样受体（TLRs）显著上调：Tlr-2、(T l r-4)以及(Tlr-6)，还有NOD样受体，均与NF-κB通路的激活[57]以及IL-(1 beta)的产生相关。此外，我们观察到参与NF-κB通路、Nlrp3组装和炎症小体激活的多种因子发生改变，同时Ikb-α的表达下调（该基因通常通过负反馈调控炎症反应），这表明BSSG处理后该通路的功能受损，进而引发慢性炎症。与之一致的是，炎症性肠病（IBD）患者和动物模型中TLRs的表达水平升高，NF-κB和NLRP3持续激活，促炎细胞因子如IL-(1 beta)和IFN-γ的水平也显著升高。值得注意的是，在帕金森病（PD）患者的肠道活检组织中也观察到这些相同促炎基因的表达增加，这进一步证实了肠道炎症与神经退行性疾病易感性之间存在关联。经BSSG饮食干预后，处理组小鼠固有层中巨噬细胞的数量增多，这也进一步证实了免疫反应被激活（补充材料3：图4A）。

此外，参与黏液层正常分布的抗菌肽 REG3.(-Y)在我们的模型中被下调。与此一致，我们观察到产黏液的杯状细胞数量减少，这与经处理的斑马鱼幼虫中已观察到的现象一致。在上调的小鼠差异表达基因中，我们发现了富含亮氨酸重复激酶2（Lrrk2），它是帕金森病（PD）最相关的遗传风险因素之一。在肠道中，LRRK2 蛋白通过正向调控核因子-κB（NF-kB）参与免疫系统激活，且研究综述指出，在炎症性肠病（IBD）小鼠模型和帕金森病患者中，其表达升高均与促炎效应相关。

我们的斑马鱼模型提供了证据，表明这种炎症状态也与肠道生理的显著改变相关，这一现象在斑马鱼急性和慢性暴露于BSSG后均被观察到（图2A-F）。蠕动失调和胃肠道转运延迟是炎症性肠病（IBD）公认的标志，同时也被发现是自闭症谱系障碍以及帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病的前驱症状。事实上，便秘可能在患者出现典型运动症状的数年前就已出现。我们首次将离体肠道收缩力分析技术应用于成年斑马鱼肠道，这一创新分析为肠神经系统（ENS）功能受BSSG摄入影响提供了有力证据。多项研究发现表明，肠道肌肉肥大和收缩亢进与感染以及促炎细胞因子表达增加存在关联。其中，白介素-4（IL-4）和白介素-13（IL-13）是导致小鼠在肠道炎症或肠道感染期间肠道平滑肌收缩增强的关键因素。此外，葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型显示，胆碱能受体激动剂（CCh）刺激后神经肌肉收缩增强。综合来看，这些数据表明BSSG的摄入会影响肠道的肌肉和神经元成分，改变胃肠蠕动，并可能对肠神经元造成损伤。

对经处理的成年斑马鱼肠道微生物群的初步分析（图2G、H）显示，变形菌门的丰度更高，而厚壁菌门的丰度降低，这与三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的肠道炎症相关研究以及炎症性肠病（IBD）患者的研究结果一致。此外，厚壁菌门/拟杆菌门比例降低已被证实与炎症性肠病相关，而本研究中观察到的细菌门/科相对丰度变化，与暴露于污染物导致菌群失调的斑马鱼所出现的变化相似。值得注意的是，在阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病中也发现了类似的肠道微生物群改变，这些疾病中细菌群落的变化可能早于疾病发作。

根据肠-脑轴假说，我们在斑马鱼模型中研究了BSSG是否对中枢神经系统产生有害影响。在经处理的成年斑马鱼大脑中，我们发现自噬相关基因的表达降低，这表明自噬过程可能受损。仅这一功能障碍就可通过促进神经毒性蛋白聚集体的积累诱导神经退行性病变。然而，这一方面需要更广泛且针对性的分析。

使用缺乏糖皮质激素（GCs）合成相关基因（cyp11c1）和信号传导相关基因（gr）的斑马鱼突变品系获得的数据表明，BSSG 可能通过与糖皮质激素受体（Gr）相互作用来发挥部分作用。特别是，荧光信号强度增加荧光在经处理的(cyp11c1 1{-1-})；Tg(GRE:GFP)斑马鱼体内肠道（图5）表明这种甾醇衍生分子可干扰糖皮质激素受体的核转位与活性。此外，无显著变化在 (g r{-1-}) 处理的幼虫中，杯状细胞数量无显著变化，且仅在intes中发生轻微的基因表达变化喂食BSSG的(g r{-1-})成年斑马鱼的肠道和大脑以及在体外观察到的它们不变的肠道神经肌肉活性（图6和7），表明炎症和神经肌肉信号可能至少部分地由BSSG与Gr的相互作用介导。fkbp5和foxo3b都直接受到Gr的调节，分别通过抑制NF-kB通路来调节对GCs的敏感性和解决炎症。它们在治疗WT斑马鱼肠道中的表达减少（图6D），可能是由于Gr功能的局部损伤，支持BSSG暴露后抗炎活性降低的假说。值得注意的是，最近的证据表明，DSS治疗的小鼠肠道GR的缺失加剧了炎症反应，突出了GR活性对IBD的保护作用。然而，尽管我们广泛的体内发现，但由于类固醇受体信号的复杂性，这一令人信服的假设需要进一步的体外验证。然而，改变的GCs水平和受损的GR调节已经与ALS、PD和AD等神经退行性疾病的发病机制和进展联系在一起，进一步支持BSSG通过靶向GR可能有助于ALS-PDC病因学的拟议机制。

结论

综上所述，本研究表明膳食中BSSG水平的升高会引发一种此前从未被报道过的明显肠道炎症。我们的研究结果显示，该分子最初会影响肠道区域，随后作用于中枢神经系统，促进神经退行性病变，最终可能导致肌萎缩侧索硬化症-帕金森痴呆复合体（ALS-PDC）的发生。肠道与中枢神经系统之间的这种相互作用凸显了肠-脑轴的相关性。此外，BSSG 与糖皮质激素受体（GR）的相互作用提示其抗炎活性可能受到调节，这凸显了肠道中糖皮质激素（GCs）生理功能的重要性——糖皮质激素在肠道中调控免疫稳态。根据肠-脑轴理论，对这类功能的干扰可能会加重炎症，进而可能导致神经退行性病变。因此，恢复肠道稳态有望成为预防疾病进展的潜在早期干预策略。