题目：Screening and characterization of a novel cupin-like polypeptide from Oyster (Ostrea gigas) and its anti-inflammatory effect via TAK1 mediated NF-κB pathway

原文链接:https://www.sciencedirect.com/journal/food-chemistry-x

期刊:Food Chemistry: X

摘要

炎症是宿主对损伤或感染的一种天然防御反应，而海鲜来源的多肽展现出显著的抗炎潜力，具有良好的应用前景。本文报道了从长牡蛎中分离的一种新型杯状蛋白样多肽OGP1-1的筛选、表征及抗炎活性评价。OGP1-1在体外对RAW264.7巨噬细胞以及体内的转基因斑马鱼模型均表现出显著的抗炎作用。化学蛋白质组学鉴定出转化生长因子β激活激酶1（TAK1）为其直接分子靶点，分子对接和动力学模拟证实该多肽可与TAK1的激活环稳定结合。机制研究表明，OGP1-1通过抑制TAK1介导的核因子κB（NF-κB）信号通路发挥抗炎作用。综上，本研究表明OGP1-1是一种具有强效抗炎活性的新型杯状蛋白样多肽，有望开发为用于炎症管理的功能性食品原料。

引言

炎症是一个重要的进行性过程，主要由防御反应构成，发生在身体受到致炎因子损伤之后。慢性炎症会破坏宿主的免疫耐受，导致相关免疫细胞被激活，进而产生炎症介质，包括细胞因子、前列腺素、花生四烯酸和组胺（Hamidzadeh 等人，2017；Rogovskii，2020）。炎症介质会激活细胞内和细胞外的炎症信号通路，促使免疫细胞产生大量的白细胞介素-1β（IL-1β）、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及其他促炎细胞因子（Hamidzadeh 等人，2017；Turner 等人，2014）。转化生长因子-β（TGF-β）激活激酶1（TAK1）属于丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族，是炎症信号级联反应中的关键调节因子（Xu & Lei，2020）。包括IL-1β、TNF-α、TGF-β和COX-2在内的多种促炎介质能强效刺激其酶促功能（Xu 等人，2020）。此外，TAK1还发挥着关键作用TAK1通过磷酸化介导下游激酶MKK4和MKK3/6的激活，从而调控JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（Zhao等人，2023）。要实现激酶的完全活性，TAK1需与其结合蛋白TAB1相互作用，后者通过直接的结构域结合，促进TAK1激活环内特定残基（苏氨酸184、苏氨酸187和丝氨酸192）发生自身磷酸化（Huang等人，2025）。 越来越多的证据表明，TAK1是多种炎症性疾病（包括自身免疫性疾病和神经炎症性疾病）发病机制中的核心介质。其能够协调炎症信号传导、组织重塑、细胞凋亡、增殖和细胞应激适应等关键过程的能力，凸显了其治疗潜力。天然来源的小分子抑制剂，包括5Z-7-氧代泽兰醇和他克尼布，已在临床前模型中展现出良好效果，可通过选择性抑制TAK1激活并减轻炎症驱动的病理改变（Benedik等人，2025；Totzke等人，2017）。除这些靶向合成抑制剂外，临床上广泛使用的糖皮质激素和非甾体抗炎药（NSAIDs）也被发现可使TAK1失活（Bhattacharyya等人，2010；Shin等人，2011）。然而，糖皮质激素和非甾体抗炎药的不良反应，包括库欣综合征、凝血异常以及过敏反应等，可能导致个体免疫力受损和代谢失调（Panchal & Prince Sabina, 2023）。因此，TAK1 作为治疗炎症性疾病的潜在靶点受到了广泛关注，研究人员大力致力于开发源自天然分子的新型安全抑制剂。值得注意的是，尽管天然多肽具有高特异性和相对低毒性的治疗潜力，但靶向 TAK1 的多肽抑制剂的发现与表征相关研究仍严重不足，这是该领域的一个明显空白。

与此同时，对安全有效的抗炎剂的研究越来越转向海洋生物。由于所处极端的生存环境，海洋生物是一座结构独特、尚未被充分开发的巨大分子宝库（Cheung 等人，2016；Shin 等人，2011）。与陆生生物相比，生长在特殊生态环境中的海洋生物不仅具有独特的形态特征，其代谢和防御系统也存在差异。因此，海洋生物中会产生并积累大量具有特殊结构和功能的生物活性分子，包括大环内酯类、萜类、多肽和多糖等。 从海洋生物尤其是海产品中提取的多肽因其独特的抗炎特性，已受到广泛关注（Ahmad 等人，2018）。研究人员从海参中分离出三种具有显著抗炎活性的多肽（Z. Zhang 等人，2026）。此外，研究人员从三文鱼副产物水解物中纯化出 PAY 和 SPHF1 两种多肽，二者均表现出突出的抗炎作用（Ahn 等人，2012；Ahn 等人，2015）。这些多肽可阻断 NO/iNOS 和 PGE2/COX-2 信号通路，从而抑制 RAW264.7 巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎细胞因子的合成（Ahn 等人，2012；Ahn 等人，2015）。 近期，研究人员在东亚知名海产品海马属生物中发现了多种抗炎多肽（Z. Zhang 等人，2024）。此外，从海洋软体动物（尤其是海螺）中还鉴定出一类名为芋螺毒素的神经毒性多肽。芋螺毒素可通过抑制或调节烟碱型乙酰胆碱受体及钙通道的激活，干扰疼痛信号传递并减轻炎症反应（Holmes，2014；Kutzsche 等人，2024）。齐考诺肽是一种合成多肽，源自从魔术芋螺毒液中纯化的天然ω-芋螺毒素 MVIIA，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，成为缓解重度慢性炎性疼痛的药物（Kutzsche 等人，2024）。 这些研究成果激发了人们对海产品多肽的开发与应用热情，也凸显了其作为可持续、新型抗炎分子来源的潜力，为推动人体健康发展提供了新方向。

牡蛎（长牡蛎）是一种具有重要经济价值的贝类，广泛分布于亚太地区的沿海国家。凭借鲜美的风味和良好的经济价值，它已被养殖多年（苗等，2018）。牡蛎在中医药中应用广泛，常与其他药材配伍入药，可治疗心悸、失眠、眩晕、耳鸣、瘰疬、痰核、癥瘕痞块等病症（关与王，2009）。牡蛎的药理作用包括抗疲劳、抗肿瘤、抗胃溃疡、镇静、抗炎及抗病毒等（关等，2009）。牡蛎可调节多种生理过程，且被列入中国卫生健康委员会发布的药食同源食品名录（张等，2014）。近期研究表明，牡蛎肽具有抗炎活性。牡蛎低分子量肽提取物能够减轻脂多糖（LPS）诱导的急性结肠炎炎症反应（吴等，2024）。此外，从牡蛎肉水解物中分离出的多种寡肽，包括酪氨酸-丙氨酸（YA）、苏氨酸-色氨酸-脯氨酸（TWP）、苏氨酸-丙氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸（TAMY）以及苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-丙氨酸（FPGA），已被证实具有抗炎特性，可有效调节炎症介质的释放（Shen 等人，2023；Siregar 等人，2021）。因此，牡蛎因其巨大的经济价值、在中医中的药用价值以及先前研究中证实的肽提取物抗炎活性而成为研究重点（Guan 等人，2009；Shen 等人，2023；Siregar 等人，2021；Wu 等人，2024）。然而，目前关于牡蛎来源抗炎肽的研究主要集中在短寡肽上。因此，结构明确的大分子多肽的潜力在很大程度上仍未被探索，这是一个重要的知识空白。

近年来，斑马鱼（斑马拟丽鱼）模型已成为评估食品来源生物活性化合物抗炎活性的宝贵体内平台。与传统哺乳动物系统相比，该模型具有多项显著优势，包括繁殖力高、早期发育阶段具有光学透明度，以及与人类高度的遗传和生理保守性（Gut 等人，2017）。值得注意的是，带有荧光标记免疫细胞的转基因斑马鱼品系 Tg(Lyz:EGFP) 能够实时观察巨噬细胞和中性粒细胞在炎症刺激下的迁移情况，为抗炎功效提供了直接且直观的检测结果（Olivari 等人，2008）。斑马鱼生长速度快、成本低，且符合 3R（替代、减少、优化）原则，这些特点进一步支持了其作为功能性食品成分初始体内筛选模型的应用。

食物来源生物活性分子分子机制的阐明越来越依赖计算方法，如今这些方法已成为该领域不可或缺的工具。其中，分子对接和分子动力学模拟能够在原子分辨率下预测并表征分子间相互作用。分子对接可快速筛选潜在结合位点与构象，而分子动力学模拟则能在接近生理的条件下，对配体-受体复合物的稳定性和能量学提供动态解析（Aguiar & Camps, 2025；Hou 等人, 2025）。这些计算机模拟方法不仅加快了靶点识别进程，还能提供指导实验验证的机制见解，对于研究结构复杂性较高的多肽-蛋白质相互作用而言，具有尤为重要的价值。

本研究详细阐述了从长牡蛎中提取的新型多肽OGP1-1的纯化及理化性质检测，这是我们开展牡蛎物种生物活性多肽系列研究的一部分。研究探究了OGP-1的体外抗炎活性及其分子作用机制，采用斑马鱼炎症模型评估了其体内抗炎活性。此外，研究还结合化学蛋白质组学与计算模拟技术，进一步阐明了该多肽的直接作用靶点及潜在作用机制。

结果与讨论

牡蛎内脏团抗炎多肽的筛选与纯化

从海洋生物中获取的多肽是营养科学领域的宝贵资源，蛋白质化学的当代研究重点关注其多样的生物活性和治疗潜力。长牡蛎作为一种全球知名的海鲜，同时也是中国传统海洋药材，据中国史料记载，其在抗炎治疗方面展现出良好疗效。本研究对长牡蛎多肽提取物中的抗炎活性成分进行了筛选。通过硫酸铵分级分离、尺寸排阻色谱和反相高效液相色谱的连续纯化步骤，分离得到一种多肽，命名为 OGP1-1（图 1A、B）。体外抗炎筛选实验显示，该多肽能抑制 RAW264.7 细胞中一氧化氮（NO）的产生（图 1D）。从长牡蛎可食用部分（鲜重）中提取 OGP1-1 的最终得率为 0.00625%。经考马斯亮蓝法测定，OGP1-1 的蛋白质含量为 99.0%（质量分数）。糖类分析证实其无糖基化修饰，符合非糖肽的定义。反相高效液相色谱分析显示其为均一物质，呈现单一对称的色谱峰（图 1C）。研究结果表明，OGP1-1 很可能是一种天然纯净的非糖肽。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是基于蛋白质分子量对其进行分离和分析的重要方法。通过还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了OGP1-1的亚基组成（图1E）。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示，OGP1-1是一种单体多肽，近似分子量为12千道尔顿。电泳图谱未检测到杂质，单一的条带表明其组成均一性良好。实验结果证明，纯化后的OGP1-1为均一的单体多肽。

我们进一步评估了OGP1-1在脂多糖（LPS）激活的小鼠RAW264.7巨噬细胞中的细胞相容性和抗炎潜力。如图1F所示，OGP1-1在所有测试剂量下均表现出无毒特性，从而证实其适合用于后续研究。

一氧化氮（NO）作为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在脂多糖（LPS）刺激后过度产生的主要炎症介质，会导致病理性炎症和内毒素血症（阿布拉伊提等，2024）。抑制iNOS诱导的NO过量生成是缓解炎症级联反应的一种治疗策略。研究人员用不同剂量的OGP1-1预处理巨噬细胞，再使其暴露于脂多糖（LPS）环境中，随后检测一氧化氮（NO）的含量。未处理的细胞基础NO水平为3.73微摩尔，经脂多糖（LPS）刺激后NO水平升至20.72微摩尔，这表明RAW264.7细胞出现了显著的炎症激活。OGP1-1预处理以剂量依赖的方式显著降低了脂多糖（LPS）诱导的NO含量升高（图1G，(P<0.01）。这些研究结果与以往的研究一致，即海鲜来源的生物活性多肽可抑制脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中iNOS介导的NO合成（金等，2016；沙希迪&赛义德，2025）。具体而言，多种抗炎肽源自鲑鱼副产物水解物（Ahn 等人，2012；Ahn 等人，2015）和马氏珍珠贝（Shen 等人，2023）据报道可抑制一氧化氮（NO）和促炎细胞因子的产生。与这些短链寡肽 (molecular weight <1 kDa ) 相比，OGP1-1 是一种更大的（11.95 千道尔顿）多肽，具有明确的杯状结构域，这表明其生物活性具有独特的结构基础。

OGP1-1的结构表征

质谱法是多肽研究中的有效工具用于鉴定、定量和分析。通过电喷雾电离（ESI）质谱法测得其精确分子量为11.950千道尔顿（图2A），这与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的结果相符。先前的研究已对几种源自牡蛎水解物、分子量小于(<1 kDa)的抗炎肽展开了研究（Ngandjui、Kereeditse等，Kamika、Madikizela 与 Msagati，2024；Shahidi 等人，2025）。三种源自马氏珠母贝（Pinctada martensii）肉水解物的肽——TWP（402.19 道尔顿）、TAMY（484.19 道尔顿）和 FPGA（390.19 道尔顿），具有抗炎活性（Shahidi 等人，2025）。与类似小分子的低分子量肽相比与小分子相比，多肽具有更复杂的空间结构（L. Wang 等人，2022）。这有助于形成稳定的三维构象，从而增强与炎症受体的结合能力。此外，多肽在较低剂量下就表现出更强的生物活性，且不易被蛋白水解酶快速降解（Apostolopoulos 等人，2021）。

图1. 从巨藻（O. gigas）中多肽OGP1-1的纯化与鉴定。(A) 通过TSKgel G2000SWXL色谱柱分离(o.)多肽提取物。(B) 通过C18反相高效液相色谱（RP-HPLC）色谱柱从合并的多肽组分中分离天然OGP1-1（绿色箭头）。(C) 反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测的OGP1-1纯度图谱。(D) P1-P4组分对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮（NO）生成的抑制作用。进行三次独立实验并计算平均值±标准差**P<0.01 与对照组相比；# P<0.05、##P < 0.01 vs与脂多糖（LPS）组相比）。(E) OGP1-1的还原与非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱。泳道1为Marker，泳道2为OGP1-1还原样品，泳道3为Marker，泳道4为OGP1-1非还原样品。(F) OGP1-1对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响。(G) OGP1-1对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮（NO）生成的抑制作用。进行三次独立实验并计算平均值±标准差 **P<0.01 与对照组相比；#P<0.05、# #P < 0.01 vs 与脂多糖（LPS）组相比）。（欲解读本图例中颜色的参考意义，请查阅本文的网络版本。）

图2.PBS 溶液和蒸馏水中的光谱。（E）利用 AlphaFold 建模得到的 OGP1-1 三维预测结构。（F）图 2 的蛋白质结构域预测。OGP1-1 的结构表征与理化性质分析。（A）通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）测定的 OGP1-1 分子量。（B）OGP1-1 的紫外-可见光谱。（C）OGP1-1 分别在 PBS 溶液和蒸馏水中的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。（D）通过圆二色谱法测定 OGP1-1 的二级结构。（G）OGP1-1 与杯蛋白超家族其他多肽的序列比对。相同氨基酸残基以红色背景标注。（如需解读本图注中颜色的相关参考，读者可查阅本文的网络版本。）

对OGP1-1的理化特性进行了进一步评估。图2B展示了OGP1-1的紫外-可见吸收光谱。该光谱在约200纳米处呈现强吸收峰，在280纳米处出现肩峰。这些分别对应OGP1-1多肽主链结构和芳香族氨基酸残基的特征吸收。

傅里叶变换红外光谱法是阐明多肽结构和构象动态变化的有效方法。如图2C所示，在傅里叶变换红外光谱中，于(1635.86 ~cm^{-1})处检测到酰胺I带，在(1680.32 ~cm^{-1})处检测到强度较弱的酰胺I带。在1538.52 (cm^{-1})处观察到代表酰胺II的较强吸收峰。光谱中3280.08至(3424.47 ~cm^{-1})范围内的宽吸收带由羟基伸缩振动引起。酰胺I带位于1600至(1700 ~cm^{-1})（C=O伸缩振动）之间，酰胺II带大致位于(1550 ~cm^{-1})（(C=N)伸缩振动与N-H弯曲振动耦合）处，表明OGP1-1中酰胺I和酰胺II的吸收分布与多肽的典型吸收带一致（Lorenz-Fonfria, 2020）。此外，β-折叠带的频率和反平行β-折叠结构的高频振动通常分别对应约1680和(1630 ~cm^{-1})处的吸收带频率（Lorenz-Fonfria, 2020）。OGP1-1中1680.32和(1635.86 ~cm^{-1})处的特征吸收峰表明其存在显著的β-折叠二级结构。近期研究表明，具有β-折叠二级构象的多肽具有更好的抗炎活性（Cho et al., 2025）。

多肽的二级结构可通过圆二色性（CD）光谱法快速测定。图2D显示，OGP1-1的CD光谱中218 nm处的强负椭圆度信号和195 nm处的显著正峰是多肽β-折叠结构的特征。利用Jasco二级结构分析程序分析获得的CD光谱结果表明，OGP1-1的二级结构组成为50.1%的β-折叠、6.9%的α-螺旋、9.0%的β-转角和34.0%的无规卷曲。超过65%的二级结构包含α-螺旋、β-折叠和β-转角的总含量。OGP1-1似乎是一种具有稳定且高度有序结构特征的多肽。生物大分子（尤其是多肽）在生物体的环境条件下存在，其中外部介质在蛋白质的功能和稳定性中起关键作用。磷酸盐缓冲液（PBS）是生物体细胞外液的酸碱缓冲体系之一。我们随后测定了OGP1-1在PBS中的CD光谱，该光谱在约208 nm和222 nm处呈现两个特征性负峰，与去离子水中获得的CD图谱一致（图2D）。该结果与源自南美树蛙（Hypsiboas raniceps）表皮分泌物的抗炎肽AC12相似，后者具有β-折叠-转角-β-折叠结构，并能有效降低IL-12、TNF-α和NO等炎症指标（Popov等人，2019）。越来越多的证据表明，高β-折叠含量有助于生物活性肽的抗炎活性。例如，来自牡蛎水解物的富β-折叠肽对脂多糖（LPS）诱导的炎症具有强效抑制作用（Cho等人，2025）。同样，合成的β-折叠肽已被证实可干扰Toll样受体4（TLR4）信号通路，从而减少细胞因子释放。这些研究结果表明，OGP1-1优势的β-折叠构象可能对其与转化生长因子β激活激酶1（TAK1）的稳定结合及后续的抗炎效应至关重要。

此外，本研究采用串联质谱（MS/MS）技术确定了OGP1-1的完整氨基酸序列。经胰蛋白酶酶解后，对所得肽段进行检测，并与牡蛎转录组数据集进行比对（表S2）。序列分析结果显示，OGP1-1含有101个氨基酸残基。等电点预测为9.27。研究人员利用AlphaFold建模预测了OGP1-1的三维构象（图2E）。功能结构域注释进一步在OGP1-1内部鉴定出一个特征性杯状结构域，该结构域以保守的β8-桶状折叠为特征，从而证实其属于杯状超家族（图2F）。

借助NCBI平台并采用BLASTp算法进行序列同源性分析。经鉴定，葡萄牙牡蛎（Ostrea angulata）中未表征蛋白LOC128156200与OGP1-1完全一致。如图2G所示，OGP1-1与杯状超家族的多肽存在一定相似性。此外，分析结果显示这些多肽的二级结构分布具有一致性，据此可将OGP1-1鉴定为类杯状多肽。

OGP1-1 对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞促炎细胞因子产生的影响

炎症介质的高表达，尤其是促炎细胞因子，与慢性炎症状态的维持相关，而慢性炎症是多种人类疾病的核心致病因素（Y. Liu 等人，2025）。鉴于这种致病关联，优先减少促炎细胞因子的产生对于预防慢性炎症至关重要。我们通过qPCR或ELISA实验评估了OGP1-1对促炎细胞因子的抑制作用。如图3所示，与未处理的对照组相比，LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的IL-6、TNF-α和(IL-1 beta)分泌水平显著升高(P<0.01)。值得注意的是，用5和10 μM的OGP1-1预处理后，这些细胞因子的分泌呈剂量依赖性降低(P<0.01)，其中IL-6对抑制作用的敏感性最高。这些结果证实OGP1-1能有效抑制促炎细胞因子的分泌，凸显了其改善炎症级联反应的潜力。

OGP1-1 对 iNOS/COX-2 蛋白表达的影响

iNOS 和 COX-2 的过表达已被确定为慢性炎症性疾病的关键因素。在炎症条件下，这些酶会促进一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的过量生成，加剧组织损伤和全身性炎症（X. Liu 等人，2024）。多种刺激物，包括促炎细胞因子和细菌脂多糖（LPS），可能通过激活转录因子核因子-κB（NF-κB）来调节 iNOS 和 COX-2 的合成（Q. Li & Verma，2002）。为了确定 OGP1-1 是否抑制 NO 和促炎细胞因子的产生，通过蛋白质印迹法在 RAW264.7 巨噬细胞中检测了 COX-2 和 iNOS 的蛋白表达。如图 4 所示，与未处理的对照组相比，LPS 刺激显著提高了 iNOS 和 COX-2 的蛋白水平，从而验证了炎症系统的激活。值得注意的是，OGP1-1 预处理显著抑制了 LPS 诱导的蛋白过表达，在 10 μM 浓度下，iNOS 和 COX-2 的蛋白表达几乎被完全抑制（图 4B、C）。

热稳定性与pH稳定性

OGP1-1对一氧化氮生成的抑制能力在很大程度上不受热处理的影响。如图S2A所示，暴露于25至100摄氏度温度范围内的样品，其一氧化氮浓度在8.62至12.06微摩尔之间，不同处理组之间无统计学显著差异。同样，该肽在较宽的pH范围（pH 3-11）内仍保持其功能活性，测得的一氧化氮水平为9.55至12.18微摩尔（图S2B），且不同pH条件下未检测到显著差异。考虑到食品加工和储存过程中温度和pH的变化较为常见，生物活性的保留在这类压力下是一项关键功能属性。数据证实，OGP11 在暴露于高温及多种pH环境后，仍能有效保留其抑制一氧化氮的活性。

图3. OGP1-1处理对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中促炎细胞因子表达和产生的影响。(A) ELISA法检测LPS激活的RAW264.7巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1细胞因子水平。(B) qRT-PCR检测LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中TNF-α、IL-6和IL-1的mRNA水平。进行三次独立实验，计算平均值±标准差（与对照组相比；与LPS组相比）。

OGP1-1在斑马鱼模型中的抗炎作用

我们利用斑马鱼进行体内研究，以进一步证实OGP1-1的抗炎作用。斑马鱼是一种重要的动物模型，具有繁殖速度快、基因组相似度高和体内成像能力强等特点，已被广泛应用于炎症研究。如图5A、B所示，斑马鱼模型组免疫细胞的迁移率与空白对照组相比显著升高，表明暴露于(CuSO_{4})该溶液引发了炎症反应（Olivari 等人，2008年）。与模型组相比，布洛芬联合OGP1-1治疗使斑马鱼免疫细胞的迁移数量显著减少(P<0.01)。此外，OGP1-1治疗组的免疫细胞数量呈剂量依赖性下降，表明OGP1-1具有抗炎作用。

OGP1-1对斑马鱼炎症相关基因表达水平的影响

为进一步验证体外实验结果，我们通过 qPCR 检测法评估了斑马鱼中促炎基因的表达水平。如图 5C-F 所示，(CuSO_{4}) 显著提高了表达与空白对照组相比，模型组中白细胞介素-1β、环氧合酶-2、(tnf-a) 以及诱导型一氧化氮合酶2b的表达水平为(P<0.01)；而OGP1-1则有效抑制了这些基因的上调表达(P<0.01)。与其他动物模型相比，斑马鱼特异性抗体极为罕见（Gut等人，2017年）。考虑到斑马鱼与哺乳动物在生理和代谢方面的差异，未来研究将利用小鼠等多种动物模型，进一步探究OGP1-1的抗炎机制并确定其靶蛋白。

图4. OGP1-1处理对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中iNOS和COX-2蛋白表达的影响。(A) 蛋白质水平通过蛋白质印迹分析测定；(B) COX-2蛋白的相对水平；(C) iNOS蛋白的相对水平。进行三次独立实验以计算平均值和标准差（与对照组相比，*P<0.01、# P<0.05、###P < 0.01；与LPS组相比）。

基于化学蛋白质组学检测的OGP1-1在脂多糖诱导的RAW264.7细胞中直接靶向TAK1

为了确定 OGP1-1 的潜在分子靶点，我们采用了化学蛋白质组学策略，如图 6A 所示。用脂多糖（LPS）刺激的 RAW 264.7 细胞与浓度递增的生物素偶联 OGP1-1（OGP1-1-P）共同孵育。随后裂解细胞，并通过非共价亲和结合进行链霉亲和素磁珠下拉实验。被 OGP1-1-P 捕获的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。设置对照实验以验证条带的特异性。OGP1-1-P 的标记图谱如图 6B 所示。

我们进一步在原位评估了OGP1-1与OGP1-1-P之间的竞争性结合。用未修饰的OGP1-1预处理会导致OGP1-1-P的标记强度呈浓度依赖性降低，且在 50 微摩尔浓度的竞争物作用下信号几乎完全消失（图 6C）。这些结果表明 OGP1-1-P 能特异性地与 OGP1-1 的天然细胞靶点结合。

为了对捕获的蛋白质进行表征，按照既定程序对亲和富集样品进行消化处理，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析（C. Li 等人，2024）。将肽段谱图与蛋白质身份进行匹配后，利用散点图对高可信度候选蛋白进行可视化（图6D）。筛选标准为：探针/竞争组的倍数变化≥2，探针/对照组的倍数变化≥5，分别得到77个和265个潜在靶标。对这两组蛋白取交集，共鉴定出72个共有蛋白（图6E）。基因本体论分析显示，这些蛋白在蛋白质结合以及细胞质和核质中的蛋白质加工过程中显著富集（图6F）。

在候选相互作用蛋白中，转化生长因子-β激活激酶1（TAK1）因竞争结合比排名第一而被优先筛选。TAK1是核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的核心调控因子，可激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38等下游通路，与应激反应、细胞凋亡及炎症过程密切相关（Xu等人，2020）。TAK1表达升高与肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎及心血管损伤等病理状态相关（Dai等人，2022；W. Wang等人，2021）。因此，我们推测TAK1可能是OGP1-1的关键靶蛋白。

此外，我们通过微量热泳（MST）验证了这一相互作用，证实其直接结合的解离常数（Kd）为3.44微摩尔（图6G）。细胞热转移实验（CETSA）进一步提供了支持证据：OGP1-1处理显著提高了细胞裂解液中TAK1的热稳定性（图6H），这与靶点结合的结果一致。

OGP1-1与TAK1结合的分子对接及分子动力学模拟分析

分子对接是一种用于预测配体（包括多肽或小分子）与受体蛋白之间原子级相互作用的计算方法。通过对结合过程的模拟，它有助于确定最佳的结合构象和相互作用强度，通常以结合分数或自由能值来量化。该方法为分子识别事件的结构和功能特征提供了关键见解，是生物分子研究、药物开发和多肽设计中的核心技术（Aguiar 等人，2025；Hou 等人，2025）。鉴于 OGP1-1 具有显著的抗炎特性和 TAK1 结合能力，本研究针对 TAK1-TAB1 嵌合体（PDB: 5V5N）开展了分子对接实验，因为 TAK1 的完全激活依赖于结合蛋白 TAB1。在结构上，TAK1 的 N 端区域包含一个关键的激酶结构域，C 端则带有一段尾区（Brown 等人，2005）。激酶结构域内存在一个保守的激活环（Ala179-Lys190），它介导了 TAK1 自身磷酸化所需的构象重排。值得注意的是，TAK1 抑制剂他替尼（takinib）已被证实能精准结合至该激活环（Totzke 等人，2017）。TAK1-OGP1-1 复合物的结合位点也位于该凹槽内。计算得出 TAK1 与 OGP1-1 的结合能为 -8.58 千卡/摩尔，表明二者具有较高的结合亲和力。对接构象分析（图 7A 和 B）显示，OGP1-1 与 TAK1 的结合主要通过疏水作用力、静电相互作用和氢键实现。具体而言，OGP1-1 结合在由 17 个残基构成的疏水凹槽中，这些残基包括 Ile75、Val76、Thr178、Ala179、Asp181、Ile182、Gln183、His185、Met186、Thr187、Ala193、Met196、Phe201、Glu202、Ala236、Met240 和 Trp241。其中，Ile75、Val76、Ile182 和 Trp241 四个疏水残基对相互作用贡献显著。OGP1-1 的羟基基团还与 TAK1 残基 Lys72、Arg155 和 His244 形成三个氢键，进一步稳定了结合状态（图 7B）。相比之下，对照化合物他替尼主要通过较少的残基结合与缬氨酸42、酪氨酸106和甘氨酸110形成疏水相互作用，同时与赖氨酸63和丙氨酸107形成氢键（托茨克等人，2017年）。OGP1-1占据的相互作用界面更广泛，尤其是在激活环区域，这表明其结合稳定性相较于他尼布。除他尼布外，另一种特性明确的 TAK1 抑制剂 5Z-7-氧代zeaenol 可与 ATP 结合口袋发生共价结合，并在临床前模型中展现出强效的抗炎活性（Benedik 等人，2025）。然而，其选择性不足的问题限制了临床转化。相比之下，OGP1-1是一种多肽，它能结合一个更广泛的疏水凹槽（包括激活环），有望实现更高的选择性。这种独特的结合模式可能会降低脱靶效应，使OGP1-1成为开发更安全的靶向TAK1的抗炎药物的有潜力的骨架。总体而言，这些结果表明，疏水相互作用和氢键是OGP1-1识别TAK1的关键机制。

图5. OGP1-1对(CuSO_{4})诱导的斑马鱼模型炎症的影响。(A) 不同组的代表性绿色荧光中性粒细胞（标尺(bar=200 mu m)）。白色箭头指示炎症细胞从循环系统迁移至受损的侧线神经。(B) 分别给予OGP1-1和布洛芬前后，斑马鱼炎症模型中巨噬细胞数量的定量分析。数据以平均值±*P<0.01表示；vs. 对照组；## (P<0.01) vs. (CuSO_{4})组，每组(n=10)条幼鱼。OGP1-1对斑马鱼炎症相关基因il-1β (C)、cox-2 (D)、tnf-α (E)和nos2b (F)表达水平的影响。基因mRNA表达以相对于对照组的倍数相对表达值表示。数据以平均值±标准差表示；({h+} P<0.01) vs. 对照组；## (P<0.01) VS. (CuSO_{4})组，每组(n=50)条斑马鱼幼鱼。（欲理解本图图例中颜色的参考意义，请查阅本文的网络版本。）

图6.同时在这两组中均富集的蛋白质的重叠部分。(F) 差异蛋白质基因本体论富集分析的散点图。(G) 结合常数（Kd）图6。化学蛋白质组学鉴定OGP1-1在RAW 264.7细胞中的结合靶点。(A) OGP1-1靶点化学蛋白质组学分析的通用流程。(B) OGP1-1探针（OGP1-1-P）在RAW 264.7细胞中的标记情况。(C) 过量OGP1-1对OGP1-1-P标记蛋白质的竞争作用。(D) 展示蛋白质差异富集情况的散点图，TAK1为潜在靶点（在OGP1-1-P/竞争组的倍数变化中排名第一）。(E) 显示OGP1-1与TAK1之间结合量的韦恩图，通过微量热泳动（MST）测定。(H) 细胞热位移实验-蛋白质印迹（CETSA-WB）及蛋白质水平的统计分析，数据以平均值±标准差表示；与对照组相比，*P<0.01存在差异。

图7. OGP1-1与TAK1结合的分子对接及分子动力学模拟分析（PDB 5V5N）。(A) OGP1-1（紫色）与TAK1（青色）的分子对接。黄色球体代表疏水相互作用界面。(B) OGP1-1与TAK1的结合模式。绿色虚线代表氢键。红色睫毛状曲线代表疏水相互作用。(C) 分子动力学模拟中0纳秒和100纳秒时OGP1-1（紫色）的构象。(D) 100纳秒分子动力学模拟中TAK1主链原子及复合物的均方根偏差波动。(E) TAK1 Cα原子的均方根涨落。(F) 回旋半径图。(G) 平均溶剂可及表面积图。(H) 利用MM-GBSA分析计算的最终100纳秒分子动力学模拟中的结合自由能。(I) 基于最终100纳秒分子动力学模拟的残基能量贡献分解。缩写：Et：总结合能；Ev：范德华能；Ee：静电能；Es：溶剂可及表面面积能；Ep：极性溶剂化能。（欲解释本文图例中颜色的参考，请查阅本文的网络版本。）

随后，分子动力学（MD）模拟被用于评估TAK1-OGP1-1复合物的结构稳定性和相互作用动力学。分子动力学模拟是一种通过对牛顿运动方程进行数值积分来研究分子体系时间依赖性行为的计算方法。该方法能提供近生理条件下分子相互作用、构象动力学和复合物稳定性的宝贵信息（Durrant & McCammon, 2011）。在本研究中，研究人员开展了时长100纳秒的全原子分子动力学模拟，以探究抗炎多肽OGP1-1与TAK1蛋白的关键结合行为（图7C）。

均方根偏差（RMSD）是分子动力学（MD）模拟中的关键指标，用于量化蛋白质相对于其初始结构的构象偏差，并反映体系是否达到平衡。如图7D所示，对单独TAK1以及TAK1-OGP1-1复合物体系均进行了100纳秒的分子动力学轨迹分析。在复合物体系中，TAK1的主链均方根偏差在前60纳秒内出现显著波动，表明其发生了结构重排，以与OGP1-1形成更稳定的结合界面。在此时间之后，均方根偏差数值趋于平稳，说明稳定的复合物已成功形成（翟等，2025）。

对最终100纳秒轨迹进行的均方根涨落（RMSF）分析显示，OGP1-1结合后，TAK1关键区域的柔性有所增加，尤其是在激活环（丙氨酸179-赖氨酸190残基，图7E）内。这表明与OGP1-1的相互作用诱导了局部构象调整，提高了残基的流动性，这一现象与此前关于TAK1-配体结合的研究报道一致（Chuanphongpanich等人，2023）。

回转半径（Rg）反映了整体结构的紧密程度，在整个模拟过程中，TAK1-OGP1-1 系统的回转半径均高于未结合配体的 TAK1（图 7F），这表明配体结合后蛋白质的构象更松散、扩张程度更大。溶剂可及表面积（SASA）结果也支持了这一观察，表明复合物的构象保持稳定（图 7G）。

对最终100纳秒轨迹进行的MM-GBSA计算得出，该复合物的总结合自由能（Eₜ）为-44.39千焦/摩尔（图7H），这表明二者发生了自发且强结合（李阳、徐健等，2024）。能量分解结果显示，范德华相互作用是主要的有利贡献项（-102.63千焦/摩尔），其次是静电相互作用和非极性溶剂化（Eₐ）项。相反，极性溶剂化能对复合物的形成起阻碍作用。与疏水效应相关的显著贡献，凸显了疏水驱动力在结合机制中的作用，这与此前针对蛋白质-肽系统的研究结果一致（龚等，2025）。

回转半径（Rg）反映了整体结构的紧密程度，在整个模拟过程中，TAK1-OGP1-1 系统的回转半径均高于未结合配体的 TAK1（图 7F），这表明配体结合后蛋白质的构象更松散、扩张程度更大。溶剂可及表面积（SASA）结果也支持了这一观察，表明复合物的构象保持稳定（图 7G）。

对最终100纳秒轨迹进行的MM-GBSA计算得出，该复合物的总结合自由能（Eₜ）为-44.39千焦/摩尔（图7H），这表明二者发生了自发且强结合（李阳、徐健等，2024）。能量分解结果显示，范德华相互作用是主要的有利贡献项（-102.63千焦/摩尔），其次是静电相互作用和非极性溶剂化（Eₐ）项。相反，极性溶剂化能对复合物的形成起阻碍作用。与疏水效应相关的显著贡献，凸显了疏水驱动力在结合机制中的作用，这与此前针对蛋白质-肽系统的研究结果一致（龚等，2025）。

残基水平的分解分析进一步确定了关键的结合贡献残基，包括Lys72、Ile75、Val76、Thr178、Ala179、Ile182、Thr184、His185、Thr187和Asn188。其中，Lys72、Arg155和His244形成了对复合物稳定性至关重要的氢键，而Ile75、Val76和Ile182主要提供范德华力稳定作用（图7B及图7I）。这些结果为OGP1-1与TAK1之间的相互作用提供了分子层面的见解。

OGP1-1通过TAK1介导的MAPK和NF-κB通路发挥抗炎作用

为了进一步阐明OGP1-1抑制TAK1活性并发挥其抗炎作用的机制，我们重点研究了参与炎症反应的关键信号通路。MAPK级联反应是已知其能促进免疫细胞内促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 和白细胞介素-1β）的产生。有研究表明，天然来源的生物活性多肽可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路来减轻炎症反应（娄等，2025；辛等，2025）。同样，核因子-κB（NF-κB）作为启动固有免疫反应和调控炎症基因表达的关键转录因子，需进入细胞核才能发挥作用（刘婷等，2017）。NF-κB 的持续激活与慢性炎症性疾病相关，这凸显了对其进行调控的重要性。此外，转化生长因子-β激活激酶1（TAK1）已被证实是调控 MAPK 和 NF-κB 通路的关键上游激酶。结合本研究的上述结果，我们提出燕麦球蛋白1-1（OGP1-1）通过调控 TAK1 依赖的 MAPK-NF-κB 轴，减轻脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞炎症反应。

蛋白质印迹分析显示，脂多糖（LPS）刺激显著增强了RAW264.7细胞中转化生长因子β活化激酶1（TAK1）以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和p38的磷酸化水平（图8A）。与骨生长因子肽1-1（OGP1-1）预孵育可浓度依赖性地抑制这些激酶的磷酸化，证实了其在缓解MAPK激活中的作用（图8B-D）。随后通过蛋白质印迹和免疫荧光染色评估核因子κB p65（NF-κB p65）的亚细胞定位发现，LPS促进p65大量核转位，而OGP1-1处理可显著减弱这一过程（图8E-H）。同时，LPS诱导的胞质中NF-κB p65水平下降在OGP1-1处理后得到逆转，这与NF-κB信号通路被抑制的结果一致。免疫荧光定量分析进一步验证了这些结果，表明OGP1-1处理后核内p65的荧光强度显著降低（图8I、J）。综上，这些数据证实OGP1-1主要通过干扰TAK1-MAPK-NF-κB通路发挥其抗炎作用。

杯状蛋白超家族在已确认的蛋白家族中展现出显著的功能多样性。这类蛋白以其保守的β-桶状结构以及两个独特的短特征序列基序为特征：(GX_{5} HXHX_{3}) (_{4} E)（或D）(X_{6} G) 和 (GX_{5} PXGX_{2} HX_{3} ~N)。这些基序包含与金属离子结合的氨基酸残基，两个基序之间存在15至50个氨基酸的序列间隔（Hu等人, 2023）。杯状蛋白的生物学功能通过多种金属离子与杯状蛋白活性位点的结合得以阐释，这些金属离子包括(Fe{2+})、(Mn{2+})、(Ni{2+})、(Cu{2+}) (Zn{2+})以及(Cd{2+})（Agarwal等人, 2009）。在古菌、真细菌和真核生物中，它们不仅具备双加氧酶、异构酶、草酸氧化酶等多种酶活性，还拥有生长素结合、蔗糖结合、种子储存、转录因子等非酶活性。尽管研究初期聚焦于杯状蛋白的生理活性，但当前研究表明该超家族可能与人类疾病存在潜在关联（T. Wang等人, 2023）。 Pirin是一种含杯状结构域的蛋白，在哺乳动物、植物、真菌和原核生物中高度保守。Pirin的晶体结构与杯状蛋白具有相似性，包含两个反向平行的类胚芽素β-桶状结构域、两个独特的杯状蛋白家族基序，N端结构域中有一个(Fe{2+})，C端区域则含有一个α-螺旋（Barman & Hamelberg, 2016）。Pirin近期被鉴定为转录共调节因子，可与转录因子NF-I和BCL-3相互作用，并与NF-κB p50形成复合物。Pirin作为铁依赖性的氧化应激调节因子发挥作用，在氧化条件下，其非活性状态(Fe{2+})与活性状态(Fe{3+})之间的结构转换会调节其构象以及与NF-κB p65的亲和力（F. Liu等人, 2013）。NF-κB是一种广泛存在的转录调节因子，被认为在免疫应答和炎症反应中发挥关键作用，然而Pirin的抗炎作用尚未得到深入研究。尽管含杯状结构域的多肽与炎症存在密切关联，但关于杯状结构域衍生多肽对人类先天免疫系统的抗炎作用研究仍较为匮乏。据我们所知，本研究首次报道了含杯状结构域的多肽具有抗炎活性。

图8. OGP1-1处理调节LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中MAPK和NF-κB通路。（A）免疫印迹和免疫染色分析TAK1和TLR4的表达、MAPK磷酸化和NF-κB进入细胞核的易位。（B）p-TAK1/TAK1蛋白的相对水平，（C）p-JNK/JNK蛋白的相对水平，（D）p-P38/P38蛋白的相对水平，（E）p-ERK/ERK蛋白的相对水平，（F）TLR4蛋白的相对水平，（G）p-P65/P65蛋白的相对水平，（H）p-IκBα/IκBα蛋白的相对水平和（I）NF-κB的免疫染色。（J）（I）NF-κB p65核易位的定量分析。（B）、（C）、（D）、（F）、（G), (), 和（J）中的数据表示为均值+SD（*P<0.01)vs.对照组；(# #P < 0.01)vs. LPS组，每组(n=3)）。

结论

综上所述，我们从牡蛎中发现了一种新的多肽OGP1-1。根据氨基酸序列的鉴定，OGP1-1与NCBI nr数据库中已知的含有杯蛋白结构域的多肽表现出中等的同一性，从而将其分类为一种新的杯蛋白样多肽。OGP1-1的物理化学性质和结构分析通过电泳、UV-vis吸收、FT-IR和CD光谱进行了揭示。OGP1-1通过有效下调关键炎症介质（包括NO、TNF-α和IL-1β）的产生，在体外和体内减轻炎症反应方面表现出显著的功效。值得注意的是，TAK1被鉴定为OGP1-1的直接分子靶标，通过先进的化学蛋白质组学和生物物理结合分析得到证实。通过分子对接和动力学模拟，在原子水平上进一步阐明了相互作用，证实了主要由疏水相互作用驱动的稳定结合模式激酶结构域内的氢键作用。后续的机制研究证实，OGP1-1通过特异性抑制TAK1介导的下游MAPK（JNK、p38、ERK）和NF-κB通路的激活，发挥其强效的抗炎作用，从而阻止NF-κB p65的核转位。综上，这些研究结果表明OGP1-1是一种具有显著免疫活性的多肽，并凸显了未充分利用的海产品作为高价值生物活性多肽来源的巨大潜力，这类多肽可应用于旨在控制慢性炎症的功能性食品中。

材料与方法

材料

长牡蛎（太平洋牡蛎）采自中国山东省青岛市。所用化学试剂均为分析纯级别。从长牡蛎中取下内脏团，称重后于-20℃保存备用。本实验所用斑马鱼为绿色荧光标记的转基因斑马鱼，即巨噬细胞Tg（Lyz：EGFP）。实验鱼按不同品系单独饲养，并按性别分养于专用斑马鱼养殖室，定期投喂卤虫和颗粒饲料。通过空调系统将环境温度控制在28±0.5℃。

用于RNA提取的商业试剂盒、BCA检测试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒、一氧化氮（NO）检测试剂盒以及酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自中国上海的碧云天生物技术有限公司。Trizol试剂和苯甲基磺酰氟（PMSF）由中国上海的阿拉丁试剂有限公司提供。美国伊利诺伊州芝加哥市的Proteintech公司提供了相关抗体，包括抗P38抗体、抗磷酸化P38抗体、抗JNK抗体、抗磷酸化JNK抗体JNK、抗ERK抗体、抗磷酸化ERK抗体、抗TLR-4抗体、抗NF-κB p65抗体、抗磷酸化NF-κB p65抗体、抗IκB抗体、抗磷酸化IκB抗体以及抗β-肌动蛋白抗体。抗COX-2和抗NOS2抗体购自美国马萨诸塞州丹弗斯市的Cell Signaling Technology公司。乙腈、三氟乙酸（TFA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖、考马斯亮蓝R-250、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）、二甲基亚砜（DMSO）、三卡因和苯硫脲均购自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。布洛芬购自中国食品药品检定研究院；FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒、AceQ qPCR SYBR Green预混液和含gDNA清除剂的HiScript II Q qPCR反转录超 mix试剂盒购自中国南京的Vazyme公司。一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒购自日本滋贺县的Takara公司。胰蛋白酶为质谱级，购自美国沃尔瑟姆市的Thermo Fisher公司。其他市售化学品和试剂均为分析纯级别。3-4月龄的Tg(Lyz:EGFP)成年斑马鱼购自中国武汉的国家斑马鱼资源中心。

牡蛎源多肽1-1的筛选与纯化

按照之前描述的方法（C. Li 等人，2019），通过一系列提取和纯化步骤从牡蛎中分离出 OGP1-1 样品。除非另有说明，所有操作均在 4 摄氏度下进行。从 10 千克长牡蛎可食用部分（鲜重）中提取出 1 千克牡蛎内脏团。将 1 千克牡蛎内脏团用去离子水冲洗，并用组织匀浆机捣碎 2 分钟。随后使用配备直探头的超声波处理器（中国宁波新芝公司），以连续脉冲模式在 30 毫摩尔/升磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中提取粗多肽。在 10000 倍重力加速度下离心 30 分钟后，用饱和度为 70%至100%的硫酸铵对上清液进行沉淀。再次在 10000 倍重力加速度下离心 30 分钟后，收集沉淀物并重新溶解于 30 毫摩尔/升 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，随后用去离子水透析并冻干。最终得到 101.40 克冻干多肽提取物。

将冻干物料（101.40克）上样至连接有TSKgel G2000SWXL色谱柱（东曹公司，7.8×300毫米，10微米，125埃）的安捷伦1200液相色谱系统中进行纯化。该色谱柱先用pH 8.0的50毫摩尔硫酸钠缓冲液预平衡，以0.5毫升/分钟的流速洗脱。检测波长设定为280纳米，色谱柱温度维持在25摄氏度。收集各馏分并进行透析、冻干处理。标记为P1至P4的馏分分别得到12.80克、4.60克、9.50克和36.50克产物。其中抗炎活性最强的P1馏分，再上样至连接安捷伦1200液相色谱系统的Ultimate LB-C8色谱柱（沃奇公司，5微米，4.6×200毫米）进行进一步纯化。洗脱溶剂体系由水-三氟乙酸（溶剂A；100:0.1，体积比）和乙腈-三氟乙酸（溶剂B；100:0.1，体积比）组成。采用含0.1%三氟乙酸的乙腈线性梯度洗脱，50分钟内从10%升至50%，流速为0.8毫升/分钟，最终收集并冻干得到多肽OGP1-1。最终从10.0克的P1馏分中获得625.00毫克的OGP1-1。

通过NO生成抑制活性实验检测各组分的抗炎功效。简要来说，首先将RAW264.7巨噬细胞以(1 ×10^{6})个/毫升的密度接种于96孔微孔板中，培养至汇合度达90%。设置三组实验，分别为未处理对照组、LPS处理组和样品组，分别用含1 μg/mL LPS的无血清培养基，以及含1 μg/mL LPS并联合20 μM各组分的无血清培养基处理。孵育18小时后，按照制造商的标准操作流程，使用Griess反应系统（中国上海Beyotime Biotechnology公司）在540 nm波长下通过分光光度法测定NO生成量。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

通过还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对OGP1-1进行了分析，其中浓缩胶采用10%丙烯酰胺浓度，分离胶采用15%丙烯酰胺浓度。分析前，将OGP1-1样品分别与非还原上样缓冲液、还原上样缓冲液按体积比1:3、1:4共同孵育。随后将混合物充分涡旋混匀，并在90摄氏度下加热10分钟。电泳时，将5微升每种制备好的蛋白质溶液与5微升分子量标准品一同上样至凝胶孔中。分离过程在75伏恒定电压下进行，持续2小时。最后通过考马斯亮蓝染色法对凝胶进行显色鉴定。

反相高效液相色谱法

为测定OGP1-1的纯度，采用配备ZORBAX®300SBC8色谱柱（4.6×150 mm，5 μm，美国加利福尼亚州安捷伦公司）的安捷伦1200高效液相色谱系统进行高效液相色谱（HPLC）检测。洗脱溶剂体系由水-三氟乙酸（流动相A；100:0.1，体积比）和乙腈-三氟乙酸（流动相B；100:0.1，体积比）组成。洗脱参数为：流动相A占64%、流动相B占36%，流速1毫升/分钟，检测波长280纳米，柱温25摄氏度。

蛋白质含量测定与碳水化合物浓度检测

采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品测定OGP1-1的蛋白质浓度。蛋白质浓度的测定通过在595纳米波长下进行分光光度法测量完成。使用定量的BSA标准品绘制校准曲线，以其对应的吸光度值（A595）进行拟合，得到线性回归方程。将纯化多肽溶液的实测吸光度代入该校准方程，计算出其浓度为0.1毫克/毫升。

采用改良的苯酚-硫酸比色法测定OGP1-1的总中性糖含量，以葡萄糖作为标准品。以490 nm处的吸光度测定样品中的碳水化合物含量。纯多肽的浓度为0.5 mg/mL，以不同浓度的葡萄糖标准溶液为横坐标，490 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程。利用纯化多肽的吸光度和回归方程计算其糖含量。

质谱法测定分子量

采用电喷雾电离质谱仪（ESI-MS）测定了OGP1-1的精确分子量。将多肽样品溶解于超纯水中后，将其通入与质谱仪相连的液相系统，在正离子模式下进行ESI-MS检测，质核比扫描范围为500–3000。样品的原始质谱数据通过ProMass进行去卷积处理，以确定其相对分子质量。

紫外-可见吸收光谱法

使用配备1.0厘米石英比色皿的UV-2450紫外-可见吸收分光光度计（日本岛津公司，大阪）进行紫外-可见吸收光谱测试，测试的波长范围为190至400纳米。

多肽 OGP1-1 的序列鉴定

将样品与 进行混合，以启动多肽的沉淀操作在−20摄氏度下置于预冷丙酮（5倍体积）中过夜。离心后，沉淀用冰浴的90%丙酮洗涤三次。将清洗后的沉淀物重悬于8摩尔/升尿素中，加入蛋白酶抑制剂，冰上孵育30分钟，离心澄清。上清液经超滤浓缩（8摩尔/升尿素）至50微升，再用裂解缓冲液稀释至90微升，依次用10毫摩尔/升三(2-羧乙基)膦（37摄氏度，1小时）和40毫摩尔/升碘乙酰胺（室温，避光40分钟）进行烷基化。多肽经丙酮再次沉淀、离心、风干后，重悬于100毫摩尔/升三乙胺碳酸氢盐缓冲液中。先进行胰蛋白酶消化（酶与底物比例1:50，37摄氏度，过夜），再经真空干燥处理。

将肽段上样至Eksigent 3C18-CL-1230色谱柱（微升液相色谱415系统）进行液相色谱-串联质谱分析，流动相设置为：A相（2%乙腈、0.1%甲酸）和B相（98%乙腈、0.1%甲酸）。采用80分钟梯度洗脱程序：0-1分钟，B相占比2%-6%；1-65分钟，B相占比6%-20%；65-70分钟，B相占比20%-25%；70-80分钟，B相占比25%-80%，流速为每分钟5微升。以信息依赖分析（IDA）模式进行一级质谱（MS1）扫描（质荷比350-1250，扫描时间0.25秒）和二级质谱（MS2）扫描（质荷比100-1500，扫描时间0.05秒，高灵敏度模式），每个循环优先选择前20个前体离子。针对长牡蛎转录组开放阅读框文库（使用PEAKS Studio 8软件）进行数据库检索，设置的参数包括：半胱氨酸氨基甲酰化固定修饰、甲硫氨酸氧化/N端乙酰化可变修饰、胰蛋白酶酶切、前体质量误差( ≤2 missed sites))、20 ppm、碎片离子质量误差0.1道尔顿，以及1%的错误发现率（FDR）阈值。

圆二色光谱法与傅里叶变换红外光谱法测定

分别在磷酸盐缓冲液（PBS）和蒸馏水中制备浓度为20微克/毫升的OGP1-1水溶液，通过0.02微米孔径的膜进行无菌过滤以去除颗粒杂质。光谱测量在配备有温控样品池的Jasco J-810旋光仪（日本东京JASCO公司）上进行，样品池温度维持在20摄氏度。测量使用0.1厘米光程的石英比色皿，在远紫外区（190-250纳米）采集光谱数据。仪器参数设置为：扫描速率每分钟50纳米，带宽2纳米，数据分辨率0.2纳米，灵敏度20毫度，积分时间0.5秒。每张记录的光谱均为八次连续扫描的平均信号，以提高信噪比。光谱数据经背景扣除处理以消除溶剂影响，并归一化至平均残基椭圆率（θ，(mdeg. cm{2} cdot dmol{-1} ）。利用Yang等人建立的参考数据集（Yang et al., 1986），通过厂商软件包（JASCO光谱管理器）中的去卷积算法，对α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等二级结构的组成比例进行定量分析。所有测量均进行三次重复实验。

先前溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）的OGP1-1经冷冻干燥后，与光谱级溴化钾（KBr）按1:100的质量比混合，在研钵中研磨成粉，压制成1毫米厚的薄片。采用傅里叶变换红外光谱仪（赛默飞世尔科技Nicolet Apex FT-IR光谱仪）以透射模式采集光谱，在(4000-400 ~cm{-1})波数范围内对32次扫描结果取平均值。

OGP1-1的三维结构预测

OGP1-1的三维结构通过基于同源性的计算方法，利用AlphaFold网络服务进行建模。提交OGP1-1的氨基酸序列以生成其三维结构构象。对得到的预测模型进行能量最小化和立体化学验证(pTM=0.9)，随后使用PyMOL系统进行结构可视化与分析（图S1）。

热稳定性与pH稳定性评估

本研究参照先前报道的方法（Yarnpakdee 等人，2015）并稍作调整，评估了 OGP1-1 在不同温度条件和 pH 值下的稳定性。热稳定性检测中，将浓度为 10 微摩尔的多肽溶液置于指定温度（25、65、75、85 和 100 摄氏度）的水浴中加热 30 分钟，随后检测加热样品对脂多糖（LPS）刺激的 RAW264.7 巨噬细胞一氧化氮（NO）生成的抑制作用。分析 pH 稳定性时，先将多肽溶液调节至目标 pH 值（3、5、7、9 和 11），在室温条件下保持 60 分钟，再将所有样品的 pH 值重新调至 7.0，按照上述方法检测样品抑制一氧化氮生成的能力。

实时定量聚合酶链式反应分析

RAW264.7巨噬细胞以1 (1 ×10^{6} mL)的密度接种，随机分为三个实验组：对照组在添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，LPS模型组用1 μg/mL LPS处理，处理组用1 μg/mL LPS和2.5、5或10 μM的OGP1-1共同处理。对于所有非对照组，细胞先用LPS预孵育30分钟，再加入OGP1-1，随后整个培养体系继续孵育24小时。使用Trizol试剂从多个细胞组中提取总RNA，用于后续分光光度法定量以评估基因表达。使用一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒（Perfect Real Time，日本Takara公司）进行cDNA合成和扩增，采用炎症标志物（IL-6、TNF-α、IL-(1 beta)、IL-10）和内参基因β-肌动蛋白的序列特异性引物（表S1）。RNA提取后，向样品中加入正向和反向引物，并用无RNase水将反应体系校准至50 μL。热循环条件包括：95 ℃初始变性30秒，随后40个循环，90 ℃变性5秒，同时60 ℃退火/延伸34秒。采用2^(-ΔΔCt)法对目标转录本进行相对定量，以β-肌动蛋白的表达作为内参进行标准化（J. Li et al., 2024）。补充表S3提供了详细的MIQE（定量实时PCR实验发表的最低信息要求）清单。

酶联免疫吸附实验

将处于对数生长期中期的RAW264.7巨噬细胞制备用于酶联免疫吸附试验（ELISA）。以(1 ×10^{6} / mL)的密度将细胞接种于6孔板中，每孔加入2mL等分试样。培养物在标准条件（37℃、5%CO₂）下维持至汇合。将细胞随机分为三个实验组：对照组（含10%胎牛血清的RPMI1640培养基）、LPS模型组（1μg/mL LPS）和处理组（1μg/mL LPS联合2.5、5或10μM浓度的OGP1-1）。所有非对照组在加入OGP1-1前均先用LPS预刺激30分钟，随后孵育24小时。按照制造商的操作流程，使用商用ELISA试剂盒检测上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

一氧化氮释放检测

RAW264.7巨噬细胞最初以每毫升1 (1 ×10{6})的密度接种于96孔微孔板中，培养至汇合度达90%。随后建立三个实验组：未处理组、LPS处理组和样本组，分别用无血清培养基、1 μg/mL LPS、1 μg/mL LPS联合2.5、5或10 μM的OGP1-1处理。经过18小时孵育后，检测一氧化氮的生成量采用 Griess 反应系统（中国上海碧云天生物技术公司），严格按照制造商规定的实验方案，在 540 纳米波长处进行分光光度法测定。

蛋白质印迹分析

在蛋白质印迹实验中，收集所有实验组的细胞样本并裂解以分离蛋白质。RAW264.7巨噬细胞先用OGP1-1预处理1小时，随后用1微克/毫升的脂多糖（LPS）刺激24小时，再进行收集。通过BCA实验对提取的蛋白质进行定量评估，随后在不连续体系中进行电泳，该体系包含12%的分离胶和5%的浓缩胶。之后，采用湿转印法将分离后的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。将膜片置于含10%脱脂奶粉的封闭缓冲液中，在室温下封闭2小时，随后与一抗（NF-κB p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、TLR-4、β-肌动蛋白）在4℃下孵育过夜。用三羟甲基氨基甲烷-吐温20缓冲液（TBST）洗涤三次后，与物种匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗在室温下孵育90分钟。一抗处理完成后，对膜片进行连续的TBST洗涤，并用数字方式捕获化学发光信号，得到灰度图像。在半定量分析中，通过光密度测定法将蛋白条带强度相对于β-肌动蛋白参照条带进行校正。

基于LC-MS/MS的靶点鉴定与下拉实验测定

采用包含1 mM抗坏血酸钠（NaVc）、100 mM THPTA、1 mM (CuSO_{4})以及50 μM 四甲基罗丹明-叠氮化物（TAMRA-azide）的点击化学反应混合物，将生物素标签与OGP1-1偶联，制得OGP1-1探针（OGP1-1-P）。将RAW 264.7细胞分为三种实验条件：对照组（用磷酸盐缓冲液（PBS）处理）、探针组（暴露于OGP1-1-P 1.5小时）和竞争组（先用OGP1-1预处理3小时，再用OGP1-1-P处理1.5小时）。随后，用含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）裂解细胞。将所有样品中的蛋白质在−20 ℃下用冰冷丙酮沉淀，重新溶解于0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中，并与50 μL链霉亲和素包被的磁珠孵育4小时。将磁珠依次用1%十二烷基硫酸钠（SDS）、6 M尿素和1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。

对于磁珠消化，捕获的蛋白先用二硫苏糖醇（DTT）还原，再用碘乙酰胺（IAA）进行烷基化处理，随后在37摄氏度下用胰蛋白酶消化过夜。得到的肽段通过商用C18色谱柱脱盐，经二甲基化进行化学标记，最后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。

进行下拉实验时，经PBS洗涤后，将磁珠与40微升1×上样缓冲液混合，并在95摄氏度下加热5分钟以使结合的蛋白质变性。

基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

通过对比对照组（PBS处理）、探针组（OGP1-1-P处理）和竞争组（OGP1-1 + OGP1-1-P处理）的丰度谱，鉴定出差异表达蛋白。筛选标准包括绝对倍数变化( probe/compete )>2)与FDR校正的(p-value <0.05，以及绝对倍数变化( probe/control) >5)与(FDR <0.05)（Yu等人，2012）。随后，所得蛋白集通过(DAVID {+})平台进行韦恩图分析和基因本体（GO）富集分析（Smedley等人，2009）。

细胞热位移实验（CETSA）

按照之前报道的方法开展了CETSA实验（Hengst等人，2020）。简要来说，将RAW 264.7细胞裂解物与或不与OGP1-1共同孵育3小时。随后将细胞悬液分为八份将PCR管置于PCR分析仪中，于37摄氏度至72摄氏度的温度下加热5分钟。随后通过蛋白质印迹法对裂解液进行分析。

生物分子相互作用分析

带有N端六聚组氨酸标签的重组人TAK1蛋白纯度超过90%。按照Monolith NT蛋白标记试剂盒RED-NHS（德国慕尼黑Nano Temper公司）的说明，用NT-647-NHS荧光染料对目标蛋白进行标记。OGP1-1储备液配制于0.05%吐温80/磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，随后根据Monolith NT.115微量热泳动系统的指南在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释。实验开始前，将标记后的TAK1加入稀释后的OGP1-1溶液中。将样品上样至Monolith NT.115毛细管中，使用微量热泳动设备（德国Nano Temper公司）进行检测。后续的信号捕获和解离常数计算均通过MO. Affinity Analysis软件完成。

分子对接

AutoDock Vina 凭借其计算效率和可靠的预测性能，被广泛应用于配体-受体相互作用的分子对接研究中。在现有方法中，半柔性对接尤其适用于生物分子识别过程的建模（Zhu 等人，2022）。基于此，本研究利用 AutoDock 4.2（美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所）开展了 OGP1-1 与 TAK1 之间的半柔性对接模拟。TAK1 嵌合体的晶体结构从 RCSB 蛋白质数据库中获取（登录号：5V5N），OGP1-1 的三维模型则如前文所述通过 AlphaFold 3 构建。研究采用 AutoDock Tools 1.5.6 对初始结构进行预处理，包括去除非极性水分子、添加极性氢原子，并保留 TAK1 与 OGP1-1 本身的原子电荷，随后以 .pdbqt 格式导出。对接网格以原始配体的结合位点为中心（坐标：(x=12.05) (y=) -3.86、(z=16.25)），尺寸为 (60 ×60 ×60 AA^{3})，网格点间距为 (0.60 元)。采用拉马克遗传算法，在默认参数配置下进行了 100 次独立迭代的对接模拟。为验证对接方案的可靠性，本研究使用已知的 TAK1 抑制剂他尼布（totzke 等人，2017）进行了重对接实验。TAK1 的晶体结构（PDB：5V5N）未结合小分子配体，因此将他尼布以相同的网格参数对接至同一结合口袋。得到的对接构象与已报道的结合模式的均方根偏差（RMSD）为 (1.2 AA)，证实了对接参数适用于预测配体与 TAK1 的相互作用。选取结合能最优的复合物构象，用于后续在 PyMOL 中进行结构可视化。利用 LigPlot+ 进一步分析预测的结合模式中的分子间相互作用。

分子动力学（MD）模拟与轨迹分析

使用Gromacs 2022.3软件（Van Der Spoel等人，2005年）在100纳秒的时间范围内对选定的TAK1-多肽复合物进行了分子动力学（MD）模拟。多肽的预处理过程包括通过AmberTools22分配GAFF力场。利用Gaussian 16 W完成了加氢和RESP电荷计算，并将得到的势能参数整合到系统拓扑结构中。模拟在300开尔文的恒定温度和1巴的恒定压力下运行，采用Amber99sb-ildn力场，溶剂为TIP3P水模型。通过添加(Na^{+})离子实现了系统的电中性。使用最速下降算法进行能量最小化，随后进行在等温等容系综（NVT）和等温等压系综（NPT）中分别进行平衡化处理，时长均为100皮秒，耦合常数为0.1皮秒。随后执行100纳秒的生产分子动力学模拟，以2飞秒的积分步长运行500万次迭代。利用Gromacs内置工具进行轨迹分析，计算每个氨基酸轨迹的均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回旋半径（Rg）值以及溶剂可及表面积（SASA）。将这些指标与MMGBSA结合自由能估算及自由能景观分析结果进行整合。

免疫荧光测定

代表每个实验组的培养细胞爬片经磷酸盐缓冲液（PBS）连续洗涤三次。随后使用4%多聚甲醛固定，孵育15分钟，再用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次。通过过氧化氢处理抑制内源性过氧化物酶活性，随后进行血清封闭。针对核因子κB p65（NF-κB p65）的一抗在37℃下孵育1小时，之后用磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤。荧光标记的二抗在避光环境下滴加使用。经三次磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色完成细胞核可视化，再添加抗光漂白封片剂（李阳、徐等，2024）。最终通过激光共聚焦显微镜成像明确了核因子κB p65（NF-κB p65）的定位模式。

OGP1-1在斑马鱼炎症模型中的抗炎作用

斑马鱼饲养于受控水生设施中，不同品系和性别的斑马鱼分开饲养。每日投喂活体丰年虫和商业颗粒饲料，以满足其营养需求。环境条件由自动温控系统维持在28.0±0.5摄氏度的水温，以及14小时光照、10小时黑暗的光周期。繁殖时，性成熟的雄性和雌性斑马鱼以1:1或1:2的比例转移至产卵池，并进行隔离以防止过早接触。受精后1小时收集受精卵，用无菌斑马鱼培养基冲洗后，置于28摄氏度光照下培养。受精后6小时（hpf）添加苯硫脲以抑制黑色素生成，保持机体光学透明性，便于后续成像。所有动物实验均遵循欧盟《用于科学目的的动物保护指令2010/63/EU》和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》开展。实验方案经山东大学齐鲁医院实验动物伦理委员会批准（KYLL-2025 (ZM)-634）。

通过体视显微镜鉴定出在72小时受精后（hpf）表现出巨噬细胞特异性Lyz：EGFP荧光的转基因斑马鱼胚胎。将10条幼鱼分配到24孔板的每孔中进行处理。实验组包括：（1）未处理对照组（新鲜培养基），（2）阳性对照组（20微摩尔布洛芬），以及（3）试验组（2.5、5或10微摩尔样品）。经过6小时预处理后，除对照组外的所有组均在黑暗中暴露于20微摩尔的(CuSO_{4}) 1小时。暴露结束后，幼鱼用培养基洗涤三次，随后用0.25%的三卡因麻醉以进行荧光成像。使用Image-Pro Plus软件对尾部区域的巨噬细胞数量进行定量分析。

对于qPCR分析，将幼体斑马鱼（n=50 per)组）收集至1.5 mL离心管中，用蒸馏水冲洗三次，于液氮中快速冷冻，并在−80 ℃下保存48小时。使用Trizol试剂提取总RNA，随后通过一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒进行cDNA合成。定量PCR扩增采用以下热循环参数：95 ℃初始变性5分钟，随后进行40个循环的变性95摄氏度下保持10秒，同时在55摄氏度下进行退火/延伸30秒。每个循环后自动捕获荧光信号。采用2-ΔΔCt法对目标转录本进行相对定量分析，以β-肌动蛋白作为内参对照。

统计学分析

实验数据以平均值±标准差（体外实验）或平均值±标准误（体内实验）表示。采用Graphpad prism 9.5（美国圣地亚哥GraphPad Software公司）进行统计学分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），其中(P<0.05)具有统计学意义。