题目：Unprocessed U1 snRNAs as a biomarker of INTS11- and BRAT1-related neurodevelopmental disorders

原文链接：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-026-01667-1

期刊:Genome Medicine

摘要

RNA加工过程的异常越来越被认为是严重神经发育障碍的关键致病因素。整合子催化亚基INTS11及其结合蛋白BRAT1的变异会导致临床表型重叠，而目前对INTS11的分子功能研究得相对较为充分其特征已被阐明。相比之下，BRAT1 对 RNA 代谢和疾病的机制性作用仍不明确，这在变异解读和诊断分类方面留下了重大空白。

我们采用了整合的遗传学、分子生物学和体内研究方法，探究INTS11和BRAT1突变对U小核RNA（U snRNA）加工的影响。通过蛋白质印迹、逆转录定量聚合酶链式反应和荧光原位杂交技术分析患者来源的成纤维细胞和淋巴母细胞，以评估U1 snRNA的3'端加工过程和核滞留情况。为验证整合子复合物缺乏在体内产生的功能影响，我们构建并鉴定了ints11基因敲除斑马鱼模型。

我们在具有重叠神经发育特征的个体中发现了 INTS11 和 BRAT1 基因的新型双等位基因变异体。尽管 INTS11 基因缺陷会导致小核RNA（snRNA）加工异常，但本研究首次直接证实，多个 INTS11 基因突变的患者细胞中 U1 小核RNA（U1 snRNA）的加工过程均受损。关键的是，我们发现 BRAT1 基因突变也会损害 U1 小核RNA的 3' 端加工，导致未加工的转录本在细胞核中积累。这些发现为 BRAT1 在RNA加工过程中的作用提供了直接证据，并明确整合子功能障碍是 BRAT1 相关神经系统疾病的主要致病机制。在 BRAT1 相关患者队列中，U1 小核RNA加工异常的程度与临床严重程度密切相关，这凸显了其作为诊断生物标志物的潜力。一致地，ints11基因敲除斑马鱼模型重现了患者的核心特征——包括小头畸形、神经发育缺陷以及U snRNA加工缺陷，这进一步证实了整合子复合体缺陷在体内的致病作用。

我们的研究结果将BRAT1相关神经系统疾病重新定义为由RNA加工缺陷驱动的整合子相关疾病。未加工的U1小核RNA的核积累可作为变异解读、疾病严重程度评估和患者分层的可靠生物标志物，在BRAT1相关病例中尤其具有应用价值。这些发现拓宽了整合子功能异常的临床和分子谱，为改进诊断与转化研究方法奠定了基础。

关键词：INTS11、BRAT1、U 小核 RNA、神经系统疾病

研究背景

整合子复合物亚基11（INTS11）编码RNA聚合酶II（RNAPII）相关整合子复合物的核酸内切酶催化亚基，该复合物是RNA加工和转录的多功能调节因子。整合子复合物最初被描述为一个由12个亚基组成的、仅存在于后生动物中的复合物，负责U小核RNA（U snRNAs）的3'端加工，后来被证实至少包含15个亚基（INTS1-15）。其催化核心即切割模块由核酸内切酶INTS11构成，假酶INTS9以及支架蛋白INTS4。除了U snRNA的加工过程外，INTS11还参与了多种RNA分子的切割，包括增强子RNA（eRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）、PIWI相互作用RNA（piRNAs）以及端粒酶相关RNA。此外，整合子复合物已被证实是转录过程的关键调控因子，尤其是通过控制RNA聚合酶II（RNAPII）在启动子近端的暂停来发挥作用，这一功能对胚胎发生和细胞分化至关重要。

整合子亚基的突变正逐渐被认为是人类遗传性疾病的致病原因。INTS1和INTS8的致病变异与常染色体隐性神经发育综合征相关，这类综合征以发育迟缓、认知和运动障碍以及畸形特征为特点；而INTS13突变与常染色体隐性纤毛病变相关，INTS15突变则与表现形式多样的常染色体显性眼部疾病相关。近期，研究人员在表现出智力障碍、小头畸形、运动障碍和小脑萎缩的患者中发现了双等位基因INTS11突变，而INTS6突变与语言和运动发育迟缓、自闭症、智力障碍以及睡眠障碍相关。

有趣的是，INTS11 的直接结合蛋白 BRAT1（BRCA1 相关的 ATM 激活因子 1）在多种神经系统疾病中也发生突变，包括非进行性小脑共济失调（NPCA）、BRAT1 相关僵硬症和多灶性癫痫综合征（RMFSL），以及伴有或不伴有小脑萎缩的 BRAT1 相关神经发育障碍癫痫综合征（NEDCAS）。尽管二者之间的临床关联已得到充分证实，但与BRAT1相关的疾病异质性背后的分子机制以及BRAT1的生理功能仍知之甚少。

考虑到BRAT1相关疾病与INTS11相关疾病存在临床重叠，且有证据支持BRAT1在整合子复合物完整性中发挥作用，我们推测二者存在共同的分子病因。具体而言，我们旨在确定INTS11和BRAT1突变相关疾病是否在RNA加工过程中存在共同缺陷。为解决这一问题，我们计划拓展INTS11和BRAT1的突变谱，并系统评估这些变异体的功能影响，重点关注U小核RNA（U snRNA）的加工过程，尤其是U1小核RNA（U1 snRNA）。此外，我们着手构建INTS11缺陷的体内斑马鱼模型，以探究整合子功能异常带来的分子和神经发育后果。最后，我们探讨了未加工的U1 snRNA作为疾病分类和患者分层生物标志物的潜力。总体而言，本研究旨在明确U1 snRNA加工缺陷是否是BRAT1相关疾病和INTS11相关疾病的共同分子特征，并为诊断和转化应用提供研究框架。

结果

双等位基因INTS11突变患者的特征分析

此前有研究报道，12个无亲缘关系家庭中的18名患者携带双等位基因INTS11变异，这些变异与神经发育障碍相关[2022]。本研究通过鉴定5种新的纯合或复合杂合变异，并对10个无亲缘关系家庭（F1-F10；图1A、B；补充文件1：图S1A、B）中的13名受累个体（7名男性，6名女性）进行特征分析，拓展了INTS11变异相关疾病的表型谱。其中3例此前已有报道，本文补充了其长期随访数据，2例为已发表病例，其余8例为新发现的病例。最后一次评估时的年龄范围为6个月至20岁。研究队列中38%（5/13）的患者存在父母近亲婚配情况。数据收集时，77%（10/13）的个体仍存活。INTS11相关疾病始终与全面发育迟缓（GDD）、智力障碍（ID）、小头畸形以及脑部影像学异常相关。共济失调和痉挛则为可变出现的特征。本研究基于发育迟缓的发生情况与程度、智力水平、死亡率以及神经系统症状的严重程度，将临床严重程度划分为中度、重度和极重度表型组。

图1 本研究中检测的INTS11结构及变异体。（A）本研究分析的INTS11基因突变示意图，覆盖整个基因。这些变异包括两个导致提前终止密码子的移码突变、十个错义突变和四个影响剪接的突变。复合杂合子患者中存在的变异已按相应颜色标记。（B）本研究分析的INTS11基因突变患者汇总。该汇总包含每个变异的cDNA和蛋白水平注释，以及其纯合或复合杂合状态。每位患者的临床严重程度（分为中度、重度或极重度）也已标注。新的致病性BRAT1变异体以红色标出。我们提出新的BRAT1 E605A突变不具有致病性，患者的表型应归因于CASK基因的独立突变。

中度表型（n=3；最后一次随访时平均年龄16.3岁，范围：10-20岁）

该组患者在婴儿期发病，均表现为中度全面发育迟缓/智力障碍。患者需借助支撑才能行走，首次独立行走的平均年龄为3.5岁（范围：2-5岁），且所有人都能说少量词汇。小头畸形所有病例均存在共济失调。1例患者出现痉挛。1例患者有癫痫发作，发病于青春期，表现为全身性强直-阵挛性发作，且对治疗有反应。神经影像学检查显示所有病例均存在小脑萎缩，其他发现包括脑桥小脑萎缩（1/3例）和弥漫性白质病变（1/3例）。

重度表型（n=4；最后一次随访时平均年龄4.8岁——范围：1-8岁）

半数病例（2/4）的症状出现在新生儿期，另外半数（2/4）出现在婴儿期。所有患者均表现出严重的全面发育迟缓/智力障碍。2名患者在辅助下实现行走（分别在2.5岁和5岁时），1名患者能说少量词语。4名患者中3名存在小头畸形，2名存在共济失调，1名存在痉挛，1名患者出现癫痫发作（1/4）。神经影像学检查显示，所有患者均存在小脑萎缩（4/4），2名存在胼胝体变薄，1名存在脑室周围营养不良伴髓鞘形成延迟。重度表型（n=6)；最后一次随访时平均年龄4.9岁，范围：0.5-18岁）

所有受影响严重的个体均在胎儿期或新生儿期出现症状。他们存在严重的全面发育迟缓/智力障碍，完全无法行走或言语。其中一半个体（3/6）在数据收集时已去世。所有个体（6/6）均出现小头畸形，该亚组中痉挛症状更为常见（3/6）。所有个体均有癫痫发作史，通常起病早且对治疗反应不佳。神经影像学检查显示，大多数病例（4/5）存在大脑和小脑萎缩，以及脑桥小脑萎缩（2/5）、脑回简化（2/6）、白质脑病与严重髓鞘形成不良（2/6）以及胼胝体变薄（1/6）。

BRAT1突变患者的特征及其与INTS11相关疾病的重叠性

我们之前的研究已证实INTS11与BRAT1（BRCA1相关的ATM激活因子1）之间存在物理相互作用，BRAT1是一种与多种神经系统疾病相关的蛋白质，疾病谱从轻度神经退行性病变到重度神经发育综合征不等。为进一步探究这两个基因与疾病之间的功能关联，我们系统分析了双等位基因BRAT1突变患者的临床表型（包括四种新的变异类型），并将其与携带致病性INTS11变异的个体进行对比。我们评估了来自9个无亲缘关系家庭（F11-19）的12名个体（7名男性，5名女性），其中包括7例既往报道病例和5例新描述病例（图2A、B；补充文件1：图S2A、B）。最后一次临床评估时的年龄为5个月至24岁，数据收集时92%（11/12）的个体仍存活。9个家庭中有44%（4/9）存在父母血缘关系。BRAT1相关疾病的核心表型包括早发性全面发育迟缓（GDD）、智力障碍（ID）以及脑部磁共振成像（MRI）异常，共济失调、痉挛、癫痫发作和小头畸形的表现则存在个体差异。为进一步明确该表型，我们根据死亡率、发育迟缓的存在与否及程度、智力水平以及神经系统症状的严重程度，将受累个体分为轻度、中度、重度和极重度四组。

图2 本研究中检测的BRAT1结构及变异体。（A）本研究分析的BRAT1突变的示意图，覆盖整个基因。这些变异包括两个导致提前终止密码子的移码突变、七个错义突变，以及一个引入提前终止密码子的错义变异。复合杂合子个体中存在的变异已按相应颜色标注。（B）本研究分析的BRAT1突变患者概况。突变在cDNA和蛋白质水平均有注释，同时标注了其纯合状态或复合杂合状态。同时提供了每例病例从轻微到严重不等的临床严重程度。

轻度表型（n=7；最后一次随访时平均年龄7.5岁，范围：3-24岁）

所有评估病例的症状均在婴儿期出现。所有受试者均实现行走，首次行走的平均年龄为1.9岁（范围：1.3-2.3岁），尽管大多数需要辅助。所有受试者均存在语言发育迟缓，并表现出轻度智力障碍。所有病例均出现共济失调，其中1例（1/7）报告有痉挛。轻度受累者均未出现癫痫或小头畸形。神经影像学检查显示，所有受试者均存在小脑萎缩，2/7的受试者存在胼胝体萎缩。

中度表型（n=2；末次随访时平均年龄5岁）

症状出现在产前或婴儿期。两名患者均能行走，其中1/2需要辅助。语言发育仅能说出少量词汇，两人均表现为中度智力障碍。一名患者（F15-P1）出现痉挛和癫痫症状，另一名患者（F16-P1）表现为共济失调。无小头畸形表现。神经影像学检查显示两名患者均存在小脑萎缩。

重度表型 (n=1)

F17-P1号个体表现出严重表型，症状于出生后第一年出现。她无法行走，语言能力仅能说出两个单词，且存在严重智力障碍。她在2个月大时开始出现早发性癫痫。临床检查显示小头畸形、肌张力低下及共济失调。神经影像学检查显示大脑和小脑萎缩。小脑白质改变、胼胝体发育不全及脑回形态简化。

重度表型（n=2)，最后一次随访时平均年龄1.5岁） 该亚组在出生后第一个月内即出现症状。所有受试者均表现为重度全面发育迟缓、小头畸形，且癫痫通常在出生后第一年内发作；1例对治疗无反应。1名受试者（F18-P1）出现肢体痉挛伴轴性肌张力低下，两例均无共济失调。神经影像学检查显示，1名受试者存在大脑萎缩，另1名则为小脑萎缩。1名受试者（F18-P1）因癫痫相关并发症在14个月时死亡。

INTS11变异对患者来源细胞中蛋白质水平及整合子功能的影响

INTS11 变异体覆盖了整个编码区（NM_017871.6），包括两个移码突变、十个错义突变以及四个预测的剪接破坏突变（图1A；补充文件1：图S1B）。为了研究其影响，我们从患者的皮肤活检组织或血液样本，以及携带单个 INTS11 突变的未受影响的杂合父母体内建立了细胞培养体系。我们从九名不同患者中获取了原代成纤维细胞：三名纯合子（标记为 R17LHOM、c.28+1406C>THOM 和 P438LHOM）和六名复合杂合子（标记为 G12S/P407S、H36Y/c.1295-9G>A、F39S/R521Qfs*44、(A109P/c.1464+3G>C) R217W/Y578C 以及 (c. 1041+3 G>C / c .1464+3 G>C）。我们从四名未受影响的父母（标记为 (c. 28+1406 C> THET)、A109PHET、P438LHET）采集了样本(c. 1464+3 G>C^{H E T} ）以及一名无关的健康个体（标记为1BR对照）。此外，从一名复合杂合子患者（标记为R219Q/A313Cfs*2）、该患者未受影响的父母（标记为R219Q杂合子和(A313Cfs*2 ^{HET }）以及一名无关对照者（标记为LCL对照）中建立了淋巴母细胞样细胞系（LCLs）。

为评估这些突变对 INTS11 蛋白丰度的影响，我们首先比较了患者、未受影响的父母以及一名健康对照者的蛋白水平。我们发现，仅在四名携带复合杂合突变 F39S/R521Qfs*44、(A109P/c.1464+3G>C)、R219Q/A313Cfs*2 以及 c.1041+3G>C/c.1464+3G>C 的患者来源的细胞系中，INTS11 蛋白水平显著降低（图 3A、B）。这表明这些突变直接损害了全长 INTS11 蛋白的形成或稳定性。此外，与 INTS11 相互作用形成核心催化切割模块的另外两个整合子亚基 INTS9 和 INTS4，在其中三名患者中也显著减少（图 3A、B），提示复合物稳定性受损。

图3 INTS11突变患者来源细胞中整合素亚基蛋白水平的分析。(A) 对来自健康对照、未受影响的父母或 INTS11 突变患者的成纤维细胞和淋巴母细胞样细胞系（LCLs）中 INTS11、INTS9 和 INTS4 蛋白水平进行的免疫印迹分析。β-肌动蛋白或 α-微管蛋白用作上样对照。非特异性条带用星号（*）标注。(B) 基于至少三次独立实验，对(A)中的蛋白水平进行定量分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示。采用双尾 Student t 检验确定统计学显著性（ns – 无显著性，*p<0.05 **p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001）。

接下来，为了评估内含子突变对剪接效率的影响，我们按照补充文件1：图S3A所示，从三名相关患者、未受影响的父母以及对照细胞的分离cDNA中扩增INTS11转录本。具体而言，内含子10和14中的(c. 1041+3 G>C / c .1464+3 G>C)突变体促进了这些内含子在成熟mRNA中的滞留，或同时导致两种内含子滞留（补充文件1：图S3B）。位于第一个内含子中的(c. 28+1406 C>T)突变体促进了可变外显子的使用，产生了一种独特的转录本变异体（附加文件1：图S3C、E）。该可变转录本在未受影响的(C. 28+1406 C> THET)亲本中被检测到，但在(c. 28+1406 C>T{H O M})患者中含量高得多，且在仅存在经典同工型的无关1BR对照中未检测到。经典转录本（ENST00000435064.6）编码由600个氨基酸组成的蛋白质，而可变剪接转录本（ENST00000545578.5）在外显子3中使用了替代起始密码子，产生了571个氨基酸的较短蛋白质（附加文件1：图S3A）。我们推测该较短蛋白质可能无功能，因为它缺少前29个氨基酸，其中包括金属β-内酰胺酶结构域的一部分（图1A）。此外，内含子12中的(c. 1295-9 G>A)变异体促进了剪接改变，导致移码突变（附加文件1：图S3D）。经典剪接转录本仍可被检测到，这可能对应于携带H36Y错义突变的等位基因的剪接，以及(c. 1295-9 G>A)变异体的不完全外显。综上，这些发现表明，尽管部分变异体直接降低INTS11蛋白水平，但错义突变或剪接改变可能会损害蛋白质功能或相互作用，进而可能改变整合素裂解复合物的活性。

为评估不同双等位基因 INTS11 突变的功能影响，我们采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分析了不同患者来源细胞系中未加工 U 小核 RNA 的积累情况。靶向由人类 RNU1-1 和 RNU2-1 基因编码的未加工 U1 和 U2 小核 RNA 的引物（图 4A；补充文件1：图 S4A），此前已在敲低 INTS11 的细胞中得到验证，结果显示出显著的在所有患者样本中，即使是那些 INTS11 蛋白水平未发生变化的样本，未加工的长链 U 小核 RNA 形式均有所增加，尤其是 U1 小核 RNA（图 4B；补充文件 1：图 S4B）。在携带复杂去稳定化突变 (A109P/c.1464+3G>C)、(R219Q/A313Cfs*2) 和 (c. 1041+3 G>C / c .1464+3 G>C ) 且具有严重临床表型的患者中，观察到了最显著的缺陷。这些发现强调了整合子（Integrator）在小核 RNA 3'端高效加工中的关键作用，并表明未加工的 U 小核 RNA（尤其是 U1）可作为致病性 INTS11 变异体的灵敏检测指标。

图4 INTS11突变患者来源细胞中U1 snRNA的3'端加工受损。(A) 用于检测从 RNU1-1 基因转录的未加工 U1 snRNA 的 RT-qPCR 方法示意图。该图标注了 RT-qPCR 引物位置（箭头）、典型的整合素介导的切割位点（剪刀符号）以及下游 3' 框。(B) 对对照组、亲本组和 INTS11 突变患者来源的成纤维细胞（左侧）及淋巴母细胞样细胞系（右侧）中未加工的 RNU1-1 转录本进行 RT-qPCR 分析。数据以三次独立实验的平均值±标准误表示(N=3)。统计显著性通过双尾学生t检验确定（ns – 无显著性，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001）。

Ints11缺陷型斑马鱼的U snRNA加工过程受损，且重现人类神经发育缺陷

由于与INTS11相关的疾病是最近才被发现的，我们建立了斑马鱼敲除模型（ints11-KO），以在体内研究INTS11缺乏所导致的功能后果，重点关注大脑。斑马鱼拥有人类INTS11的单一同源物（ints11，ENSDARG00000025212），其编码的蛋白质与人类INTS11的序列一致性达84%，且保留了所有功能注释结构域（图5A）。我们利用CRISPR/Cas9诱变技术，靶向编码这些保守结构域的三个外显子（外显子4、9和13），构建了F0代CRISPR突变体。以注射相同诱变工具但含5个错配对照向导RNA的胚胎作为对照（见方法）。通过高分辨率熔解基因分型技术，证实了ints11和错配对照向导RNA的诱变效率（补充资料1：图S5A）。为评估ints11缺失水平对U snRNA加工的功能影响，我们对使用靶向斑马鱼snRNAs 3'未加工区域的引物（U1_4、U2、U2_1、U2_2、U5、U6_1、U6_2、U6_3、U6_4和U12），通过RT-qPCR检测了ints11-KO幼虫中未加工的U snRNAs。分析显示，与错配对照组相比，5日龄ints11-KO幼虫中未加工的U1、U2、U5和U12 snRNA显著积累（图5B；补充文件1：图S5B）。相比之下，斑马鱼ints11-KO CRISPant中的U6 snRNA加工基本未受影响（补充文件1：图S5B），这与Integrator复合物在RNA聚合酶II依赖性snRNA转录中的既定作用一致。这些结果证实了ints11破坏的功能后果，并与果蝇、秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞中的先前发现相符，证明INTS11的缺失会选择性地损害主要和次要剪接体snRNA的加工。

图5 缺失 ints11 的斑马鱼表现出未加工的U型小核RNA增多、运动行为异常以及脑部尺寸减小。(A) 人类与斑马鱼中保守的 INTS11 三个主要功能结构域（金属β-内酰胺酶结构域、β-CASP 结构域和 C 端结构域）的示意图。(B) 受精后5天（dpf）幼虫中3'未加工小核RNA（U1_4、U2、U2_1、U2_2、U5）的RT-qPCR分析。数据显示相对于对照组的倍数变化（ΔΔCt法）。U1_4和U5的P值来自MannWhitney检验；U2、U2_1和U2_2的P值来自双尾Student t检验：** p<0.01 . ***p<0.001 ****p<0.0001 (n>35) , (N=3) 。(C) 受精后14天内的Kaplan-Meier生存分析，比较i (n) (=26 )与对照组 (n=19) (D) 采用自动记录腔追踪系统，对每只幼虫1小时内的总移动距离（毫米）进行定量分析。与对照组相比，ints11- (KO) 幼虫在黑暗环境中的总游动距离显著增加 **p<0.01，但在光照环境中总游动距离降低 ****p<0.0001。P值来自Mann-Whitney检验；样本量：对照组(n=93) , ints11KO (n=77)(E) 对照组和ints11-KO幼虫在受精后5天的明场侧面和背侧代表性图像。比例尺：0.5毫米。(F) 对照组( (n=20) 和ints11-KO (n=16) 幼虫的体型、头长和眼径定量分析。P值来自双尾Student t检验：****p<0.0001；ns - 无显著性差异。(G) Tg(elavl3: GFP)转基因品系受精后5天幼虫大脑的背侧代表性图像，以及大脑大小的定量分析结果显示ints11-KO 幼虫的数量显著减少。Mann-Whitney 检验的 P 值：**p<0.01；样本量：对照组 (n=18)，ints11-KO 组 ((n=13) 。(H) 5 天龄（dpf）Tg(elavl3:GFP) 幼虫的 20 倍共聚焦成像显示，与对照组相比，ints11-KO 幼虫的神经元含量显著减少。双尾 Student 氏 t 检验的 P 值：****p<0.0001；样本量：对照组 (n=12)，ints11-KO 组 ((n=8) 。I) 5 天龄（dpf）幼虫的 20 倍共聚焦图像，经抗小白蛋白-7（PAV7）免疫标记，显示与对照组相比，ints11-KO 幼虫的小脑体积显著减小。双尾 Student 氏 t 检验的 P 值：** p<0.01 ；样本量：对照组 (n= 33)，ints11-KO 组 (n=34) 。

值得注意的是，ints11基因敲除（ints11-KO）的斑马鱼幼鱼出现了过早死亡的现象，无法存活至受精后14天（dpf）以上（图5C）。在死亡前，受影响的幼鱼表现出明显的行为异常。具体而言，在受精后5天（5 dpf）通过明暗周期实验检测时，ints11-KO幼鱼表现出持续的黑暗期活动亢进以及普遍的光照期活动减退（图5D；补充文件1：图S5C）。这些行为变化与其他神经发育障碍斑马鱼模型中观察到的现象相似[45-47]。值得注意的是，活动减退表型的严重程度与靶向ints11的向导RNA（gRNAs）的诱变评分相关，证实了该表型的特异性（补充文件1：图S5D）。尽管在受精后5天（5 dpf）时未出现明显的形态学异常，但ints11-KO幼鱼的眼径，提示其可能对中枢神经系统产生影响（图5E、F）。为进一步研究神经发育缺陷，我们利用Tg[elavl3:GFP]转基因品系评估了ints11-KO幼虫的脑体积，该品系在有丝分裂后神经元中表达绿色荧光蛋白（GFP）[48]。我们观察到，与对照组相比，幼虫脑体积显著减小（图5G），中脑变化最为明显，而作为大脑最大结构的视顶盖中神经元数量也显著减少（图5H；补充文件1：图S5E）。后脑总体体积未受影响，但小脑的完整性遭到破坏。使用抗小白蛋白-7（PAV7）抗体对浦肯野细胞进行免疫染色后发现，通过PAV7阳性染色评估的小脑体积显著减小（图5I）。

这些研究结果共同证实，INTS11 基因敲除斑马鱼是研究 INTS11 缺乏症的强大体内模型。其一系列表型，包括 U 小核RNA加工受损、行为异常、大脑和小脑体积减小以及早期致死，与 INTS11 基因突变患者所观察到的临床表现高度相似。这些数据进一步凸显了 INTS11 在脊椎动物大脑发育和功能中所起的关键且保守的作用。

BRAT1 突变会使 INTS11 不稳定并破坏整合子切割复合体

为了检测BRAT1突变是否会损害INTS11的稳定性及整合子复合物的功能，我们从6名携带纯合双等位BRAT1突变的个体中建立了原代成纤维细胞（分别记为V62EHOM、L391RHOM）。(R 651 H^{HOM}(I))、R651HHOM(II)、(F709TFs*17 HOM) 和 V715EHOM），以及两名携带复合杂合突变（记为 E605A/F709Tfs*17 和 R644*/M775K）的个体样本。我们还纳入了四名携带单一BRAT1突变的未受影响父母的成纤维细胞（记为 V62EHET(I)、L391RHET、R651HHET 和 V715EHET），并以1BR细胞作为对照。此外，我们使用了两名携带纯合BRAT1突变的患病兄弟姐妹的淋巴母细胞系（LCLs）（记为 (V62E E^{HOM}(I)) 和 V62EHOM(II)）、一名携带复合杂合突变的患者（记为 L99Tfs*92/A164V）及其未受影响的父母（记为 V62EHET(I)、V62EHET(I)、(L99Tfs*92HET) 和 A164VHET）。免疫印迹分析显示，除了复合杂合个体 E605A/F709Tfs*17 的成纤维细胞外，所有患者样本的BRAT1蛋白水平均持续降低（图6A、B）。值得注意的是，携带 L391RHOM、R644*/M775K、F709Tfs*17HOM 和 L99Tfs*92/A164V 突变的患者细胞，与此前研究的 V62EHOM 细胞类似，其INTS11蛋白水平显著降低。具体而言，L391RHOM 和 F709Tfs*17HOM 患者的细胞还表现出INTS9水平下降，而 L99Tfs*92/A164V 细胞则显示整个Integrator切割复合物减少（图6A、B）。这些发现为BRAT1是维持INTS11稳定性以及Integrator切割复合物结构完整性所必需的提供了有力证据，与近期的结构研究结果一致。

图6 对BRAT1突变患者来源细胞中BRAT1和整合器亚基蛋白水平的分析。(A) 对来自健康对照、未受影响的父母以及BRA71突变患者的成纤维细胞和淋巴母细胞样细胞系((LCLs))中的BRAT1、INTS11、INTS9和INTS4进行免疫印迹分析。以β-肌动蛋白或α-微管蛋白作为上样对照。非特异性条带用星号（*）标注。(B) 对(A)中呈现的蛋白质水平进行至少三次独立实验的定量分析。数据以平均值±标准误（SEM）表示。采用双尾Student t检验确定统计学显著性（ns表示无显著性，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001）。

INTS11和BRAT1突变患者细胞中3'未加工U1小核RNA的核积累

为确定BRAT1突变是否会损害Integrator介导的U snRNA加工，我们分析了患者来源细胞中U snRNA的3'端加工过程。通过针对人类RNU1-1和RNU2-1基因编码的未加工形式U snRNA设计特异性引物组进行RT-qPCR检测，我们在几乎所有患者样本中均检测到3'未加工U1 snRNA的显著积累（图7A）。携带E605A/F709Tfs*17复合杂合变异的患者成纤维细胞是一个明显的例外。有趣的是，该患者不仅BRAT1蛋白水平无显著变化，其未加工U1 snRNA也未出现实质性增加，这提示新型E605A变异可能不具有致病性。值得注意的是，该患者还携带CASK（钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶）的潜在致病变异，这或许可以解释其严重的神经学表型（图2B；补充文件1：图S2A）。相比之下，对U2 snRNA加工的分析显示，未加工转录本仅有轻微增加，未达到统计学显著性水平，尽管在部分患者样本中观察到了类似的积累趋势（补充文件1：图S4C）。这一发现证实了U1——人类细胞中丰度最高的snRNA——及其加工检测在对不确定BRAT1变异进行功能分类时的诊断价值。令人兴奋的是，在携带纯合F709Tfs*17或L391R突变的个体中，观察到了最严重的U1 snRNA加工缺陷。除E605A/F709Tfs*17患者外，U1 snRNA加工异常的程度与与临床严重程度相关，这支持了U1小核RNA加工缺陷作为BRAT1相关疾病生物标志物的潜力。

图7 携带BRAT1和INTS11突变的患者来源细胞中3'端延长的未加工U1小核RNA的核积累。(A) 对对照组、亲本及BRAT1突变患者来源成纤维细胞（左）和淋巴母细胞样细胞（右）中未加工的RNU1-1转录本进行RT-qPCR分析。数据以平均值±标准误表示（E605A/F709Tfs*17患者数据对应(N=3)；(N=4)。采用双尾Student t检验计算统计学显著性（ns表示无显著性，*p<0.05、**p<0.01；***p<0.001、****p<0.0001）。 (B) 用于检测3'端延伸的未加工RNU1-1转录本的荧光原位杂交（FISH）策略示意图。DNA探针与经典3'框下游约1000个碱基对处的U1 snRNA未加工区域退火结合。 (C-D) 对INTS11突变（C）和BRAT1突变（D）成纤维细胞中经FISH检测到的未加工U1 snRNA焦点进行定量分析。结果以含U1焦点的细胞核百分比表示。对每种基因型，在两次独立的生物学重复中至少对121个细胞进行了定量(n ≥121)。 (E-F) INTS11突变（E）或BRAT1突变（F）成纤维细胞的代表性FISH图像，同时展示1BR对照组及未受影响的亲本。使用特异性荧光探针（红色）可视化未加工的U1 snRNA，细胞核则用DAPI染色（蓝色）。比例尺：25微米。

为进一步探究患者细胞中错误加工的U1小核RNA的命运，我们采用了荧光原位杂交（FISH）技术，使用与位于3'框下游约1000个碱基对处的U1小核RNA未加工区域互补的DNA探针进行检测（图7B）。该方法显示，除E605A/F709Tfs*17个体的成纤维细胞外，INTS11和BRAT1突变患者的细胞中均存在长链未加工U1小核RNA的核积累现象（图7C-F；补充文件1：图S6A-C）。值得注意的是，这些未加工的U1小核RNA定位于离散的核灶，这可能对应于U1的转录位点，每个细胞核中存在两个不同的信号代表两个等位基因，也证实了这一点。这些发现表明，加工异常的U1小核RNA不会被快速降解，而是在细胞核中积累，在此过程中可能会干扰细胞的关键生理过程。综上，这些结果证实，U1小核RNA 3'端加工缺陷是INTS11和BRAT1相关疾病的特征，并强调了其作为疾病严重程度分子读数的实用价值。此外，核内U1小核RNA的积累可作为评估新型INTS11和BRAT1变异体致病性的可靠生物标志物，从而有助于对患者进行诊断、变异分类以及临床风险分层。

整合子复合物对胚胎发生和细胞分化至关重要，其亚基（包括催化内切酶INTS11）的缺失会导致各物种出现致死现象。本研究构建了斑马鱼模型，证实了这一保守的必需性。INTS11基因敲除（Ints11-KO）的斑马鱼幼虫无法在受精后14天以上存活，并表现出严重的神经发育异常，包括脑体积减小、神经元数量减少以及行为异常。具体而言，INTS11-KO幼虫在光照下表现出活动不足，在黑暗中则过度活跃，这一模式与其他斑马鱼神经发育障碍模型中报道的行为表型相似。这些发现与果蝇dInts11突变体中观察到的幼虫致死现象一致，也确立了斑马鱼作为研究INTS11功能障碍的脊椎动物模型的地位。值得注意的是，斑马鱼中INTS11的缺失导致未加工的主要和次要剪接体U小核RNA显著积累，证实了其在RNA 3'端加工过程中的保守作用。这种破坏重现了携带INTS11突变的患者中观察到的关键分子和神经发育特征，进一步凸显了其与人类疾病的相关性。

尽管致病性INTS11变异体最近已与神经发育障碍相关联，但患者来源细胞中其对RNA代谢的影响仍未得到明确阐释。此前仅有一项研究对患者细胞进行了检测，描述了一种单一变异体（D106N）会损害INTS11的催化活性。通过分析携带不同INTS11变异体的更广泛人群队列（图1A），我们发现了U1 snRNA 3'端加工过程中存在的共同缺陷在所有患者中均观察到了这些缺陷。值得注意的是，即便在INTS11蛋白水平接近正常的细胞中也出现了此类缺陷，这表明许多致病突变体在不影响蛋白水平的情况下就会破坏Integrator复合物的功能。这揭示了致病作用的多种机制，包括催化活性受损、INTS9/INTS11异二聚体组装存在缺陷，或是整合进更大的Integrator复合物的过程发生改变。

基于我们此前发现BRAT1与INTS9/INTS11异二聚体相互作用，以及近期研究将BRAT1鉴定为Integrator切割模块的分子伴侣，我们将分析扩展至携带BRAT1突变的患者细胞。与Integrator功能受损的结果一致，覆盖BRAT1整个基因的突变（图2A）导致未加工的U1小核RNA水平升高，且加工错误的严重程度与临床结局相关，这为BRAT1相关疾病中存在基因型-表型关系提供了首个证据。值得注意的是，尽管使用单一无关对照存在局限性，但所有杂合亲本均表现出极低水平的未加工U1小核RNA，这支持了所观察到的缺陷主要由双等位基因变异驱动的结论。F709Tfs*17突变纯合子患者表现出最显著的缺陷，而V62E变异及其他与轻度表型相关的突变则伴随中度缺陷。重要的是，复合杂合子E605A/F709Tfs*17患者的BRAT1蛋白水平接近正常，且未检测到U1小核RNA加工错误，这强烈表明E605A该变异为良性变异。鉴于患者CASK基因中同时存在可能的致病变异，我们推测该患者的神经表型主要由CASK基因驱动。这些研究结果凸显了U1 snRNA加工检测在评估意义未明的BRAT1变异方面的诊断潜力，这对遗传咨询和患者管理具有直接意义。此外，鉴于近期发现WDR73是另一种可调控切割功能的INTS9/INTS11相互作用蛋白，我们建议将U1 snRNA加工分析的应用范围扩展至由WDR73突变引起的神经系统疾病。

总体而言，我们的研究数据证实，RNA 加工受损是 INTS11 和 BRAT1 相关疾病共有的核心分子特征。致病变异通过不同机制破坏整合子复合体的活性，包括直接抑制催化功能、导致复合体组装缺陷或失去调控伴侣蛋白，但这些变异最终都会指向同一生化结果——未加工的 U1 小核核糖核酸在细胞核中积累。值得注意的是，与我们实验室及其他团队此前的研究结果一致，整合子复合体缺失后，成熟小核核糖核酸的水平和整体剪接过程基本保持不变。此外，未加工的 U1 小核核糖核酸会稳定存在于细胞核内的特定灶点中，这表明它们不会被快速降解，且可能干扰基因组稳定性、RNA 加工或转录稳态。这些效应在有丝分裂后神经元中可能会产生尤为严重的危害，最终导致神经元功能异常和退行性病变。重要的是，整合子复合体的功能并不仅限于小核核糖核酸的加工。INTS11 还参与了多种RNA种类，包括编码蛋白质的RNA和非编码RNA。整合子通过转录提前终止调控基因表达，且该通路的缺陷与通过内含子保留转录本产生的双链RNA积累激活整合应激反应（ISR）有关。综上，这些过程的破坏可能共同导致整合子功能障碍患者出现疾病病理表现。阐明整合子功能障碍的这些广泛影响，为理解疾病发病机制提供了重要见解，或可为诊断方法开发及潜在治疗策略提供参考。

结论

本研究证实U1 snRNA 3'端加工受损是INTS11和BRAT1相关神经系统疾病的共同分子特征。该研究为BRAT1突变破坏U1 snRNA加工提供了直接证据，阐明了其功能作用，并扩大了整合子相关病理的范围。未加工的U1 snRNA在细胞核中的积累，可作为变异解读、疾病严重程度评估和患者分层的生物学依据生物标志物，尤其适用于BRAT1相关且此前未明确功能后果的病例。将患者来源的细胞分析与INTS11缺陷斑马鱼模型相结合，验证了整合子功能异常的体内影响，并为理解神经元易感性提供了机制框架。综上，这些研究结果为阐明此类疾病的分子病因提供了见解为RNA加工相关神经发育疾病的诊断改进和转化研究奠定基础。

方法

患者确认、临床及遗传学评估

通过合作、对诊断和研究相关内容进行系统性筛查，我们发现了携带 INTS11 和 BRAT1 双等位基因突变的受影响个体全球范围内的遗传数据库以及向GeneMatcher数据库的提交。所有参与者及其/其法定监护人均已根据当地伦理准则获得了诊断研究和基于研究的研究知情同意。在各诊断或研究实验室对从外周血中提取的基因组DNA进行了全外显子组或基因组测序。在适用情况下，通过Sanger测序对先证者及可用的家庭成员进行候选变异的验证。由参与研究的临床医生系统收集新招募病例和既往报道病例的临床数据，并对其进行独立审查和分析（补充文件1：图S1A、B；图S2A、B）。评估的临床参数包括全面发育迟缓（GDD）和智力障碍（ID），以及运动能力、痉挛、共济失调、癫痫、小头畸形和脑成像异常等神经系统特征。我们分析了13例携带双等位基因INTS11突变患者的临床数据（标识符：(n=)，共13例），其中包括3例既往报道且更新了随访信息的病例、2例已发表病例以及8例新病例（图1A、B；补充文件1：图S1A、B）。同时，我们分析了12例携带双等位基因BRAT1突变个体的临床数据（标识符：(n=12)，包含7例既往报道病例和5例新病例）（图2A、B；补充文件1：图S2A、B）。该研究队列包含男性和女性患者。

细胞系与培养条件

本研究采用了从携带INTS11基因双等位基因变异的个体中获取的患者来源原代成纤维细胞和淋巴母细胞系（LCLs）或BRAT1（图1B；图2B）。在可行的情况下纳入未受影响的杂合亲本的细胞，这些细胞被称为“亲本”，而非对照。无关对照样本包括1株原代成纤维细胞系(n=1)；标记为1BR ctrl）和1株淋巴母细胞样细胞系（LCL，(n=1)，标记为LCL ctrl），如前文所述。对于INTS11，从9例双等位基因突变患者(n=9)和4例携带单个INTS11突变的未受影响亲本(n=4)中获取原代成纤维细胞。从1例受累个体(n=1)及其双亲((n=2)中建立淋巴母细胞样细胞系。对于BRAT1，从8例双等位基因突变患者(n=8)和4例携带单个BRAT1突变的未受影响亲本(n=4)中获取原代成纤维细胞。从3例受累个体(n=3)和4例亲本(n=4)中获取淋巴母细胞样细胞系。所有患者的性别在相应图表中均有标注（补充文件1：图S1A；图S2A）。部分亲本样本的性别信息未收录。样本收集时，已获取细胞系建立及其用于研究的书面知情同意书。人成纤维细胞培养于最低必需培养基（MEM；Gibco），该培养基添加15%胎牛血清（FBS；Gibco）、2mM L-谷氨酰胺（Gibco）和抗生素（100单位/毫升青霉素及100微克/毫升链霉素；Gibco），在37℃、含5%二氧化碳的湿润环境中培养(CO_{2})。淋巴母细胞样细胞系在相同条件下，培养于添加10%胎牛血清及抗生素（100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素；Gibco）的罗斯威尔公园纪念研究所1640培养基（RPMI 1640；Sigma）中。

INTS11基因敲除斑马鱼的构建

多项独立研究已证实，若精心设计并验证，CRISPR 斑马鱼表型分析具有可靠性[31-34]。基于此，我们利用成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统构建了 ints11 基因敲除的斑马鱼 F0 代（ints11-KO；CRISPR 斑马鱼）。通过在线工具 CRISPRscan 设计了三条单导向 RNA（gRNA），靶向外显子 4（靶序列旁侧基序标注于括号内）：

 CAGGATGGGGCAGATGGCTT埃克森9号：

CCCGGTGGAGAAATAAATGG(GGG)，以及外显子13：

AGCGCTCACGCAGACGCCAA(AGG) 位于 ints11 基因中。对照 gRNA 的设计方式类似，其基因特异性序列的 3' 端存在五个错配（小写字母表示错配）：外显子 4：CAGGAUGGGGCcGgUUaCcU

外显子9：CCCGGUGGAGAgAcAUAgGU，外显子13：

AGCGCUCACGCcGgCUCUAg。按照先前描述的方法[35]，将体外转录的Cas9 mRNA和合成的2’MOE修饰的gRNA（Synthego公司产品）显微注射到单细胞期胚胎中。对于每项检测，通过高分辨率熔解基因分型技术[35]验证了gRNA的诱变评分以及5个错配gRNA的无诱变特性。

斑马鱼的饲养与管理

所有动物实验均在蒙特利尔大学医院中心（CHUM）研究中心进行，实验过程遵循机构动物护理指南以及加拿大动物护理委员会的相关规定。成年斑马鱼（斑马鱼）饲养于28.5摄氏度的环境中，光照周期为12小时明/12小时暗，其发育阶段划分参照此前的研究方法。胚胎通过自然产卵获得在28.5摄氏度的E3培养基中培养。每日监测幼虫的形态、行为和存活情况，在对照条件下未观察到需要提前实施人道终点的异常不良表型。必要时，通过过量使用MS-222（甲烷磺酸三卡因）对幼虫实施安乐死，随后按照加拿大动物护理委员会的指南确认其死亡。

斑马鱼的表型鉴定

对受精后5天（dpf）的幼虫进行形态学分析。将幼虫固定在3%甲基纤维素的凹槽中，使用徕卡S6E体视显微镜拍摄图像。利用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）从经刻度校准的图像中测量体长、头部大小和眼部大小。

斑马鱼行为学检测

使用斑马鱼行为轨迹分析系统（DanioVision，荷兰瓦赫宁根的 Noldus 公司）监测5日龄斑马鱼幼鱼的游泳行为，实验过程为1小时黑暗期后接1小时光照期。将幼鱼单独放置于96孔板的单个孔中，每孔加入200微升E3培养基，实验前先在Daniovision记录舱中适应1小时。采用Ethovision XT12（Noldus公司）软件分析记录时段内的游泳距离和最大加速度。

抗体

本研究使用的一抗如下：抗-BRAT1 C端（蛋白质印迹 1:50000；Abcam，ab181855）、抗-BRAT1（蛋白质印迹 1:1000；赛默飞世尔科技）PA530916）、抗INTS11抗体（蛋白质印迹，1:1000；Novus Biologicals，NB100-60638）、抗INTS9抗体（蛋白质印迹，1:1000；Cell Signalling，13945）、抗INTS4抗体（蛋白质印迹，1:1000；Abcam，ab75253）、抗β-肌动蛋白抗体（蛋白质印迹，1:5000；Protein Tech，66009）、抗α-微管蛋白抗体（蛋白质印迹，1:8000；Abcam，ab6160）、抗α-微管蛋白抗体（蛋白质印迹，1:1000；Santa Cruz，sc-23948）、抗小白蛋白7抗体（斑马鱼幼虫免疫染色，1:1000，小鼠单克隆抗体，由日本名古屋大学的日比博士惠赠）。蛋白质印迹实验所用的二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体（1:10000；Bio-Rad，170-6515）、山羊抗小鼠抗体（1:10000；Bio-Rad，1706516）和兔抗大鼠抗体（1:10000，Abcam，ab6734）。

对斑马鱼幼虫进行免疫染色：将ints11突变体幼虫在室温下置于含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定1小时。经PBST溶液逐步复水后，将幼虫在冰丙酮中透化处理10分钟。封闭与透化步骤采用含5%正常山羊血清、1%牛血清白蛋白（BSA）和1%二甲基亚砜（DMSO）的1×PBS缓冲液，在室温下孵育1.5小时。随后，将幼虫与抗小白蛋白7（Parvalbumin7）抗体（日本名古屋大学日比博士馈赠）在4℃条件下孵育过夜。经多次洗涤后，再与Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗在4℃孵育过夜。通过共聚焦显微镜分析荧光信号，并使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院）处理图像。

总RNA提取及RT-qPCR分析

使用 PicoPure RNA 提取试剂盒（赛默飞世尔科技），按照制造商的标准方案，从受精后5天的完整幼虫中提取总RNA。每个样本均从5只完整幼虫的混合物中分离RNA。使用Nanodrop分光光度计评估RNA质量，通过测定260/280和260/230比值来检测潜在的化学污染。采用500纳克总RNA，搭配SuperScript VILO逆转录混合物（赛默飞 Invitrogen）进行逆转录反应。在LightCycler 96实时荧光定量PCR仪（罗氏）上进行定量逆转录PCR（RT-qPCR），反应体系包含2微升1:10稀释的互补DNA（cDNA）、SYBR Green I Master荧光定量PCR预混液（罗氏），以及以下目标引物对：

U1_4snRNA_F-AAATGTGGGAATCTCGACTGCATG 与 U1_4snRNA_R-CTCGTGTGTCCTTGATTGTGTGTG（未加工的 U1 snRNA）；U2_snRNA_F-GCATCGACCCGGTATTGCAG 与 U2_snRNA_R-ACGAACCAATCTCCACATGC（未加工的 U2 snRNA）；U2_1snRNA_F-GCATCGACCCGGTATTGCAG 与 U2_1snRNA_R-TCGTTGATACACATCATTCG（未加工的 U2_1 snRNA）；U2_2snRNA_F-GCATCGACCCGGTATTGCAG 与 U2_2snRNA_R-ATGTATCAATCCGTCTTATCTC（未加工的 U2_2 snRNA）；U5_snRNA_F-TGATGCCCTGCCTATCGGTG 与 U5_snRNA_R-AGGTTCCATCCGTTATTTCTCTTTC（未加工的 U5 snRNA）；U6_1_snRNA_F-GCAAACCCGTTAAGCGATCCAT 与 U6_1_snRNA_R-CACCTCCCACGATTTGCTAAAC（未加工的 U6_1 snRNA）；U6_2_snRNA_F-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCTC

U6_2_snRNA_R-TTTCCCTCACCGGATACTGT（未加工的U6_2 snRNA）；U6_3_snRNA_F-ACGCAAATTCGTGAAGCGTTCC和U6_3_snRNA_R-CATTGCACGCTCAAACTCGGT（未加工的U6_3 snRNA）；U6_4_snRNA_F-CGCAAATTCGTGAAGCGTTCCA和U6_4_snRNA_R-GGATGCGCTGCGTACTGAAC（未加工的U6_4 snRNA）；U12_snRNA_F-TTTGAACGGGTACAGGTCTGC和U12_snRNA_R-TTTAACCTGTTATTGGGTGTTGTCG（未加工的U12 snRNA）；ef1a_F-GTGGCTGGAGACAGCAAGA和ef1a_R-AGAGATCTGACCAGGGTGGTT（延伸因子1α）；gapdh_F-TTGAGAAACCTGCCAAGTATGA和gapdh_R-CCCATTGAAGTCAGTGGACA（脱氢酶）；polr2d_F-AACGCAAAGTGGGAGATGTG和polr2d_R-AGCGTCTCTGCGTTCTCAA（RNA聚合酶II亚基D）。

为进行人工对照实验，使用未受影响的亲本细胞和患者来源的细胞，按照制造商的说明，采用 RNeasy 迷你试剂盒并额外进行 Dnase I 消化（Qiagen 公司；货号 74104 和 79254）提取总 RNA。使用 Nanodrop 分光光度法检测 RNA 质量。取 1 微克总 RNA，利用 RevertAid 逆转录酶（Life Technologies 公司）结合随机六聚体引物逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）。采用 SYBR Green PCR 主预混液（Life Technologies 公司），在 LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 仪（Roche 公司）上进行定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR），所用目标引物对如下：

RNU1_F-GAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAG 以及

RNU1_R-CTTGGCGTACAGTCTGTTTTTGAAACTC（U1 小核核糖核酸未加工型）；

RNU2_F-AACATAGGTACACGTGTGCCACGG

RNU2_R-ACAAATAGCCAACGCATGCGGGGC（未加工的U2小核RNA）；

RPLP2_F-TCTTGGACAGCGTGGGTATCGA

RPLP2_R-CAGCAGGTACACTGGCAAGCTT（大核糖体亚基蛋白P2）；

ACTB_F-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC 与

ACTB_R-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT（β-肌动蛋白）。

表达数据经标准化处理以匹配参考基因的表达水平，相对表达量通过 Pfaffl 法计算：

可变剪接的表征

利用DreamTaq聚合酶（赛默飞世尔，货号EP0702），以分离得到的cDNA为模板，通过以下引物对INTS11转录本中包含(c. 28+1406 C>T)突变的区域进行扩增：INTS11exon1_F-ATCAGAGTCACGCCCTTG和INTS11exon4_R-ACCATCTCGCTGAAGTAG。通过琼脂糖凝胶电泳分离可变剪接变体，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒（碧迪科技，货号28704）进行回收。按照制造商的操作说明，将包含患者突变的纯化PCR产物插入TOPO TA载体中（TOPO™ TA克隆™试剂盒，赛默飞世尔英潍捷基，货号450641）。可变剪接体的存在通过桑格测序法，利用以下引物确定了外显子的使用情况：M13_F-GTAAAACGACGGCCAG 和 M13_R-CAGGAAACAGCTATGAC。

为检测由 INTS11 内含子突变 (c. 1041+3 G>C / c .1464+3 G>C) 和 (c. 1295-9 G>A) 引起的可变剪接，使用 DreamTaq Green PCR 主混合液（赛默飞世尔，K1082）结合以下引物对 cDNA 进行扩增：

INTS11外显子9_1正向引物-CCACTACTACAAGCTGTTC,（INTS11外显子9_2F）

CCAGAAGATCCGCAAGAC，以及 INTS11exon16_2R-CACACAGTGGTCCTTCAG（熔解温度 60 摄氏度，2% 凝胶；GeneRuler 1Kb Plus DNA 梯和 SM0241）或 INTS11exon9_1F-CCACTACTACAAGCTGTTC，（INTS11外显子16_1R）

CCAGAAGATCCGCAAGAC，以及 INTS11exon16_2R-CACACAGTGGTCCTTCAG（熔解温度 60 摄氏度，2% 凝胶；GeneRuler 1Kb Plus DNA 梯和 SM0241）或 INTS11exon9_1F-CCACTACTACAAGCTGTTC，

ACAGTCACAGAGCCGTCTGG，以及 INTS11exon16_2R-CACACAGTGGTCCTTCAG（熔解温度 62℃，3% 凝胶；GeneRuler 100 bp Plus DNA 分子量标准）。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹细胞在SDS上样缓冲液（2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、50毫摩尔/升Tris-HCl，pH 6.8）中收集并裂解，于95摄氏度变性10分钟，随后使用Bioruptor® Pico超声破碎仪（Diagenode公司）超声处理30秒。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Pierce公司；货号23227）检测蛋白浓度。向样品中加入二硫苏糖醇和溴酚蓝，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用相应的一抗结合辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。使用ECL化学发光试剂（通用电气医疗集团）和Amersham Hyperfilm ECL化学发光胶片（通用电气医疗集团）触发并检测过氧化物酶活性。将曝光后的胶片进行扫描，得到数字图像。使用 Image Studio Lite 5.2 版软件（LI-COR 生物科学公司）进行分析。信号强度以内参蛋白（β-肌动蛋白或α-微管蛋白）为参照进行标准化处理。

荧光原位杂交（FISH）

在玻璃盖玻片上培养的细胞用4%甲醛固定10分钟，用70%乙醇在冰上通透处理1小时，并用PBS洗涤三次。随后根据制造商的说明（Stellaris RNA-FISH；LGC Biosearch Technologies；SMF-WA1-60、SMF-HB1-10、SMF-WB1-20和SMF-1083-5），使用荧光DNA探针（BIOSEARCH technologies #SMF-1083-5，参考文献#SS847331-01-30）进行杂交。该荧光标记的DNA探针设计用于特异性结合U1 snRNA的未加工区域，跨越3'框下游约1000个碱基对。杂交后，样品用PBS洗涤，并用DAPI对细胞核进行染色。盖玻片使用Vectashield抗褪色封片剂（Vector Laboratories）封片。使用Leica DM6000显微镜分析荧光并采集图像。对于每种基因型，在两次独立的生物学重复中，至少对121个细胞进行定量(n ≥121)。通过CellProfiler 4.2.5定量FISH焦点的数量及其强度。使用IdentifyPrimaryObjects分割模块，通过全局两类Otsu阈值法鉴定细胞核，阈值因子设为0.95，阈值平滑尺度设为1.3488。保留直径在50-400像素之间的对象。使用IdentifyPrimaryObjects分割模块检测焦点采用基于鲁棒背景法的全局阈值处理，应用0.95的阈值因子和1.3488的阈值平滑尺度。异常值的下限和上限分数均设为0.05。保留直径在3至20像素之间的目标物。对于细胞核和病灶，均剔除与边界接触的目标物。

统计分析

使用GraphPad Prism 10对斑马鱼数据进行统计分析。每个实验均使用至少从三个独立批次中收集的十个独立样本。患者数据的统计分析使用Microsoft Excel的XLMiner Analysis ToolPak加载项和GraphPad Prism 10完成。统计比较的实施方式如下。对于小样本量≤5，采用双尾Student t检验分析数据并评估实验重复间的显著性，置信区间设定为95%。对于大样本量（n≥5），首先通过Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。符合正态性假设的数据采用双尾Student t检验分析，不符合正态性假设的数据则采用非参数Mann-Whitney检验。每个比较所采用的统计检验方法均在对应图表图例中标注。当p值＜0.05时，结果被认为具有统计学显著性。统计学显著性水平用星号表示如下：(*)、(**)、(***)、(****)分别对应p值＜0.05、0.01、0.001和0.0001。