题目：Systemic Inflammation Triggers Motor Axon Degeneration Via Macrophage IL-1β-Mediated P53/SIRT1/Autophagy Pathway

原文链接:https://doi.org/10.1007/s10753-026-02530-6

期刊:Inflammation

摘要

研究背景：运动神经元轴突变性是神经退行性疾病的标志性病理特征，在疾病晚期会导致运动功能障碍。全身性炎症会加重运动功能障碍，但全身性炎症与运动轴突变性之间的关系仍知之甚少。本研究探讨了全身性炎症期间巨噬细胞是否会损害运动轴突的形态以及其潜在机制。

方法：采用CuSO_{4}硫酸铜（CuSO₄）暴露建立斑马鱼全身炎症模型。通过体内共聚焦成像观察转基因斑马鱼中巨噬细胞与运动轴突形态的时空关系。利用行为学分析评估运动功能。将脂多糖刺激的RAW264.7巨噬样细胞与NSC-34运动神经元共培养，以探究相关分子机制。

结果：CuSO_{4} 硫酸铜处理导致斑马鱼炎症细胞因子升高并引发运动功能障碍。组织学分析显示，运动轴突周围巨噬细胞浸润增加，同时轴突的数量、长度和直径均减少。巨噬细胞耗竭或白细胞介素-1受体拮抗剂预处理可显著改善运动轴突损伤及功能障碍。体外实验中，脂多糖激活RAW264.7巨噬样细胞中的NLRP3炎症小体，释放白细胞介素-1β，同时伴随运动神经元中SIRT1-自噬轴的紊乱。巨噬细胞释放的白细胞介素-1β增多，导致运动神经元中P53表达上调，这与SIRT1水平降低、自噬功能受损以及轴突相关蛋白表达下降相一致。使用MCC950进行NLRP3药理抑制、白细胞介素-1受体拮抗剂处理或P53基因敲低，均可恢复SIRT1-自噬轴及轴突蛋白的表达。

结论：全身性炎症会激活巨噬细胞NLRP3炎症小体，并促进包括IL-1β在内的炎症介质释放，研究结果提示存在这样一种机制模型：IL-1β水平升高与1 beta相关联运动神经元P53表达增加以及SIRT1自噬平衡被破坏，这可能导致运动轴突的形态损伤和功能障碍。

关键词：巨噬细胞；斑马鱼；白细胞介素-1β；运动轴突；沉默调节蛋白1

引言

神经退行性疾病给全球医疗保健系统带来了日益严峻的重大挑战。流行病学研究表明，全球有超过1000万人患有帕金森病（PD），其患病率在过去25年中翻了一番；脊髓性肌萎缩症（SMA）相关遗传变异的携带者频率接近全球人口的3%；而肌萎缩侧索硬化症（ALS）虽然相对罕见，但其发病率正呈现令人担忧的上升趋势。这些神经退行性疾病严重影响患者的生活质量，并给医疗保健系统和社会带来了沉重的社会经济负担。因此，开发有效的治疗干预措施已成为全球卫生领域的一项紧迫优先事项。

运动轴突的结构与功能完整性对于维持正常运动功能具有重要意义。神经丝由轻链（NFL）、中链（NFM）和重链（NFH）组成，是主要在成熟轴突中表达的关键细胞骨架成分。运动轴突变性是神经退行性疾病的特征性表现，其特征为神经丝表达进行性丧失、轴突肿胀、碎裂以及神经传导受损，最终导致严重的运动功能障碍。全身性炎症是加速神经退行性疾病发病和进展的关键因素，其与运动功能障碍的因果关系在多种病理状态下均有充分记载。全身性炎症是一种复杂的病理生理状态，涉及多种炎症介质的释放和免疫细胞的活化。巨噬细胞作为免疫反应的关键调控者，在全身性炎症期间被激活，并分泌促炎细胞因子（包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-1），其异常表达水平与疾病进展和运动功能障碍的严重程度相关。目前的研究已明确，神经退行性疾病中全身性炎症与运动功能障碍的发生密切相关，炎症因子的异常升高可能通过直接或间接机制影响运动神经元，但仍需进一步研究来明确在全身性炎症背景下运动轴突的形态损伤是否会导致运动功能障碍，并阐明其潜在机制。

运动轴突损伤会引发瓦勒变性，导致轴突和髓鞘崩解，产生大量碎片以及具有抑制作用的髓鞘片段，这些物质会阻碍轴突的再生与修复。巨噬细胞凭借强大的吞噬能力，迅速在变性轴突区域聚集，主动吞噬变性和坏死的组织碎片，抑制性髓鞘及轴突碎片。巨噬细胞除了作为免疫系统关键组成部分发挥作用外，还通过分泌细胞因子和炎症因子影响微环境。在全身性炎症过程中，巨噬细胞最初通过清除碎片和启动修复机制发挥有益功能。然而，在慢性或失调的炎症状态下，巨噬细胞会释放有害的细胞因子、活性氧（ROS）和酶，同时阻碍轴突再生，从而进一步损伤运动轴突。我们先前的研究发现，脓毒症小鼠坐骨神经周围存在大量巨噬细胞，浸润的巨噬细胞会导致坐骨神经水肿及随后的神经肌肉功能障碍。尽管如此，全身性炎症诱导的巨噬细胞活化与运动轴突形态学变化之间的关系仍有待进一步深入研究。

SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶，是多种生物学过程的关键调控因子。通过与多个下游通路相互作用，SIRT1对细胞应激反应、代谢稳态以及衰老相关过程发挥广泛的调控作用。在其众多下游通路中，自噬成为SIRT1发挥保护作用的一种极为重要的机制，尤其是在神经元中。这对于维持神经元的细胞稳态、预防神经退行性病变至关重要。在轴突变性过程中，自噬通过降解受损或多余的细胞器和大分子，减少细胞内氧化应激，保护神经元和轴突免受损伤炎症反应。SIRT1可通过去乙酰化作用调控多种自噬相关蛋白及信号通路，促进自噬的启动与进展。然而，系统性炎症状态下巨噬细胞分泌的炎症因子是否能通过破坏SIRT1-自噬轴、降低细胞内自噬水平来介导运动轴突变性，目前仍不明确。

斑马鱼已成为研究神经退行性疾病中小胶质细胞和巨噬细胞功能的强大模型。斑马鱼幼体的光学透明性，结合先进的转基因标记技术，可实现体内巨噬细胞-神经元相互作用的实时可视化。活体成像研究表明，小胶质细胞通过形态变化和吞噬激活快速响应神经元损伤，其突起会在数分钟内向受损神经元聚集。重要的是，利用斑马鱼开展的研究揭示，炎症细胞因子在组织再生中发挥关键调控作用，促炎阶段和抗炎阶段均对正常修复过程至关重要。因此，斑马鱼模型为解析全身炎症过程中巨噬细胞激活的时间动态及其与运动神经元的相互作用提供了独特契机。

因此，本研究提出以下假说：全身性炎症会激活并募集巨噬细胞浸润运动轴突周围，这些巨噬细胞会分泌促炎细胞因子，进而破坏运动神经元中的SIRT1自噬轴，最终导致轴突退行性变。以及运动功能障碍。本研究利用荧光转基因斑马鱼和体内共聚焦显微镜技术，旨在探究系统性炎症状态下巨噬细胞是否通过对运动轴突造成结构性损伤来损害运动功能。研究人员通过Transwell共培养技术，探索了巨噬细胞介导的神经元SIRT1自噬轴破坏背后的潜在分子机制。阐明这些关系或可为神经退行性疾病中与系统性炎症相关的运动功能障碍提供潜在治疗策略的宝贵见解。

结果

斑马鱼全身性炎症模型的构建

为建立斑马鱼全身性炎症模型，将5天龄（dpf）的斑马鱼置于含不同浓度硫酸铜（0、5、10、20和40微摩尔）的E3培养基中培养3天。随后检测斑马鱼的死亡率、活性氧（ROS）生成量、形态变化以及炎症因子的表达水平。已检测到。研究结果表明，随着(CuSO_{4})浓度的升高，斑马鱼的死亡率和活性氧（ROS）生成呈剂量依赖性增加（图1a-b）。图1b）。硫酸铜暴露3天（受精后5-8天）会导致斑马鱼出现形态学改变，如心包和卵黄囊水肿、脊柱弯曲、卵囊破裂，有时还会导致斑马鱼死亡（图1c）。研究还分析了炎症因子白细胞介素-7（c292fcc-6433-41e8-9a50-d39ff820ffcc）、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的mRNA表达水平。研究证实，经(CuSO_{4})处理后，三种炎症因子的mRNA表达均呈剂量依赖性上调，其中白细胞介素-1β（(1 beta)）的变化最为显著（p<0.05)，图1d-f）。

图1 利用硫酸铜暴露建立斑马鱼全身性炎症模型 (CuSO_{4})。a 不同浓度硫酸铜（0-20微摩尔）处理3天的斑马鱼幼鱼活性氧生成代表性图像 (bar =500 mu m)。比例尺 b 不同浓度 (CuSO_{4})（0-40皮摩尔）处理的斑马鱼幼鱼3天存活曲线 (n=30) c 明视野下的代表性图像硫酸铜暴露后斑马鱼幼虫形态变化的显微图像。红色箭头指示病理改变。d-f 硫酸铜暴露3天后斑马鱼幼虫炎症细胞因子表达的实时荧光定量PCR分析。将白细胞介素-（d）、肿瘤坏死因子-α（e）和白细胞介素-6（f）的相对mRNA水平归一化至延伸因子1α。数据以平均值±标准差表示。与对照组相比，无显著差异。

硫酸铜暴露降低斑马鱼的运动功能

将5天龄受精后（dpf）的斑马鱼幼虫暴露于(CuSO_{4})硫酸铜（0、5、10和20微摩尔）3天后，对其运动功能进行了评估。运动轨迹和热图分析表明，随着(CuSO_{4})硫酸铜浓度的升高，斑马鱼的运动能力呈渐进性下降（图2a-b）。软件分析和数据可视化显示，在光照和黑暗环境中，随着(CuSO_{4})浓度的增加，斑马鱼的运动速度和总游动距离在50分钟时均出现显著的剂量依赖性降低(p<0.05，图2c-e）。

图2 CuSO_{4} 硫酸铜暴露损害斑马鱼的运动行为。a-b 展示了斑马鱼幼体暴露于不同浓度硫酸铜（0-20 μM）3天后的运动轨迹（a）和热图（b）。c 斑马鱼幼体在50分钟明暗交替周期内的实时游泳速度。黑色和白色条带分别代表黑暗和光照周期。d-e 50分钟记录期内斑马鱼幼体移动总距离（d）和平均游泳速度（e）的量化分析（每组12条幼体，三次独立实验）。数据以平均值±标准差表示。{* *} p<0.01、****p<0.0001。与对照组相比

CuSO _{4} 3.3 硫酸铜暴露增加斑马鱼运动轴突处巨噬细胞浸润并诱导运动轴突形态变化

选择10微摩尔浓度用于后续研究，是因为该浓度可诱导显著的炎症反应和运动功能障碍，且不会引起明显的细胞死亡（补充图1a-b），约60%的幼虫保持正常形态（补充图1c）；所有后续实验均仅使用形态正常的幼虫。采用激光共聚焦活体成像技术，通过Tg(mnx1:eGFP; mpeg1:mCherry)品系观察荧光变化，探究(CuSO_{4})暴露过程中巨噬细胞与运动轴突的相互作用。建模后发现斑马鱼运动轴突周围的巨噬细胞浸润显著增加，同时运动轴突出现形态损伤（补充视频1、图3a）。定量分析结果显示，与对照组相比，建模组的运动轴突长度、直径和数量均显著减少，运动轴突周围的巨噬细胞浸润量增加两倍以上，且以阿米巴样形态为主（p<，P<0.05，图3b-e）。此外，对Z轴扫描的三维重建分析显示，建模后巨噬细胞与运动轴突之间的最短距离有所降低（p<0.05，图3f-g）。

图3 CuSO_{4} 硫酸铜暴露会增强巨噬细胞浸润并诱导运动轴突形态损伤。a 经或未经CuSO_{4}（10皮摩尔）处理的Tg(mnx1:eGFP;mpeg1:mCherry)斑马鱼中运动轴突（绿色）和巨噬细胞（红色）的共聚焦代表性图像。右侧展示了不同的巨噬细胞表型。b-e 对照组和(CuSO_{4})处理组（15-18条幼虫/组，每条幼虫5个轴突）中运动轴突长度（b）、直径（c）、数量（d）以及不同表型巨噬细胞浸润情况的定量分析。f 基于共聚焦Z-stack图像对运动轴突和巨噬细胞进行的三维重建。比例尺=40微米。bar =40mu m右侧图为框选区域的放大视图。g 为巨噬细胞与运动轴突之间最短距离的定量分析（n=100）。数据以平均值±标准差表示。* **p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001

部分巨噬细胞耗竭与IL-1Ra可减轻CuSO_{4}暴露过程中运动轴突的形态损伤

为探究在(CuSO_{4})硫酸铜暴露期间，巨噬细胞浸润至运动轴突是否会引发形态损伤，向3天龄斑马鱼的卵黄囊显微注射2纳升干预剂，以部分耗竭巨噬细胞。2天后，将斑马鱼暴露于CuSO_{4}，随后进行指标检测（图4a）。鉴于前期实验中IL-1β显著升高，且已有文献证实其来源于巨噬细胞，向3天龄斑马鱼的卵黄囊注射2纳升（50纳克/毫升）白介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）开展干预实验。氯膦酸脂质体显微注射2天后，观察到巨噬细胞总数减少。统计分析显示，指定区域内的巨噬细胞数量减少了约60%（p<0.05，补充图2a-b）。在无炎症刺激的情况下耗竭巨噬细胞后，对运动轴突形态的初步评估未发现显著变化 p>0.05，补充图2c-e）。随后，在(CuSO_{4})处理前、硫酸铜暴露前进行预处理。实验结果表明，造模前用氯膦酸脂质体或IL-1Ra预处理，可有效逆转CuSO_{4}暴露导致的运动轴突长度、直径和数量减少。此外，该干预措施可部分恢复了轴突末梢分泌的关键神经递质乙酰胆碱（Ach）水平（p<0.05，图4b-f）。然而，巨噬细胞表型分析显示，经氯膦酸脂质体和白介素-1受体拮抗剂预处理后，模型中的巨噬细胞仍以阿米巴样形态为主（图4g）。

图4 巨噬细胞耗竭与白介素-1受体拮抗剂处理可改善运动轴突CuSO_{4}暴露期间的损伤。a 实验设计示意图，显示在3 dpf时脂质体氯膦酸盐显微注射、5 dpf时CuSO_{4}暴露以及8 dpf时进行分析。b 对照组、硫酸铜处理组和干预组中运动轴突（绿色）和巨噬细胞（红色）的代表性共聚焦图像。标尺(bar =50mu m) c-e 不同组间运动轴突数量（c）、直径（d）和长度（e）的定量分析。f 不同处理条件下斑马鱼幼虫中的乙酰胆碱含量。g 不同组间巨噬细胞表型的分布（每组15-18只幼虫，每只幼虫5个轴突）。数据以均值±标准差表示。** ***p<0.001，****p<0.0001

巨噬细胞部分清除及IL-1Ra改善CuSO _{4}暴露引发的运动功能障碍

在观察到氯膦酸二钠脂质体和白细胞介素-1受体拮抗剂治疗后运动轴突形态得到改善后，研究人员对不同组斑马鱼的运动功能进行了评估。初步评估显示，在未暴露于CuSO_{4}的模型中，部分巨噬细胞清除后运动功能未出现显著改变（p>0.05，补充图3a-b）。随后，研究人员在CuSO_{4}暴露前实施了预处理方案。轨迹分析和热图分析结果显示，氯膦酸二钠脂质体预处理可缓解CuSO_{4}暴露导致的运动功能恶化。对50分钟内运动速度的延长评估，包括平均运动速度和总运动距离的统计分析表明，在巨噬细胞未完全清除的情况下，运动功能相关指标得到了部分恢复（p<0.05，图5a-e）。此外，使用 IL-1Ra 进行的实验结果表明，IL-1Ra 预处理同样能改善与硫酸铜 CuSO_{4} 暴露相关的运动功能下降（p<0.05，图5f-g）。

图5 巨噬细胞耗竭和IL-1Ra治疗在CuSO_{4})暴露期间改善运动功能。a-b 代表性运动轨迹（a）和热图（b）展示了不同处理组的运动活性。c 明暗交替周期内50分钟的实时游泳速度。黑色和白色条形分别代表黑暗和光照周期。d-e 对照组与氯膦酸酯脂质体干预组的总移动距离（d）和平均游泳速度（e）定量分析。f-g 对照组与白介素-1受体拮抗剂干预组的总移动距离（f）和平均游泳速度（g）。数据以均值±标准差表示（每组12条幼体，三次独立实验）。* p<0.05、****p<0.0001

抗氧化剂NAC处理无法改善硫酸铜暴露诱导的运动轴突损伤和运动功能障碍

鉴于CuSO_{4}暴露会同时诱发炎症反应和氧化应激，本研究探究了氧化应激在运动轴突损伤和巨噬细胞浸润过程中的作用。为验证这一假设，对5天龄（dpf）的斑马鱼幼鱼用CuSO_{4}（10微摩尔）和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC，100微摩尔）共同处理3天。NAC有效减少了CuSO_{4}暴露诱导的活性氧（ROS）生成（补充图4a）。运动轴突和巨噬细胞的共聚焦成像结果显示，NAC处理并未显著改善运动轴突的形态损伤（补充图4b）。定量分析表明，尽管成功降低了活性氧水平，但与仅用硫酸铜处理组相比，NAC+硫酸铜组的运动轴突长度、直径和数量均无显著改善（p>0.05)，补充图4c-e）。此外，运动轴突周围的巨噬细胞浸润在处理后仍保持在较高水平NAC 处理组中，呈阿米巴样形态的巨噬细胞表型分布无统计学显著变化（p>0.05，补充图4f）。

为进一步评估氧化应激是否导致运动功能障碍，本研究评估了NAC处理斑马鱼的运动活性。运动轨迹和热图分析显示，NAC联合处理无法恢复CuSO_{4}暴露所引起的运动损伤（补充图5a-b）。对总移动距离和平均游泳速度的定量分析表明，与对照组相比，硫酸铜暴露显著降低了斑马鱼的运动活性，而补充NAC未能使这两个指标出现显著改善（p>0.05，补充图5c-d）。

脂多糖处理激活RAW264.7巨噬样细胞中的NLRP3炎症小体并诱导白细胞介素-1β释放

本研究通过体外模型探究了全身炎症下巨噬细胞诱导运动轴突损伤的分子机制。构建Transwell共培养体系，将RAW264.7巨噬样细胞置于上室，NSC-34细胞置于下室。共培养前，用LPS预处理RAW264.7巨噬样细胞6小时以模拟炎症环境（图6a）。随后合并小室以探究潜在机制。利用条件培养基的初步实验确定了LPS的最佳浓度，此时NSC-34细胞活力下降约40%微克/毫升脂多糖（p<0.05)，补充图6）。该浓度被选用于后续的共培养实验。基于上述动物实验结果，研究人员推测，在(1 beta)期间的全身性炎症过程中，巨噬细胞可能通过释放白介素-1β对运动轴突造成形态学损伤。有研究报道，NLRP3炎症小体的激活是介导巨噬细胞分泌(1 beta)的主要信号通路。本研究观察到，RAW264.7巨噬样细胞暴露于脂多糖6小时后，NLRP3炎症小体被激活。这些结果表明，脂多糖刺激显著上调了RAW264.7巨噬样细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达，并提高了培养基中白介素-1β的水平（p<0.05，图6b-f）。

图6 脂多糖（LPS）激活NLRP3炎症小体并促进RAW264.7巨噬样细胞中白介素-1β（IL-1β）的分泌(1 beta)。a 透化小室共培养系统示意图。RAW264.7巨噬样细胞先用脂多糖（LPS）预处理6小时，再与NSC-34细胞共培养24小时。b 展示NLRP3炎症小体组分表达的代表性蛋白质免疫印迹图经或未经脂多糖（LPS）处理的 RAW264.7 巨噬样细胞。c-e 为 NLRP3（c）、半胱天冬酶-1 p20（d）和 IL- (1 beta)（e）蛋白表达的定量分析，以 β-肌动蛋白为参照进行标准化。f 为酶联免疫吸附试验（ELISA）分析细胞培养上清液中 IL- (1 beta) 的含量。数据以平均值±标准差表示（n=3-5) **p<0.01，*** p<0.001，****p<0.0001

脂多糖处理通过破坏沉默信息调节因子1-自噬轴并下调Transwell共培养体系中NSC-34细胞的轴突相关标志物

既往研究已明确指出SIRT1-自噬轴在轴突变性中发挥关键作用[23,24]。本研究通过Transwell共培养体系，检测了NSC-34细胞中SIRT1-自噬相关蛋白及轴突相关蛋白的表达水平。结果显示，对RAW264.7类巨噬细胞进行LPS处理并构建Transwell共培养体系后，NSC-34细胞中SIRT1的表达呈下调趋势。此外，P62表达变化及LC3脂化形式的改变提示细胞内自噬功能受损。同时，NFL、NFM、NFH等轴突相关蛋白的表达水平均显著降低（p<0.05，图7a-h）。

图7 经脂多糖（LPS）处理的RAW264.7巨噬样细胞与NSC-34细胞中SIRT1表达降低、自噬标志物改变以及轴突相关蛋白水平下降相关。a 代表性蛋白质免疫印迹图，显示NSC-34细胞与经LPS处理的RAW264.7巨噬样细胞共培养后轴突相关蛋白（神经丝轻链NFL、神经丝中链NFM、神经丝重链NFH）的表达情况。b-d 对经β-肌动蛋白归一化后的NFL（b）、NFM（c）和NFH（d）蛋白水平进行定量分析。e 代表性蛋白质免疫印迹图，展示SIRT1及自噬相关蛋白的表达情况相关蛋白（P62、脂化型LC3）在NSC-34细胞中的表达。f-h 对SIRT1（f）、P62（g）和脂化型LC3（h）的定量分析，以β-肌动蛋白为参照。数据以平均值±标准差表示（（n=3-5) ** p<0.01、***p< P<0.001、****p<0.0001）

对RAW264.7巨噬样细胞中NLRP3炎症小体的药物抑制作用可保护NSC-34细胞中的SIRT1-自噬轴并恢复轴相关蛋白的表达

为探究脂多糖（LPS）诱导的NLRP3炎症小体激活对NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴及轴突相关蛋白的影响，本研究先将RAW264.7巨噬细胞样细胞用NLRP3抑制剂MCC950预处理2小时，再分别置于正常培养基或含LPS的培养基中培养。随后，为每组RAW264.7巨噬细胞样细胞建立Transwell共培养体系。MCC950预处理可显著降低RAW264.7巨噬细胞样细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）的表达（p<0.05补充图7a-b）。为全面评估轴突完整性，本研究检测了结构型神经丝（NFL、NFM、NFH）以及功能标志物，包括驱动蛋白家族成员5A（KIF5A，一种顺向轴突运输必需的运动蛋白）和突触素（Syn，一种突触小泡标志物）。蛋白质印迹和免疫荧光分析结果显示，MCC950预处理可恢复NSC-34细胞中的SIRT1-自噬轴，并上调轴突相关蛋白的表达（p<0.05，图8a-j）。经LPS处理后，细胞培养基中的乙酰胆碱（Ach）含量Transwell 共培养系统的表达量降低，而 NLRP3 炎症小体抑制可部分逆转这种降低（p<0.05，图8k）。

图8 NLRP3炎性小体的药理抑制逆转NSC-34细胞中SIRT1自噬破坏和轴突相关蛋白下调。与经LPS处理的RAW264.7巨噬样细胞共培养（±MCC950预处理）后，NSC-34细胞中的NFH、KIF5A、Syn、SIRT1以及自噬标志物（P62、脂化型LC3）的表达情况。b 免疫荧光染色检测NSC-34细胞中SIRT1（绿色）和LC3（红色）的表达，细胞核用DAPI复染（蓝色）。(Scale bar =20 mu m) c-j 以β-肌动蛋白（β-actin）为参照的蛋白表达定量分析：SIRT1（c）、P62（d）、脂化型LC3（e）、NFL（f）、NFM（g）、NFH（h）、KIF5A（i）及Syn（j）。k 细胞培养上清液中乙酰胆碱（Ach）的含量。数据以均值±标准差表示（n=3-4)。* p<0.05、**p< P<0.01、***p<0.001、****p<0.0001

白细胞介素-1受体拮抗剂减轻IL-1 beta处理的NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴损伤并恢复轴突相关蛋白表达

为探究1 beta对NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴及轴突相关蛋白的影响，将细胞用不同浓度的(1 beta)（0、10、20、50和100 ng/ml）处理24小时。细胞活力检测结果显示，50 ng/ml浓度下细胞活力显著下降40%（p<0.05，补充图8）。随后，用50 ng/ml的(1 beta) ng/ml的白细胞介素-1β处理NSC-34细胞24小时后，进行指标检测，再向培养基中加入白细胞介素-1受体拮抗剂进行逆转实验。研究发现，NSC-34细胞暴露于(1 beta)会导致SIRT1-自噬轴紊乱及轴突相关蛋白表达降低，而白细胞介素-1受体拮抗剂的处理可缓解这些效应（(p<0.05)，图9a-g）。

图9 白细胞介素-1受体拮抗剂可减弱白细胞介素-1β诱导的NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴及轴突相关蛋白表达的破坏。a 经白细胞介素-1β（50 ng/ml）±白细胞介素-1受体拮抗剂处理的NSC-34细胞中，轴突相关蛋白（神经丝轻链、神经丝中链、神经丝重链）、SIRT1及自噬标志物（P62、脂化型微管相关蛋白1轻链3）的代表性蛋白质免疫印迹图。b-g 以β-肌动蛋白为参照的蛋白表达定量分析：SIRT1（b）、P62（c）、脂化型微管相关蛋白1轻链3（d）、神经丝轻链（e）、神经丝中链（f）以及神经丝重链（g）。数据以平均值±标准差表示

SIRT1 过表达及激动剂可恢复 NSC-34 细胞的自噬并促进轴突相关蛋白表达

为阐明SIRT1在轴突变性中的保护作用，本研究采用慢病毒（LV）感染技术在NSC-34细胞中过表达SIRT1，随后建立与RAW264.7巨噬细胞样细胞的Transwell共培养体系进行进一步分析。通过检测SIRT1的表达水平，验证了慢病毒感染后NSC-34细胞中SIRT1的成功过表达（补充图9a-b）。随后建立共培养体系检测相关指标。结果显示，与LPS+LV-对照组相比，LPS+LV-SIRT1组中NSC-34细胞的SIRT1过表达缓解了自噬缺陷，并阻止了轴突相关蛋白表达的下调（p<0.05，图10a-g）。此外，研究发现用SIRT1特异性激动剂SRT1720预处理NSC-34细胞，可逆转自噬缺陷并增强轴突相关蛋白的表达（p<0.05，图10h-k）。

图10 SIRT1增强对NSC-34细胞自噬缺陷和轴突相关蛋白损失的保护。a-f SIRT1过表达效应：显示SIRT1过表达后SIRT1、自噬标志物和轴突蛋白的Western印迹。LC3、NFL、NFM 和 NFH。h-k SRT1720 处理的效应：h 经 SRT1720 处理后自噬和轴突蛋白的蛋白质印迹结果。i-k P62、LC3 脂化形式及 NFL 的定量分析。所有蛋白水平均以 β-肌动蛋白为参照进行标准化。数据以平均值±标准差表示（n=3-4)、*p<0.05、**p<0.01、***p、<0.001、****p<0.0001）

SIRT1激活剂SRT1720可改善CuSO _{4}诱导的运动轴突损伤和运动功能障碍

为进一步探究 SIRT1 激活是否能在体内改善运动轴突损伤，斑马鱼胚胎在暴露于 CuSO_{4} 前，先用 SIRT1 特异性激活剂 SRT1720（5 微摩尔）预处理 12 小时。共聚焦成像显示，SRT1720 预处理减轻了运动轴突的形态损伤（补充图 10a）。定量分析表明，与仅用 CuSO₄ 的组相比，SRT1720+CuSO₄ 组的运动轴突长度、直径和数量得到恢复（p<0.05，补充图 10b-d）。运动功能分析进一步验证了 SIRT1 激活的保护作用。运动轨迹图和热图显示，SRT1720 预处理改善了 CuSO_{4} 诱导的运动活性下降（补充图 10e-f）。定量数据显示，SRT1720+CuSO₄ 组的总移动距离和平均游泳速度均高于仅用 CuSO₄ 的组(p<0.05，补充图 10g-h）。

氯喹和雷帕霉素处理可发现NSC-34细胞中自噬起始存在缺陷

为区分自噬流受损与自噬起始缺陷，在与脂多糖处理的RAW264.7巨噬样细胞进行Transwell共培养前，用溶酶体抑制剂氯喹（CQ，20微摩尔/升，处理6小时）或mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapa，5微摩尔/升，预处理12小时）处理NSC-34细胞。CQ处理显著提高了对照组和LPS共培养的NSC-34细胞中P62的水平，并增加了LC3的脂化形式，同时进一步降低了神经丝轻链（NFL）的表达（p<0.05，补充图11a-d），证实下游溶酶体降解过程完整，自噬流保持正常。相反，雷帕霉素预处理显著增加了炎症条件下LC3的脂化形式，减少了P62的积累，并部分恢复了神经丝轻链（NFL）、驱动蛋白家族5A（KIF5A）和突触蛋白（Syn）的表达(p<0.05，补充图11e-j）。这些结果表明，暴露于炎症环境的NSC-34细胞中自噬功能障碍源于起始过程受损，而非自噬流存在缺陷，且恢复自噬诱导足以减轻神经元蛋白的丢失。

敲低P53可减轻NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴损伤并恢复轴突相关蛋白表达

近期研究已确定了在炎症环境中调控SIRT1转录的关键转录因子。值得注意的是，E2F1、FOXO3a和c-myc已被证实可上调SIRT1的转录，而P53和HIC1则作为负调控因子发挥作用。为了评估IL-1β对NSC-34细胞中SIRT1 (1 beta)的SIRT1表达的影响，本研究据此检测了相关转录因子的mRNA水平。其中，P53表现出最显著的出现显著变化，表达量增加超过8倍（p< 0.05，补充图12a-e）。在经IL-(1 beta)处理并使用Transwell共培养系统的NSC-34细胞中，也观察到P53蛋白表达上调。IL-1Ra和MCC950可减弱这种上调（p<0.05，图11a-d）。为进一步研究，本研究采用siRNA转染技术下调NSC-34细胞中P53的表达（p<0.05，补充图12f-g），随后分析了Transwell共培养系统建立后SIRT1-自噬轴及轴突相关蛋白的表达情况。结果表明，敲低P53可改善NSC-34细胞中SIRT1-自噬轴的紊乱及轴突相关蛋白表达的降低（p<0.05，图11e-1）。

图11 P53敲低可减轻NSC-34细胞中SIRT1-自噬紊乱及轴突相关蛋白的丢失。a-d P53表达变化：a-b 经IL-1β处理并添加或不添加IL1Ra的NSC-34细胞中P53的蛋白质印迹及定量分析。c-d 与LPS处理的RAW264.7巨噬样细胞共培养并添加或不添加MCC950的NSC-34细胞中P53的蛋白质印迹及定量分析。e-lP53 敲低的影响：e P53 小干扰 RNA 处理后的代表性蛋白质免疫印迹。f-l P53（f）、SIRT1（g）、P62（h）、微管相关蛋白 1 轻链 3 脂化形式（i）、神经丝轻链（j）、神经丝中链（k）和神经丝重链（l）的定量分析。

讨论

在神经退行性疾病的晚期阶段，患者常出现运动功能障碍，而运动功能障碍由运动轴突变性和全身性炎症这两个关键因素加速。以往研究虽已观察到脓毒症等全身性炎症疾病患者脑部存在轴突损伤，但全身性炎症对运动轴突形态的具体影响及其潜在机制仍未被完全阐明。本研究通过暴露于CuSO_{4}建立全身性炎症斑马鱼模型，以深入探究全身性炎症是否会诱导运动轴突发生形态改变，进而引发运动功能障碍。此外，本研究还探讨了相关的潜在分子机制，为理解神经退行性疾病中的运动功能障碍提供了初步视角。

斑马鱼的全身性炎症模型主要通过脂多糖（LPS）注射或 CuSO_{4} 暴露来建立。为避免侵入性操作对巨噬细胞浸润模式产生潜在混杂效应，我们采用了 CuSO_{4} 暴露的方式。尽管 CuSO_{4} 暴露可通过活性氧（ROS）的产生同时诱导炎症反应和氧化应激，使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）进行的挽救实验表明，尽管NAC能有效降低活性氧（ROS）水平，但它并未显著改善运动轴突的形态损伤、巨噬细胞浸润或运动功能障碍。除了炎症反应和氧化应激外，铜离子还可能通过金属离子置换和破坏细胞稳态引发普遍的细胞毒性。然而，流式细胞术分析显示，在10皮摩尔浓度的(CuSO_{4})处理下未出现显著的细胞死亡；而巨噬细胞耗竭和白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）对轴突的显著挽救作用表明，在该模型中，炎症信号通路而非铜离子的直接细胞毒性是运动轴突变性的主要致病驱动因素。这些结果凸显了炎症通路在介导运动轴突形态损伤中的特异性，但氧化应激与炎症之间潜在的协同作用，以及在其他炎症模型中的验证，仍有待进一步研究。

巨噬细胞与神经元损伤之间的关联一直是研究的重点。近期研究表明，PM2.5暴露会增加实验动物脑部的小胶质细胞浸润，异常激活的小胶质细胞会形成慢性神经炎症环境，加剧神经元损伤和突触丢失。本研究通过用CuSO_{4}处理转基因斑马鱼幼虫，成功建立了全身炎症模型。体内共聚焦成像显示，运动轴突部位出现了显著的mpeg1⁺细胞浸润和形态学损伤。这些发现与此前的研究观察一致本研究团队对脓毒症小鼠模型的坐骨神经开展研究后进一步证实了全身性炎症对运动轴突的有害影响。值得注意的是，在全身性炎症状态下，巨噬细胞在运动轴突周围出现明显浸润，这表明其在运动轴突损伤过程中发挥关键作用。部分巨噬细胞耗竭实验进一步表明，巨噬细胞浸润是导致运动轴突形态损伤的关键因素。综上，这些研究结果表明巨噬细胞浸润会导致运动轴突形态损伤，进而引发该模型中观察到的运动功能障碍；然而，仅轴突病理变化对行为学表型的影响程度仍有待直接验证。

近期的斑马鱼研究阐明了巨噬细胞在神经元损伤与再生过程中复杂的双重作用。转基因斑马鱼模型显示，巨噬细胞会快速浸润退化的运动神经元，并动态吞噬神经元碎片；然而，其对神经元结局的功能影响关键取决于激活状态。异常激活的巨噬细胞，尤其是呈现阿米巴样促炎表型（类似M1样状态）的巨噬细胞，会加剧神经元损伤，这在运动轴突损伤的研究中已得到证实。相反，巨噬细胞也可促进神经再生，例如在外周神经损伤模型中，其分泌的Vegf-A能促进神经肌肉接头的再生。这种矛盾的作用可能源于巨噬细胞的异质性和时间动态变化。在在神经元损伤的早期阶段，促炎型M1巨噬细胞主要在损伤部位聚集，通过分泌促炎介质放大炎症级联反应，进而加重神经元损伤。随着疾病进展，巨噬细胞可能转变为M2表型，分泌抗炎因子以促进组织修复和神经再生。本研究发现，浸润运动神经元轴突部位的巨噬细胞主要表现出M1型特征，为全身炎症过程中巨噬细胞的功能提供了新见解。当前对巨噬细胞的认知已超越传统的M1/M2二元分类，研究人员根据其空间分布和独特的基因表达谱已鉴定出多种巨噬细胞亚群。未来研究需进一步探究这些不同的巨噬细胞亚群在神经元损伤中的具体作用及机制。

值得注意的是，斑马鱼幼虫中的mpeg1⁺细胞包括外周巨噬细胞和中枢神经系统（CNS）驻留的小胶质细胞。小胶质细胞在受精后3天（3 dpf）定植脊髓，并通过动态监测过程与运动神经元胞体和近端轴突建立密切接触。在全身性炎症条件下，这些中枢神经系统驻留细胞可自主启动脊髓炎症反应，可能独立于外周巨噬细胞浸润而导致中枢轴突病变。尽管我们的成像涵盖了这两个区域，但分析重点集中于在空间上与远端运动轴突变化存在关联的外周肌节；然而，鉴于mpeg1启动子可同时标记外周巨噬细胞和小胶质细胞，中枢神经系统驻留小胶质细胞与神经元胞体或近端轴突节段相互作用的同时参与过程无法被排除，因此体内细胞类型的归因仍不完整。此外，利用外周巨噬细胞衍生的RAW264.7细胞获得的体外数据表明，白细胞介素-1β等巨噬细胞来源的因子可能会导致轴突蛋白发生改变；但这一发现并不排除小胶质细胞来源的信号在体内发挥平行作用，且本研究无法明确将观察到的效应仅归因于外周巨噬细胞。厘清mpeg1⁺这些不同细胞群在空间和时间上的相对作用——例如通过使用P2ry12或cx3cr1等小胶质细胞特异性启动子，或采用不影响小胶质细胞区室的外周巨噬细胞特异性耗竭策略——仍是未来机制研究的重要目标。

IL-1β作为一种关键的促炎介质，在神经退行性疾病中发挥着核心作用。研究表明，全身性炎症可触发中枢神经系统先天免疫反应的异常激活，导致活化的小胶质细胞释放更多的IL-1β。这一过程会损害中枢轴突和突触的形态与功能。本研究发现，全身性炎症状态下的斑马鱼中，IL-1β的表达水平显著上调。白介素-1受体拮抗剂的给药条件和给药方式可减轻全身性炎症诱导的运动轴突损伤和运动功能障碍。这些发现证实了白介素-1受体拮抗剂在运动轴突损伤和运动功能障碍中的作用，同时也确定了一个潜在的治疗靶点。然而，仅轴突病理改变而非神经肌肉接头或肌肉的同步性变化是否是行为表型的成因，仍有待直接验证。NLRP3是一种主要存在于巨噬细胞中的复杂炎症小体，其在炎症环境中会异常激活，进而释放白介素-1β和白介素-18等促炎细胞因子，这一机制被认为是加速神经肌肉疾病进展的关键。本研究中，在Transwell共培养体系中利用MCC950对NLRP3进行药理学抑制的结果表明，RAW264.7巨噬样细胞中NLRP3炎症小体的激活会促进白介素-1β的释放，并引发运动轴突蛋白表达的后续改变，不过仍需基因验证以排除潜在的脱靶效应。这与我们在斑马鱼模型中的观察结果一致。值得注意的是，本次斑马鱼实验发现，部分巨噬细胞耗竭与白介素-1受体拮抗剂预处理对运动轴突形态和运动功能的保护作用存在差异。部分巨噬细胞耗竭组的保护作用略优于白介素-1受体拮抗剂预处理组，这提示除白介素-1β外，其他炎症介质也可能参与运动轴突的损伤过程。

巨噬细胞作为炎症介质的主要来源，会分泌多种炎症因子包括IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-18（IL-18）介导免疫反应。在脑室周围白质损伤模型中，活化小胶质细胞产生的肿瘤坏死因子-α与少突胶质细胞上的肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）相互作用，诱导少突胶质细胞凋亡，最终导致神经功能障碍。在中枢神经系统内，白介素-6水平升高可激活小胶质细胞和星形胶质细胞，促进额外促炎细胞因子和神经毒性分子的释放，从而加剧神经退行性疾病中的神经炎症。本研究中，在全身性炎症条件下观察到斑马鱼体内肿瘤坏死因子-α和白介素-6的表达水平均升高。此外，在细胞模型中，Transwell共培养系统中的NSC-34细胞与白介素-1β处理组相比，轴突相关蛋白表达下降更为显著，这进一步证实了除白介素-1β之外的其他炎症介质在运动神经元轴突形态损伤中存在潜在作用。

SIRT1是一种关键的脱乙酰基酶，通过对自噬相关基因进行脱乙酰化来促进自噬激活，从而在神经保护中发挥重要作用。SIRT1-自噬轴的轴突保护作用已在多种疾病模型中得到验证。SIRT1可能通过促进中枢神经系统的线粒体自噬来延缓阿尔茨海默病（AD）患者的疾病进展。SRT2104是一种特异性SIRT1激动剂，它能增强帕金森病（PD）模型小鼠多巴胺能神经元的自噬，从而减轻轴突变性。近期关于神经保护剂也证实，SIRT1-自噬轴是其治疗作用的关键靶点。本研究中，研究人员观察到Transwell共培养和IL-(1 beta)处理均会损伤NSC-34细胞中的SIRT1-自噬轴，而MCC950和IL-1Ra可改善这一现象。雷帕霉素预处理和氯喹通量分析实验进一步证明，暴露于炎症环境的NSC-34细胞出现的自噬功能障碍源于自噬起始受损，而非通量异常，且恢复自噬诱导可部分保护轴突相关蛋白。在体内实验中，SRT1720预处理也能改善暴露于(CuSO_{4})的斑马鱼的运动轴突损伤。这表明系统性炎症条件下巨噬细胞分泌的IL-(1 beta)可能与运动轴突的形态损伤相关，其机制或许是通过破坏SIRT1-自噬轴实现的。

为进一步探究此背景下 SIRT1 的潜在上游调控因子，本研究检测了炎症环境中可能影响 SIRT1 转录的五种关键转录因子的表达水平。结果显示，对 SIRT1 转录起负调控作用的 P53 和 HIC1 表达水平升高，而正向调控因子 E2F1 和 FOXO3a 则呈现不同程度的降低。这些发现为 P53 在此背景下可能发挥的作用提供了初步证据；不过，这些转录因子的功能验证仍需进一步研究。除转录因子外，SIRT1 的表达还受 DNA 甲基化和转录后调控的影响。相关研究研究表明，妊娠糖尿病大鼠胚胎中SIRT1水平降低会影响胚胎发育。此外，使用DNA甲基化抑制剂处理可提高胚胎中SIRT1蛋白的表达，从而减轻发育异常。在转录后调控方面，SIRT1-AS-lncRNA可直接与SIRT1的3'非编码区（3'UTR）结合，促进其转录后翻译。人类抗原R（HuR）RNA结合蛋白通过其三个RNA识别基序调控SIRT1 mRNA的稳定性和翻译[61]。因此，有必要进一步研究以确定在全身炎症条件下，巨噬细胞是否通过其他途径影响运动神经元中SIRT1的表达。

P53 是神经退行性疾病的潜在治疗靶点，它在神经元中维持着对神经干细胞自我更新和分化至关重要的关键表达平衡。研究表明，P53 表达上调会促进阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病中的神经元死亡，而干预 P53 诱导的凋亡信号通路可恢复阿尔茨海默病患者的神经元活力和认知功能。在帕金森病（PD）患者的病变组织中也观察到 P53 表达增加，其与黑质中多巴胺能神经元的变性死亡密切相关。在研究巨噬细胞分泌的白细胞介素-1β（IL-1β）与运动神经元中 SIRT1 表达的潜在关联时，发现 IL-1β 处理后 NSC-34 细胞中的 P53 表达显著升高。在生理条件下，SIRT1通过对赖氨酸382位点的P53进行去乙酰化修饰，维持P53的表达平衡，进而调控其转录活性。然而，全身性炎症似乎与这种平衡的破坏相关。在发生炎症的运动神经元中，P53表达水平升高的同时，SIRT1含量也随之降低，这表明这两种分子之间存在相关关系，不过二者关联背后的确切转录机制仍有待阐明。

既往研究也报道了IL-1β与P53之间存在关联。(1 beta)与P53也存在相关关系。活化的小胶质细胞来源的IL-(1 beta)可通过上调神经祖细胞中P53的表达诱导细胞周期阻滞和凋亡。IL-1β的IL-(1 beta)与细胞膜上的IL-1R1结合，可激活多种与神经元损伤相关的信号通路，包括JNK、NF-κB和GSK3β。尽管将这些信号通路与P53表达调控联系起来的直接证据仍不明确，但研究表明，NF-κB可促进P53介导的凋亡，而JNK和GSK3β信号通路均能调节P53的活性。本研究中，通过表达变化和药物干预发现运动神经元中出现IL-(1 beta)水平升高与P53上调同时发生，这为P53在该过程中可能发挥的作用提供了间接支持。靶向P53诱导的损伤相关信号通路，或可恢复神经元活力并延缓疾病进展。

我们结合斑马鱼和小鼠细胞系的研究方法具备互补优势：可在体内实时观察细胞相互作用，并在体外进行详细的分子解析。尽管现有文献已有研究报道核心炎症和自噬通路在脊椎动物中具有保守性，因此在将小鼠细胞系中提出的SIRT1-自噬-P53工作模型外推至斑马鱼运动神经元和人类疾病时需谨慎，且仍需在哺乳动物模型和慢性炎症环境中进行验证。然而，本研究存在若干局限性需予以说明。首先，观察仅局限于单个时间点；多阶段的动态分析将能更好地阐明疾病进展特征。其次，尽管P53敲低可恢复SIRT1水平，但P53与SIRT1启动子结合的直接证据仍需通过染色质免疫沉淀（ChIP）或报告基因实验进行验证。第三，急性炎症模型以及体内药理学工具的应用可能无法完全复现人类神经退行性疾病的慢性、多因素病理特征；未来研究需结合基因编辑技术、慢性模型和人类生物样本，以进一步验证因果推断和转化价值。最后，由于未直接评估神经肌肉接头（NMJ）的完整性和骨骼肌组织学状态，本研究中观察到的运动功能缺陷被解读为与运动轴突形态损伤相关，而非仅由其导致；未来纳入此类评估的研究将有助于明确轴突、突触和肌肉各部分的相对贡献。

结论

本研究通过暴露CuSO_{4}构建全身性炎症斑马鱼模型，探究全身性状态下运动轴突的形态损伤及其潜在分子机制炎症。研究结果表明，在全身性炎症状态下，巨噬细胞会大量浸润运动轴突外周并转变为阿米巴样形态。巨噬细胞会分泌包括白细胞介素-<b0>1 beta</b0>在内的炎症介质；白细胞介素-<b1>1 beta</b1>水平升高与神经元P53表达增加、SIRT1水平降低以及自噬功能受损相伴，同时伴随运动轴突形态损伤和运动功能障碍。基于现有关联研究和药理学证据，我们提出了一个工作模型，其中巨噬细胞来源的白细胞介素-1β、P53上调以及SIRT1-自噬受损与运动轴突变性存在功能关联。未来研究应阐明不同巨噬细胞亚群在运动轴突损伤中的作用及机制，明确更广泛的细胞因子网络对神经元功能障碍的影响，并筛选以SIRT1-自噬通路和P53信号通路为靶点的新型神经保护剂（图12）。

图12 本研究的机制图。左图：在全身性炎症条件下，浸润的巨噬细胞向支配骨骼肌的运动轴突发生趋化运动。右图：在巨噬细胞中，炎症激活触发NLRP3炎症小体组装，导致Caspase-1激活，进而使IL- 1 beta发生加工并释放，图中以其作为代表性炎症介质。分泌的IL- 1 beta使运动神经元中P53表达升高；P53增加伴随SIRT1水平降低。SIRT1减少与自噬受损及轴突相关蛋白（NFL、NFM、NFH）表达减少同时发生。IL- 1 beta、P53与SIRT1之间的虚线箭头表明这些关系具有关联性，但尚未通过启动子结合或通路特异性实验直接证实。

材料与方法

斑马鱼的饲养与管理

野生型（AB）斑马鱼以及转基因品系Tg(mnx1:eGFP)和Tg(mpeg1:mCherry)均购自中国武汉国家斑马鱼资源中心，随后饲养于西南医科大学斑马鱼技术平台。实验鱼饲养在28℃的可控环境中，光暗周期为14:10。通过三组成年繁殖亲鱼杂交获得胚胎，胚胎在28℃恒温条件下培养于E3培养基中，该培养基含5毫摩尔氯化钠、0.17毫摩尔氯化钾、0.33毫摩尔氯化钙、0.33毫摩尔硫酸镁以及0.00001%亚甲基蓝。所有涉及斑马鱼的实验操作均符合西南医科大学实验动物伦理委员会的相关规定（许可证号：20230812-007）。临床试验编号：不适用。

硫酸铜暴露

受精后五天（dpf）的斑马鱼幼鱼被随机分配至6孔板中，每孔30条。这些幼鱼分别接受赋形剂（对照组）或不同浓度（5、10、20或40微摩尔）的硫酸铜（美国Sigma-Aldrich公司）处理。暴露3天后，收集幼鱼并用胚胎培养液冲洗三次，以进行后续分析。

活性氧（ROS）检测

利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA；美国MCE公司）对细胞内活性氧（ROS）水平进行定量分析。经硫酸铜（CuSO₄）处理后，将幼虫在室温黑暗条件下与10微摩尔浓度的DCFH-DA孵育1小时。用培养水冲洗后，通过奥林巴斯荧光显微镜进行荧光成像观察。

巨噬细胞分布与运动轴突形态分析

巨噬细胞的定量分析和形态学评估均按照既定方案进行。通过将Tg(mnx1:eGFP)品系与Tg(mpeg1:mCherry)品系杂交，获得双转基因斑马鱼Tg(mnx1:eGFP;mpeg1:mCherry)。在受精后5天，筛选出形态正常且发育阶段一致的胚胎，随机分配至各处理组。在8 dpf完成3天硫酸铜暴露处理后，用甲磺酸三卡因麻醉幼虫，并将其包埋于低熔点琼脂糖中。使用尼康激光扫描仪拍摄Z-stack图像使用20倍物镜的扫描共聚焦显微镜，聚焦于8-12体节。使用Imaris软件进行三维重建，最大强度投影以TIFF文件格式导出。利用Imaris中的距离变换函数测量每个mpeg1⁺巨噬细胞质心与最近运动轴突表面之间的最短三维欧氏距离，其中运动轴突表面和巨噬细胞质心分别通过表面模块和斑点模块进行渲染，每组至少分析100个mpeg1⁺细胞。为确保分析无偏倚，所有样本由不参与图像采集或定量的独立研究人员进行编码。所有图像分析均采用盲法，通过样本编码在ImageJ中完成，仅在数据收集完成后才揭示处理组信息。完成标尺校准后，测量运动轴突数量、延伸长度（从脊髓至腹侧肌节）和直径。对每条幼鱼，取8-12体节内5根运动轴突的测量值取平均，得到单个幼鱼的数值，该数值作为所有统计分析的生物学重复值；每个处理组包含15-18条幼鱼，数据以平均值±标准差表示。巨噬细胞定量以标准化感兴趣区域内mCherry⁺细胞的数量进行统计。

巨噬细胞形态学评估

使用 ImageJ 软件从共聚焦显微镜图像中评估巨噬细胞形态。根据在 mpeg1:mCherry⁺ 细胞中观察到的细胞形态，巨噬细胞根据其形态特征： 变形虫样形态：细胞体紧凑呈球形，细胞突起极少。该形态与促炎激活相关，麦克沃特等人的研究表明，这种形态的巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平显著升高，精氨酸酶-1表达水平降低，这与M1极化特征一致； 中间形态：细胞呈椭圆形至略细长，突起延伸程度适中，代表一种过渡状态； 分支形态：细胞体延伸，具有明显的分支状细胞突起。该形态与促修复表型相关，研究表明细长形态的巨噬细胞精氨酸酶-1、CD206和YM-1表达水平更高，符合M2极化特征[30]。

运动行为分析

利用DanioVision行为追踪系统评估运动活性。幼鱼在暴露于硫酸铜之前被随机分配至处理组，测试前出现明显形态异常或自发死亡的幼鱼被排除在外。每个实验组共包含36条幼鱼：在3次独立试验（3次生物学重复）中，每次试验使用12条幼鱼（12次技术重复）。暴露于硫酸铜后，将单条幼鱼放入48孔板中，每孔含有1毫升胚胎培养基。在28℃下适应10分钟后，在明暗交替条件下（10分钟黑暗/10分钟光照/10分钟黑暗/10分钟光照/10分钟黑暗；总计50分钟）记录运动活性。使用EthoVision XT进行行为记录及后续数据分析由对分组分配不知情的研究人员执行。

巨噬细胞耗竭

为实现巨噬细胞的选择性耗竭，对3天受精后（3 dpf）的Tg(mnx1:eGFP;mpeg1:mCherry)幼虫进行卵黄囊注射，分别注射2纳升氯膦酸盐脂质体（Lipo-clodronate；上海源叶生物科技有限公司，中国）或对照磷酸盐缓冲液脂质体（Lipo-PBS；上海源叶生物科技有限公司，中国）。注射后，将幼虫在胚胎培养基中孵育48小时，随后使用奥林巴斯荧光显微镜进行成像，对运动轴突高密度的躯干中部区域的巨噬细胞密度进行定量评估和统计学分析。后续利用ImageJ软件对巨噬细胞耗竭效率进行定量检测。

细胞培养

RAW264.7 巨噬细胞样细胞系和 NSC-34 运动神经元细胞系购自中国湖南丰汇生物科技有限公司。这些细胞在添加了 10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素和链霉素（中国碧云天公司）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，中国赛默飞世尔科技公司）中，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养。

条件培养基的制备与细胞活力检测

将RAW264.7巨噬细胞样细胞接种至6孔板中，培养至70%–80%汇合度。随后，用添加了脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich公司，美国）的标准培养基处理细胞，LPS浓度设置为100、200、500、1000和2000纳克/毫升，处理6小时，之后将细胞置于新鲜培养基中孵育12小时。随后收集细胞培养上清液收集后以5000转/分钟离心10分钟以去除所有沉淀物，得到条件培养基。同时，将NSC-34细胞在96孔板中培养至70%至80%汇合度，随后随机分为六组：对照组、100纳克/毫升脂多糖组、200纳克/毫升脂多糖组、500纳克/毫升脂多糖组、1000纳克/毫升脂多糖组和2000纳克/毫升脂多糖组。每组均加入相应的条件培养基并孵育24小时。之后，向每孔加入10微升CCK-8试剂（中国TargetMol公司），避光孵育30分钟。使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。选择使神经元活力降低50%的脂多糖浓度，用于构建后续的Transwell共培养体系。

Transwell共培养体系的建立

将RAW264.7巨噬细胞样细胞接种于6孔板中，采用此前确定的最佳脂多糖（LPS）浓度处理6小时后，收集细胞进行指标检测。在Transwell小室系统中，将RAW264.7巨噬细胞样细胞接种于上室，NSC-34细胞接种于下室，实现两种细胞的独立培养。RAW264.7巨噬细胞样细胞经LPS处理6小时后，将上下两层细胞合并共培养24小时。随后，收集下室中的NSC-34细胞进行后续分析。为抑制巨噬细胞的NLRP3，在LPS处理前，用MCC950（10微摩尔；中国TargetMol公司）预处理RAW264.7巨噬细胞样细胞2小时，再进行后续实验步骤。

经IL-1β处理的运动神经元

根据制造商的说明书，采用CCK-8试剂盒测定法确定了IL- (1 beta)的最佳浓度。将NSC-34细胞接种于96孔板中，用不同浓度的IL- (1 beta)（0、10、20、50和100纳克/毫升；美国TargetMol公司）处理24小时。随后，向每孔加入10微升CCK-8试剂，将培养板置于室温避光条件下孵育30分钟。按照制造商的操作流程，使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。为抑制IL-1β的作用，在IL-1β处理期间向NSC-34细胞中加入IL-1受体拮抗剂（50纳克/毫升；美国TargetMol公司），24小时后对细胞进行分析检测。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

将RAW264.7细胞培养的上清液进行离心处理，随后收集并用于酶联免疫吸附试验（ELISA）分析。利用小鼠特异性ELISA试剂盒（中国Mlbio公司）对促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）进行定量检测。按照制造商的操作流程，使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。

慢病毒感染与小干扰RNA转染

将SIRT1质粒插入慢病毒（LV）载体中，随后在NSC-34细胞中进行过表达，同时使用含短发夹RNA（shRNA）的空质粒作为阴性对照。感染实验按照制造商的方案（中国LeapWalBio公司）进行。感染48小时后，将培养基替换为含2微克/毫升嘌呤霉素（中国YEASEN公司）的新鲜细胞培养基。再培养3天后，获得稳定感染的选取细胞用于后续实验。在小干扰RNA（siRNA）介导的基因敲低实验中，使用转染试剂将靶向P53的siRNA转染至NSC-34细胞中（序列见补充表1；购自中国Obiosh公司）。转染48小时后进行蛋白质印迹法（Western blot）分析，以评估基因敲低效率。成功转染的NSC-34细胞随后被用于后续实验。

实时定量聚合酶链式反应（Rt-qPCR）

使用TRIzol试剂（中国Vazyme公司）从斑马鱼和细胞样本中提取总RNA。随后，使用第一链cDNA合成试剂盒（中国Seq-hunt公司）进行逆转录反应。采用SYBR qPCR预混液（中国Seq-hunt公司）进行实时荧光定量PCR（Rt-qPCR）分析。补充表1列出了用于斑马鱼基因EF1a、Tnf-α、IL-1β、IL-6以及小鼠基因Beta-actin、P53、E2F1、c-myc、HIC1和FOXO3a的引物。每个靶基因的平均循环阈值（Ct）均通过三次重复实验测定，并以持家基因的平均Ct值进行标准化处理。

乙酰胆碱（Ach）含量检测

每个实验组取100条斑马鱼的样本，在冰浴条件下于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中匀浆。匀浆液在4°C下以5000转/分钟离心15分钟，得到上清液，随后对该上清液进行乙酰胆碱含量分析。药物处理后收集细胞培养上清液（500微升）处理后离心以去除细胞碎片，并使用 Njjcbio 试剂盒（中国）分析乙酰胆碱含量。

蛋白质印迹分析

取30微克变性的细胞蛋白匀浆样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳电压为100伏，电泳时长1.5小时。随后，以220毫安的恒定电流将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，转移时长根据蛋白分子量调整。膜片在室温下用含5%脱脂奶的TBST溶液封闭2小时，再于4℃下与一抗孵育过夜。所用一抗包括：NLRP3（小鼠单克隆抗体，瑞士Adipogen公司，货号AG-20B-0014，稀释比例1:2000）、Caspase-1（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab179515，稀释比例1:1000）、IL-1β（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab234437，稀释比例1:1000）、NFL（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab223343，稀释比例1:1000）、NFM（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab254348，稀释比例1:1000）、P62（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab109012，稀释比例1:10000）、LC3（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab192890，稀释比例1:1000）、KIF5A（兔多克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab5628，稀释比例1:1000）、Syn（兔单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab32127，稀释比例1:1000）、β-肌动蛋白（小鼠单克隆抗体，中国Proteintech公司，货号66009-1，稀释比例1:5000）、NFH（兔单克隆抗体，中国华大HUABIO公司，货号ET1702-72，稀释比例1:1000）、P53（小鼠单克隆抗体，中国华大HUABIO公司，货号EM1701-91，稀释比例1:1000），以及SIRT1（兔单克隆抗体，CST公司，美国，货号9475，稀释比例1:1000）。随后，将样品与HRP标记的二抗（山羊抗小鼠或抗兔，Proteintech公司，中国，货号RGAR001或RGAM001，稀释比例1:5000）在室温下孵育1小时。此外，使用增强型化学发光（ECL）底物（Biosharp公司，中国）检测免疫印迹信号。为了对同一张膜上的上样对照进行标准化，随后使用剥离缓冲液（Beyotime公司，中国）对膜进行剥离，并用抗β-肌动蛋白抗体重新孵育。使用ImageJ软件对条带强度进行定量分析。

免疫荧光

将多聚赖氨酸包被的细胞爬片放入6孔板中，随后按照先前描述的方法接种NSC-34细胞并进行Transwell共培养。共培养结束后，将爬片在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟，用PBST洗涤，再用0.05% Triton X-100透化处理20分钟。接着用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭爬片1小时。加入一抗（包括SIRT1，鼠源单克隆抗体，中国华大生物，货号M1506-3，稀释比例1:200；以及LC3，兔源单克隆抗体，英国Abcam公司，货号ab192890，稀释比例1:500），于4℃孵育过夜。次日，用PBST洗涤爬片三次，再加入相应的Alexa-Fluor荧光标记二抗（中国Proteintech公司，货号RGAM002或RGAR004，稀释比例1:1000），在室温下孵育1小时。最后，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片液对爬片进行封片，随后进行成像使用奥林巴斯荧光显微镜进行拍摄。

流式细胞术

通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术评估细胞死亡。将暴露于10 M (CuSO_{4}) 0-72小时的5天龄斑马鱼幼体解离为单细胞悬液，经40微米滤膜过滤后，用1微克/毫升的PI染色15分钟。在BD FACSCanto II流式细胞仪上进行分析，每个样本收集至少10000个(≥10,000)事件。使用FlowJo软件对PI阳性细胞进行定量分析。

统计分析

本研究采用GraphPad Prism 9.5版（美国GraphPad软件公司）进行统计分析，结果以均数±标准差（(overline{x} pm s)）表示。两组间差异采用t检验进行评估，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。在将多个实验组与单个对照组比较时，采用Dunnett多重比较检验以控制家族式错误率；对所有组进行两两比较时，采用Tukey多重比较检验。P值＜0.05被认为具有统计学意义。