题目：Analysis of virulence of the emerging opportunistic human pathogen Achromobacter in a zebrafish embryo model

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12866-026-05189-z

期刊：BMC Microbiology Article in Press

摘要

背景

无色杆菌属是囊性纤维化（CF）患者和免疫功能低下人群中一种新兴的、值得关注的机会致病菌。这些细菌以其固有的抗生素耐药性和逃避免疫宿主防御的能力而闻名。要开发有效的干预策略，就需要更全面地了解无色杆菌属与宿主先天免疫系统之间的直接相互作用。本研究利用斑马鱼胚胎探究了一组临床无色杆菌属分离株的致病潜力，并分析了它们与宿主先天免疫系统的相互作用。

结果

本研究分析了7株此前已被证实能在细胞培养中引发不同程度细胞毒性、在大蜡螟幼虫及小鼠体内分别表现出不同毒力和炎症水平的铜绿假单胞菌（CF分离株），并在斑马鱼胚胎模型中展开了相关研究。其中1株菌株在静脉注射后4天内，导致斑马鱼胚胎出现显著的宿主死亡（死亡率达87.5%），该死亡现象与细菌载量大幅上升以及促炎细胞因子基因表达增强密切相关。另有3株菌株为中度毒力菌株，引发8.4%至12.5%的宿主死亡，存活的胚胎在感染后4天内细菌载量保持稳定，表明细菌在宿主体内持续存在。剩余3株分离株同样能在宿主体内存留，但引发的死亡率低于3%，且27%的感染胚胎成功清除了细菌，这与感染后1天促炎基因表达被微弱诱导相关。为阐明巨噬细胞的作用，研究人员对感染毒力最弱菌株（死亡率为0%）的巨噬细胞缺陷型胚胎与巨噬细胞正常型胚胎进行了对比。结果显示，巨噬细胞的缺失导致细菌载量大幅上升，并在4天内造成34%的胚胎死亡，这证明巨噬细胞在控制细菌繁殖、降低感染严重程度方面发挥着关键作用。不过，实时分析表明，部分分离株能够存活并在巨噬细胞中复制，从而导致持续性感染或促炎性感染。这些研究结果揭示了巨噬细胞在感染过程中既对宿主有害、又对宿主有益的双重作用。

结论

斑马鱼胚胎是研究持久感染和急性感染过程中无色杆菌与宿主相互作用的宝贵模型，尤其适用于探究免疫细胞的作用，并实时深入了解宿主与病原体的相互作用。该斑马鱼感染模型将成为研发针对无色杆菌属感染的抗菌策略的有用工具。

关键词：无色杆菌属，细菌毒力，斑马鱼模型，持续性，致病性，囊性纤维化

背景

无色杆菌属细菌广泛存在于各类自然环境中。它们是人类新兴的机会致病菌，已知会引发医院获得性感染，包括肺炎、菌血症和尿路感染，尤其在免疫功能低下的人群中更为常见。值得注意的是，囊性纤维化（CF）患者易感染无色杆菌属细菌，这类细菌可引发严重的慢性感染，进而导致肺部炎症、急性加重发作频率增加以及呼吸功能下降。囊性纤维化的特征是肺部处于慢性炎症状态，中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞在机体防御和组织损伤过程中均发挥核心作用。尽管中性粒细胞被视为主要的免疫效应细胞，但研究表明巨噬细胞在调节免疫反应、启动病原体吞噬以及分泌包括白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在内的促炎细胞因子方面具有重要作用。囊性纤维化患者感染无色杆菌属细菌会进一步加重这种炎症状态。无色杆菌属细菌能够建立持续性感染，原因在于它们可通过形成生物膜逃避宿主免疫防御，且具有固有抗生素耐药性，这使得治疗难度进一步加大。此外，研究证实无色杆菌属细菌能在培养的细胞中存活，包括人类巨噬细胞样THP-1细胞，这表明巨噬细胞可能为细菌提供了细胞内微环境，助力其逃避抗菌治疗。然而，细菌的细胞内存活对体内感染的影响尚未有相关研究阐述。

已在无色杆菌属中鉴定出多种导致疾病严重程度的毒力因子。这些因子包括大肠菌素V、蛋白酶、Vi荚膜多糖和O抗原等细胞表面因子、抗σ-E因子，以及3型和6型分泌系统。研究表明，不同的无色杆菌属菌株可通过触发焦亡引发不同程度的3型分泌系统（T3SS）依赖性宿主细胞死亡，使细菌在膜结合液泡中完成初始胞内存活后从感染细胞中逃逸。在木糖氧化无色杆菌中，T3SS效应蛋白AxoU和ArtARTX黏附素被鉴定为细胞毒性所必需的因子。然而，这些细菌因子并非细胞毒性的唯一决定因素，因为缺乏AxoU和ArtA RTX黏附素的不溶性无色杆菌同样具有细胞毒性，这表明其他细菌因子也参与了这一过程。此外，对一株低细胞毒性的木糖氧化无色杆菌菌株的分析发现，该细菌以不依赖T3SS的方式在LAMP1阳性吞噬体中存活至少24小时。但在小鼠和大蜡螟幼虫的急性感染模型中，功能性T3SS是引发炎症所必需的。

目前关于无色杆菌属感染引发的宿主炎症反应的研究尚不多见，但在体外细胞感染实验中，CXCL-8 等促炎介质已被检测到释放[8]。CXCL-8 在中性粒细胞募集过程中发挥关键作用，且在囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）敲除小鼠体内，也观察到了 CXCL-8 介导的针对无色杆菌属感染的炎症反应。Elias-Oliveira 及其团队还报道称，小鼠接种木糖氧化无色杆菌后出现强烈的肺部炎症反应，进而引发致命感染；这一过程依赖于 CD14 的激活，而 CD14 激活源于对细菌脂多糖的识别。为研发有效的治疗方法，还需开展更多研究，以深入阐释无色杆菌属与宿主先天免疫系统之间的直接相互作用，并加深我们对不同无色杆菌物种致病性及各分离菌株毒力的认知。

斑马鱼胚胎是研究宿主-病原体相互作用的强大模型，这得益于其体外发育、光学透明性、遗传可操作性以及先天免疫系统与人类的高度相似性。特别是斑马鱼胚胎的光学透明性支持高分辨率无创活体成像。这使得研究人员能够利用携带细胞特异性荧光报告蛋白的转基因斑马鱼，实时观察病原体与宿主免疫细胞的体内相互作用，并追踪巨噬细胞内细菌的胞内命运。凭借这些独特优势，研究人员已建立感染模型，以研究多种细菌、病毒和寄生虫物种的致病性，其中包括铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌等重要的囊性纤维化病原体。

本研究旨在建立并验证斑马鱼胚胎感染模型，以用于评估无色杆菌的致病性及其与先天免疫细胞的实时相互作用，并明确巨噬细胞在感染过程中更确切的作用。此前，我们已分析了多株囊性纤维化分离株在大蜡螟幼虫中的毒力、在野生型（WT）及囊性纤维化（F508del）人支气管上皮细胞中的细胞毒性，以及在野生型和囊性纤维化跨膜传导调节因子敲除小鼠中的肺部炎症反应。本研究对这些相同的临床分离株在斑马鱼胚胎中的毒力展开了探究，发现其感染表型涵盖急性快速致死型与持续性非致死型，与已发表的这些菌株在大蜡螟幼虫和小鼠体内的感染结果一致。此外，我们证实了巨噬细胞在抑制感染的同时，还能为细菌提供细胞内生存微环境，发挥双重作用。斑马鱼胚胎为研究无色杆菌属的致病性提供了极具价值的模型，可用于探究先天免疫系统层面的宿主-病原体相互作用、分析感染过程中巨噬细胞胞内阶段的重要性、确定新型治疗干预措施的研发靶点，以及评估抗菌治疗的效果。

结果

无色杆菌属菌株在斑马鱼胚胎中的毒力

我们分析了7株无色杆菌属临床分离株的毒力，包括4株木糖氧化无色杆菌、1株农生无色杆菌、1株不溶无色杆菌，以及1株具有新基因型（NG）的无色杆菌菌株，该菌株与任何公开可用的序列在系统发育上均无关联。此前研究已证实，这些分离株在人支气管上皮细胞中具有不同水平的细胞毒性，在体外具备生物膜形成能力，且在大蜡螟幼虫和小鼠体内表现出不同的毒力（详见表2a-d）。

表2. 七株无色杆菌分离株在以往研究中（大蜡螟和小鼠）以及本研究中（斑马鱼胚胎）形成生物膜的能力、细胞毒性和毒力的概述

斑马鱼胚胎AB被静脉注射7株无色杆菌属临床分离株中每株平均500个CFU，对其存活情况进行了4天监测（图1A、B，表2e）。7-2号分离株在斑马鱼胚胎中引发了快速致死性感染，4天内杀死了87.5%的胚胎，这与大蜡螟和小鼠体内的高毒力特征相符。感染8-2号分离株后，17-1和23-1菌株在斑马鱼胚胎中第4天的致死率介于8.4%至12.5%之间。其中两株菌株（8-2和23-1）在大蜡螟和小鼠模型中表现出高毒力，而17-1菌株在这些模型中的毒力较低。其余三株菌株（12-2、16-1和20-1）此前被归类为在大蜡螟和小鼠中无毒性，在斑马鱼胚胎中诱导的胚胎致死率低于3%（图1B）。后三株毒力最低的菌株的存活概率与8-2菌株（分别对应(P=0.0316)、(P=0.0020)和(P=0,0292)）和17-1菌株（分别对应(P=0.0309)、(P=0.0020)和(P=0.0284)）存在显著差异，不过23-1菌株（致死率8.4%）与这5株菌株中的任意一株相比均未发现显著差异。

在每株菌的1、2和3日龄感染后（dpi），分别对5个单独的胚胎进行细菌载量测定。7-2菌株感染在1日龄感染后（dpi）导致细菌载量显著增加1.46倍（图1C），这与该菌株引发的高死亡率相符（图1A）。由于感染7-2菌株的胚胎快速死亡，仅对少数存活的胚胎进行了2日龄和3日龄感染后（dpi）的菌落形成单位（CFU）计数。这些存活胚胎在2日龄和3日龄感染后（dpi）的高菌落形成单位（CFU）计数显示，所有感染胚胎均出现不受控制的细菌增殖，这与该菌株诱导的高死亡率一致。8-2、17-1和23-1菌株导致宿主死亡率在8.4%至12.5%之间，在1日龄感染后（dpi），大多数感染胚胎的细菌数量显著减少（平均log2倍数变化分别为1.48、1.5和1.96），但细菌载量随时间推移保持稳定，直至3日龄感染后（dpi）（平均值分别为2.23、2.60和1.90），有时细菌数量会达到较高水平（图1C）。接种物（每个菌株每次实验对应 (T=0)、(n=3)）的数量如下：7-2 菌株：550 菌落形成单位；8-2 菌株：708 菌落形成单位；12-2 菌株：483 菌落形成单位；16-1 菌株：275 菌落形成单位；17-1 菌株：781 菌落形成单位；20-1 菌株：504 菌落形成单位；23-1 菌株：339 菌落形成单位。重要的是，几乎所有胚胎（注射 23-1 菌株的 15 个胚胎中仅有 2 个例外）在感染后第 3 天仍存活有细菌。相比之下，注射 12-2、16-1 和 20-1 菌株的胚胎死亡率最低（低于 3%），与其他菌株相比，每个胚胎中存活的细菌数量更少（感染后第 3 天平均值分别为 0.8093、1.227 和 1.274，对应 184eac69-e744-4a20-a864-a0a92642ec69、(log _{2})），约 26% 的胚胎能够完全清除细菌。总体而言，结合存活率和随时间变化的细菌载量数据，7-2 菌株毒性极强，8-2、17-1 和 23-1 菌株毒性中等，而 12-2、16-1 和 20-1 菌株毒性降低，但仍能在宿主体内持续存在。

图1. 无色杆菌在斑马鱼胚胎中的毒力。(A,B) 静脉注射7株无色杆菌分离株后胚胎的存活百分比（(=72)：每个菌株每次实验24个胚胎）。图B为图A中标示的80%-100%存活区间的适配刻度。采用对数秩（Mantel-Cox）检验进行统计分析：(^{* *}=p ≤0.01)；(* * * *=p ≤0.0001) (C) 细菌载量。每个数据点代表单个胚胎（每个菌株每次实验在1、2和3dpi时各(n=5)个）。未展示死亡胚胎。黑色水平条表示平均值。采用非参数Kruskal-Wallis检验结合Dunn事后检验，比较第0天与第1天、第1天与第3天的差异，(*=p ≤0.05)；(* *=≤0.01)；(* * *=p ≤0.001)；(* * * *=p ≤0.0001) (A-C) 平均值

实时成像进一步揭示了感染的本质。在尾静脉注射约200个菌落形成单位（CFU）后（图2A），在感染后1天（1 dpi），高毒力菌株7-2在不同解剖部位（包括血管系统、后脑、中枢神经系统和尾造血组织）被检测到大量细菌（图2 B-D），这与其高菌落形成单位计数和高死亡率相符。相比之下，菌株16-1在感染后1至3天（1-3 dpi）仅检测到少量细菌（图2E），这与其毒力减弱相符。细菌与巨噬细胞相关联（图2E-插图），下文将对此进行更详细的描述。三株中度毒力菌株诱导的局部炎症部位持续至感染后3天（图3），而部分胚胎中检测到大量细菌，表现为菌血症（以菌株23-1为例，图3，感染后2天），这与注射这些菌株的胚胎在后续时间点偶发死亡的情况一致。

图2. 高毒力（7-2）和低毒力（16-1）菌株感染胚胎的成像结果。在巨噬细胞中表达绿色荧光蛋白（绿色通道）的Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22胚胎，被注射约200个菌落形成单位的表达DsRed的7-2和16-1分离株（红色通道），并通过荧光显微镜进行成像。（A）尾静脉注射后立即拍摄的胚胎卵黄成像图。（B-D）注射7-2菌株的三枚胚胎在感染后1天（dpi）的成像图，显示血管系统、后脑脑室（hbv）、中枢神经系统（cns）和尾部造血组织（CHT）中存在大量细菌。红色通道（C）以及红色与绿色通道的叠加图（B、D）。（B）中的插图突出显示了与巨噬细胞相关的少量细菌。（E、F）分别在感染后1天和3天对注射16-1菌株的胚胎尾部区域进行成像的代表性图片，显示细菌与巨噬细胞的关联（插图）。红色与绿色通道的叠加图。比例尺：50微米。胚胎示意图标注了成像区域。

图3. 中度毒力菌株23-1会引发持续性感染并偶尔导致菌血症。在巨噬细胞中表达GFP（绿色通道）的Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22胚胎（受精后30小时）分别注射约400个菌落形成单位（CFU）表达DSRed的菌株23-1（红色通道），并在感染后1、2和3天通过荧光显微镜成像。

宿主对感染的免疫反应

为了更深入地了解宿主对无色杆菌属的免疫反应，我们采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析了在分别感染该组中毒力最强和最弱的菌株7-2和16-1时，多个免疫相关基因的表达变化。首先，我们分析了主要促炎细胞因子基因il1b以及趋化因子基因cxcl8a和cxcl18b（原名为cxcl-c1c）的表达。Cxcl18b在灵长类和啮齿类动物中无明确同源物，但有研究表明其是炎症微环境中中性粒细胞趋化的重要参与者，并参与斑马鱼对中性粒细胞的趋化反应[33]。感染后3小时，与注射PBS的对照组相比，感染7-2菌株的胚胎中il1b、cxcl8a和cxcl18b的表达显著上调（分别为(P=0.0037)、(<0.0001)和0.014），感染16-1菌株的胚胎中这三个基因的表达也显著上调（分别为(P=0.001)、(<0.0001)和0.0003）。在该时间点，尽管感染最弱毒力菌株（16-1）后cxcl18b的表达诱导倍数高出2个log2，但两种菌株之间未检测到显著差异（图4A）。感染后24小时，与注射PBS的对照组相比，感染7-2菌株的胚胎中这三个基因的相对表达倍数在(4.6 log _{2})至6.1 (log _{2})倍之间（分别为(P=<0.0001)、(<0.0001)和0.0001），而感染16-1菌株的胚胎其基因表达与注射PBS的对照组相比无显著差异。基因表达数据与这些菌株的毒力水平相符（图1）：尽管两种菌株在早期时间点均能诱导细胞因子基因的表达，这是细菌攻击后宿主预期的免疫反应，但感染强毒力菌株的胚胎在24小时 post-injection（hpi）时，7-2 菌株而非 16-1 菌株，其分析的基因表达水平仍显著高于注射 PBS 的胚胎。

图4. 利用RT-qPCR分析宿主基因表达。注射分离株7-2（蓝色柱形）和16-1（红色柱形）的胚胎中，il1b、cxcl8a和cxcl18b（A）以及myd88、nfkb、mpx和mmp9（B）基因表达的平均相对变化，以每个时间点注射PBS的对照组为基准进行标准化。误差棒代表三次生物学重复的平均值±标准误（SEM）。对每个基因进行统计学分析，采用单因素方差分析（ANOVA）结合Sidak多重比较检验；每个柱形上方的星号表示与对应时间点PBS对照组相比存在显著性差异，时间点之间的显著性差异用水平线表示。Ns=无显著性差异，(*=p ≤0.05)；(* *=p ≤0.01)；(* * *=p ≤0.001)；(* * * *=p ≤0.0001)

我们还分析了金属蛋白酶9基因mmp9的表达变化，该基因通常在细菌感染期间上调。尽管在感染后3小时mmp9的表达增加不显著，但与急性感染相比，该基因在持续感染期间的表达水平更高（与磷酸盐缓冲液组相比，7-2株和16-1株的表达量分别为平均1.7 log2和3.4 log2）。感染后24小时，强毒力菌株7-2显著诱导该金属蛋白酶基因的表达（P=0.0011，倍数变化见7852d8-aabe-4efe-b3b5-4584aa15bcd7，图4B）。髓系分化因子MYD88是白细胞介素1受体（IL1R）和Toll样受体（TLR）信号通路中的重要衔接蛋白，而NFĸB是被TLR信号通路激活的重要转录因子，也是先天免疫的核心。人类与斑马鱼的TLR信号通路存在高度相似性，且已有研究证实斑马鱼胚胎中Myd88依赖的应答可应对鼠伤寒沙门氏菌和海分枝杆菌的感染。出乎意料的是，无色杆菌感染并未使斑马鱼胚胎中myd88和nfkb2的表达发生显著变化（图4B），这表明TLR信号通路在宿主对抗无色杆菌的防御过程中并未发挥作用。髓过氧化物酶（mpx）基因主要在中性粒细胞中表达，尽管在急性感染24小时时其表达略有下调，但在急性或持续性感染期间，该基因的表达并未出现显著变化。

为了更好地理解无色杆菌属感染过程中宿主免疫细胞的作用，本研究对表达绿色荧光蛋白（eGFP）的中性粒细胞的 Tg(mpx:eGFP)i114 胚胎注射了菌株 7-2 和 16-1。研究人员在感染后1、2、3天对中性粒细胞数量进行了定量分析（图5）。与未感染的对照胚胎（感染后1天平均每胚胎有171±48个中性粒细胞，样本量n=37）相比，注射7-2菌株的胚胎在感染后1天的中性粒细胞数量出现轻微下降（平均每胚胎141±55个中性粒细胞，样本量n=18），但该差异未达到统计学显著水平。由于7-2菌株会导致胚胎快速死亡，因此未设置后续时间点的检测。受精后3至5天，胚胎的造血作用发生于尾部造血组织（CHT），中性粒细胞既存在于尾部造血组织中，也会如文献[35]所述进行随机迁移。感染胚胎的尾部造血组织中中性粒细胞数量高于未感染胚胎（图5B），这与紧急粒细胞生成的现象相符。

总体而言，与注射PBS的对照胚胎相比，感染16-1菌株的胚胎在感染过程中中性粒细胞数量显著增加，这表明胚胎会响应促炎信号启动应急性粒细胞生成（图5）。

图6. 无色杆菌被巨噬细胞快速吞噬，并在后续时间点仍与巨噬细胞相关联。将在巨噬细胞中表达绿色荧光蛋白（绿色通道）的Tg(mpeg1:eGFP (caax)^{g / 22}))胚胎注射约200个菌落形成单位的表达红色荧光蛋白（红色通道）的7-2菌株，并在卵黄区域进行成像。(A) 感染后2.5小时，巨噬细胞内存在细菌的共聚焦图像（14张图像的Z-stack），为红色与绿色通道的叠加图，比例尺4微米。(B) 感染后2.5小时，巨噬细胞内存在细菌的共聚焦图像（71张图像的Z-stack），为红色与绿色通道的叠加图，比例尺20微米。(B’) 图B所示图像的3D表面渲染图（Imaris软件）。(C) 感染后20小时，受感染胚胎卵黄区域的落射荧光图像。

我们利用荧光显微镜和共聚焦显微镜进一步分析了静脉注射表达DSRed的无色杆菌属细菌与在巨噬细胞膜部分表达GFP的Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22斑马鱼胚胎中巨噬细胞之间的相互作用。共聚焦成像显示，静脉注射的细菌被巨噬细胞吞噬（图6A、B）。在后续时间点，仍发现细菌与巨噬细胞相关，且数量更多（图2 B和E、图3、图6 C），这表明细菌不仅能在这些免疫细胞中存活，还能进行复制。在3天感染期的持续感染过程中，有时会在GFP阴性细胞中检测到细菌，这说明细菌也能在其他细胞中存活。

为进一步分析巨噬细胞在无色杆菌感染过程中的作用，我们采用Pu.1吗啉代策略，比较了分离株16-1在巨噬细胞充足胚胎和巨噬细胞耗竭胚胎（Pu.1 morphant）中的行为。静脉注射后，Pu.1 morphant的死亡率显著高于巨噬细胞充足胚胎（图7A）。在感染后1天（dpi），Pu.1 morphant的细菌载量与巨噬细胞充足胚胎相比显著增加（4.44 log10，校正P值0.0001），感染后2天也出现同样显著的细菌载量升高（6.47 log10，校正P值0.0035）。实时成像证实，感染后24小时，分离株16-1的少量细菌定位于巨噬细胞内（图7C），而Pu.1 morphant在感染后24小时细菌载量极高，且细菌出现在血管中（图7D）。这些结果表明，巨噬细胞在无色杆菌属持续感染过程中发挥宿主保护作用。与16-1菌株的研究结果一致，感染后2天，7-2菌株感染的巨噬细胞缺陷型胚胎死亡率高于对照胚胎（84%和47%）死亡率，分别），这表明巨噬细胞在急性感染过程中也发挥着保护作用。

图7. 巨噬细胞在宿主对抗无色杆菌感染的防御中起重要作用。对Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22 Pu.1  morphant胚胎和对照胚胎进行三次生物学重复，通过静脉注射16-1菌株（接种量：对照组260±98 CFU；Pu.1 morphant胚胎200±78 CFU）。(A) 生存分析（对照组，(n=130)；Pu.1，(n=117)）。采用对数秩（Mantel-Cox）检验进行统计分析，(* * * *=p ≤0.0001)。(B) 细菌载量（每组每个实验(n=5)；图中显示平均值，每个数据点代表单个胚胎）。采用Dunn多重比较的Kruskal-Wallis检验进行统计分析，(* *=p ≤0.01)；(* * *=p ≤0.001)。(C) 注射表达DSRed的16-1菌株的代表性对照胚胎，感染后24小时。绿色（巨噬细胞）和红色（细菌）通道的叠加图像。插图：与巨噬细胞相关的细菌。(C’) 图C的红色通道，显示少量细菌（箭头所示）。(D) 注射表达DSRed的16-1菌株的代表性Pu.1胚胎，感染后24小时。绿色（显示无巨噬细胞）和红色（细菌）通道的叠加。插图：血液循环中存在大量细菌。(D’) 图C的红色通道，显示感染后24小时脉管系统中的细菌载量。比例尺：50微米

讨论

本研究表明，斑马鱼胚胎是研究无色杆菌属毒力的一个有价值的补充模型，尤其可用于实时探究其与宿主先天免疫系统的相互作用以及巨噬细胞所发挥的作用。本研究中使用的菌株此前已被证实，在大蜡螟幼虫感染实验（宿主存活率）、人支气管上皮细胞毒性实验以及生物膜形成能力方面均表现出致病性差异。我们此前的研究也发现，这些菌株在野生型和CFTR基因敲除小鼠之间，肺部炎症程度、小鼠存活率以及细菌载量均存在差异。斑马鱼胚胎模型清晰地展现了这七株无色杆菌属菌株的感染结局，从致死性感染到低负荷持续性感染均有覆盖。在这七株分离株中，一株木糖氧化无色杆菌菌株引发了快速致死性感染，三株木糖氧化无色杆菌菌株表现出中等致死能力，另外三株无色杆菌属菌株（非木糖氧化无色杆菌）在实验条件下导致的死亡率较低（表2）。尽管木糖氧化无色杆菌是临床环境中最常分离到的菌种，在我们的实验条件下该菌株毒性最强，但本研究中分离株数量有限，我们无法得出该物种在此模型中毒性最强的结论，反之也不能认定其他物种无毒性。总体而言，尽管三种宿主（大蜡螟幼虫、小鼠和斑马鱼胚胎）在生物学和免疫学特性上存在差异，但三种模型中观察到的毒性水平在致病性上呈现出相似趋势。例如，7-2 菌株在大蜡螟中表现出高毒性，同时导致小鼠（野生型75%；囊性纤维化型100%）和斑马鱼胚胎（87.5%）的高死亡率，表明该菌株在多种宿主模型中均具有强毒性。在大蜡螟中低毒或无毒的菌株，如12-2和16-1，在斑马鱼胚胎中（分别为2.8%和0%）和小鼠中（0-25%）也相应表现出低死亡率，反映出其致病潜力降低。然而，8-2 菌株在大蜡螟和小鼠中表现出高毒性，但对斑马鱼胚胎仅产生中等程度影响；而17-1分离株在小鼠中的毒性低于其在另外两种模型中的中等毒性水平。这些发现支持了毒性由通用决定因素和宿主特异性因素共同塑造的观点：通用决定因素在多种宿主中均有效，而宿主特异性因素则根据不同模型对感染结果产生差异化影响。此外，不同细菌物种在多种宿主中毒性机制的保守程度存在显著差异：以伯克霍尔德菌为例，研究显示其毒性决定因素在很大程度上具有宿主特异性，仅有有限的分析因子在多种感染模型中发挥作用；而对于假单胞菌，其毒性机制在进化差异显著的宿主之间高度保守。

在任何模型（大蜡螟、小鼠和斑马鱼）中，菌株的毒力与其生物膜形成能力之间均未发现明显的相关性。支气管上皮细胞的体外实验或细胞毒性研究。探究T3SS以及T3SS效应蛋白AxoU和RTX毒素ArtA在斑马鱼胚胎中是否对毒力发挥潜在作用，将是一项有趣的研究。其他可能导致细胞内存活和宿主炎症反应存在差异的细菌因子包括表面结构、应激反应机制或毒素。我们此前对本研究所用菌株的基因组分析显示，诱导死亡率最低的16-1、12-2和201号菌株，缺失了多个与宿主细胞感染能力相关的基因，以及趋化运动、III型分泌系统组分和蛋白酶生成相关的基因。这或许可以解释这些菌株在三种感染模型中所表现出的相对较低的毒力，不过仍需开展靶向功能研究来证实这一关联。此外，在与其他土壤生物竞争的过程中，对环境细菌的适应性至关重要的因子，可能也是真核生物中重要的非经典毒力因子。例如，洋葱伯克霍尔德菌产生的抗真菌化合物AFC就是一种多宿主毒力因子。我们此前已证实，功能性AFC是该细菌在斑马鱼胚胎中引发急性感染的关键，而该因子的缺失则会导致细菌仅在细胞内持续存在。

基于我们对伯克霍尔德菌临床和环境菌株的研究，以及无色杆菌能够逃避细胞内降解的证据，我们采用了400-500个菌落形成单位的相对低接种量。这使得研究免疫细胞的初级反应成为可能，同时不会过度负荷斑马鱼胚胎的循环系统，也不会掩盖感染结果的差异。巨噬细胞是斑马鱼胚胎血液循环中吞噬微生物的主要细胞。与伯克霍尔德菌属类似，无色杆菌延迟和/或逃避被清除的能力巨噬细胞并采取胞内生存方式，这可能是它们在低细菌接种量感染后得以持续存在的原因。7-2菌株即便以低接种量也能引发急性感染，这表明其具备逃避免疫细胞清除的能力，且能在斑马鱼胚胎中诱导出无法被消除的强烈促炎反应。本研究并未排除以下可能性：若采用更高的接种量((>1000 CFU))（这种接种量可模拟菌血症状态，此时细菌可在血液循环中自由复制，而宿主缺乏足够的免疫细胞对其进行吞噬），部分毒力较低的分离株可能会导致死亡率上升。对于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌这两种此前被归为胞外病原体的细菌，通常需要更高的接种剂量（1000-3000个集落形成单位）来模拟急性感染；但近期研究表明，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌也能在宿主细胞内存活并复制，包括在斑马鱼胚胎中，它们可在此处引发持续性感染。

在斑马鱼胚胎中引发快速致死性感染的菌株（分离株7-2），已被证实对小鼠（包括野生型和囊性纤维化跨膜传导调节因子小鼠）以及大蜡螟幼虫具有高致病性；该菌株是弱生物膜产生菌，在支气管上皮细胞中具有中等细胞毒性（表2）。感染分离株7-2的胚胎中，白细胞介素1β、趋化因子8、趋化因子18b和基质金属蛋白酶9的细胞因子表达显著升高，尤其是在感染后期（感染后24小时），这进一步符合其急性感染特征和高致死率。这些发现与小鼠模型中无色杆菌属严重感染时促炎细胞因子产生增加的相关报道一致，而过度炎症反应是导致组织损伤和死亡的原因。与分离株7-2相反，分离株16-1在大蜡螟幼虫和小鼠模型中致病性较低，且在斑马鱼胚胎中的毒力最弱（表2）。感染16-1菌株的胚胎在早期时间点出现il1b、cxcl8和cxcl18b表达的瞬时诱导，同时伴随中性粒细胞性炎症（图5），这表明胚胎启动了应急粒细胞生成以控制感染。已有研究表明，炎症信号可刺激斑马鱼快速生成髓样细胞，这在志贺菌感染模型中得到了验证——在该模型中，干细胞驱动的粒细胞生成可补充中性粒细胞，且巨噬细胞来源的白介素1β（Il1b）通过核因子κB（NF-κB）和CCAAT/增强子结合蛋白β（C/ebpβ）通路调控应急髓样细胞生成。尽管存在强烈的炎症信号，但在7-2菌株的急性感染期间，与未感染对照组以及感染16-1菌株的胚胎相比，中性粒细胞数量有所减少（图5A）。目前，中性粒细胞数量减少的潜在机制尚不清楚。可能的原因是促炎细胞因子的产生水平会触发细胞凋亡程序，导致免疫细胞死亡；也可能是中性粒细胞产生并释放促炎介质以招募和激活其他白细胞，最终使中性粒细胞耗竭。

Cxcl18b 是一种鱼类特有的中性粒细胞趋化因子，其功能依赖于趋化因子受体 Cxcr2，而非 Cxcr1 和 Cxcr4b 。Cxcl18b 是炎症的标志物，因为有研究表明，在受到鱼类病原菌迟钝爱德华氏菌、海分枝杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌刺激后，以及经毒性化合物处理后，其转录水平均会上调。因此，该感染相关基因在无色杆菌攻毒接种后出现上调是意料之中的。然而，有趣的是，在持续性非致命感染的早期时间点，cxcl18b 的表达以及金属蛋白酶基因 mmp9 的表达，其瞬时上调水平要高于急性感染阶段炎症性感染，尽管差异并不显著。进一步分析在用已知会引发不同感染特征的病原体进行攻击接种后，宿主早期促炎反应中可能存在的差异，将是一项有意义的研究。此外，已有研究表明cxcl18b和mmp9的表达均依赖于具有功能的Myd88通路[34]，这说明在无色杆菌感染过程中，Myd88信号通路必须被激活。

目前关于无色杆菌感染过程中TLR-MYD88信号通路的作用机制，人们的了解还十分有限。因此，我们分析了急性感染和持续感染阶段myd88和nfkb2的表达情况。已有研究表明，斑马鱼胚胎感染鼠伤寒沙门氏菌后，这些基因的表达会上调[34]，但无色杆菌引发的急性感染并未导致myd88和nfkb2基因表达出现显著变化（图4B），这说明TLR信号通路在无色杆菌感染过程中并未发挥作用。不过，TLR信号通路必然是被激活的，因为我们发现感染过程中表达量升高的(i / 1 b)的表达在很大程度上依赖于NfkB的转录激活。此外，如上所述，cxcl18b的表达同样被证实依赖于Myd88信号通路。因此，我们的研究数据表明，无色杆菌感染过程中无需从头合成Myd88和Nfkb。其他细胞内免疫防御通路可能参与了7-2菌株感染过程中强烈的宿主免疫应答。具体而言，有研究证实无色杆菌可激活巨噬细胞中的炎症小体——含CARD结构域的NOD样受体4（NLRC4）和含吡喃结构域的NOD样受体3（NLRP3），进而引发半胱天冬酶-1的切割及(IL-1 beta)的释放[8]。

本研究的一项关键发现是巨噬细胞在控制细菌生长以及限制低毒力菌株所引发的感染严重程度方面发挥着关键作用(16-1)。在巨噬细胞缺失的斑马鱼胚胎中，16-1菌株感染导致的细菌载量显著高于巨噬细胞功能正常的胚胎，宿主死亡率也更高，这凸显了这些免疫细胞在抵抗无色杆菌属细菌防御中的关键作用。共聚焦成像结果显示，在持续性感染和急性感染期间，以及感染后的后期时间点，巨噬细胞内部均检测到了细菌。这些观察结果与体外研究一致，后者表明无色杆菌属细菌可在培养的巨噬细胞内存活，这意味着这些免疫细胞通过为细菌的持续存活和复制提供生存环境，对宿主产生了不利影响。我们的成像数据表明，7-2菌株也能在细胞内存活和复制（图6C），且感染的巨噬细胞并未通过细胞死亡机制被杀死。本研究重点在于确定斑马鱼是否是研究无色杆菌属细菌毒力的合适模型，而后续研究应聚焦于分析体外支气管上皮细胞和巨噬细胞的细胞毒性与斑马鱼模型中的毒力之间的相关性，同时探究三型分泌系统（T3SS）以及T3SS效应蛋白AxoU和ArtARTX在此过程中可能发挥的作用。此外，本研究未分析细菌在受精后5天以上的持续感染情况，但对细菌进行更长时间的持续感染研究将具有重要意义，尤其是考虑到囊性纤维化（CF）患者慢性肺部感染的重要性。

斑马鱼胚胎模型存在若干局限性，包括缺乏适应性免疫系统、无法模拟呼吸道感染以及与哺乳动物在生理上存在差异。然而，胚胎的透明特性以及其先天免疫系统与哺乳动物的相似性，使其成为实时可视化感染、解析 （注：原文未完整结束，译文按现有内容准确翻译）本研究探讨了先天免疫反应背景下宿主与病原体的相互作用机制，并详细研究了免疫细胞与细菌的相互作用，这在其他模型中是无可比拟的。该研究为探究持续性和急性感染相关的细菌及宿主因素提供了模型。本研究使用的菌株均从囊性纤维化（CF）患者体内分离得到。这些菌株在囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能正常的小鼠和斑马鱼中具有毒力，这与无色杆菌属（Achromobacter spp.）可引发医院获得性非囊性纤维化感染的特性相符。未来对更多菌株进行分析，对比囊性纤维化、非囊性纤维化及环境分离株在斑马鱼体内的毒力差异，将具有重要研究价值。

结论

本研究表明，斑马鱼胚胎是研究无色杆菌属致病性及其在先天免疫系统背景下逃避免疫杀伤能力的强大体内模型。研究结果证实了巨噬细胞在控制无色杆菌感染方面发挥着重要作用，然而这些机会致病菌能够以菌株特异性的方式在巨噬细胞内存活甚至繁殖。该感染模型可用于识别针对易感人群感染的新型治疗策略，包括筛选靶向细菌持续存在的化合物，以及在生理相关的宿主免疫环境中体内评估抗生素的疗效。

材料与方法

斑马鱼饲养

本研究使用的斑马鱼为野生型AB品系，以及转基因斑马鱼品系Tg(mpx:eGFP)i114[22]（在中性粒细胞中表达绿色荧光蛋白）和Tg(mpeg1:eGFPcaax)gl22[23]（在巨噬细胞中表达绿色荧光蛋白）。AB斑马鱼鱼卵购自斑马鱼国际资源中心，培育至成年后作为亲本使用。Tg(mpx:eGFP)i114和Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22最初由谢菲尔德大学的S. Renshaw教授和蒙彼利埃大学的G. Lutfalla教授提供，并在本实验室进行饲养繁殖。斑马鱼（斑马属）的饲养，实验动物的饲养与处理均遵循欧盟实验室动物指导原则。成年斑马鱼饲养于条件化水体中（pH值7.5，电导率650微西门子/厘米），水温28摄氏度，光暗周期为14小时光照/10小时黑暗。胚胎于光照开始后通过自然产卵收集。

细菌菌株与质粒

本研究收集的7株无色杆菌属临床分离株（不同菌种详见表2）来自意大利维罗纳囊性纤维化中心7名患者的痰液样本，此前的研究已通过全基因组测序和系统发育分析对这些菌株进行了分类。将这些细菌菌株保存在−80°C的微生物保存管（Microbank，英国内斯顿Pro-Lab Diagnostics公司）中。参考洋葱伯克霍尔德菌的电转化方法，用编码氯霉素乙酰转移酶（CAT，赋予氯霉素抗性）和红色荧光蛋白DsRed的质粒pIN29对细菌进行电转化。在添加100 mg/L氯霉素（Cm100）的LB琼脂培养基上筛选含质粒的细菌。该质粒的存在不会对菌株的生长适应性产生负面影响，且在72小时的感染过程中，即使无抗生素选择压力，质粒也能稳定存在，丢失DsRed荧光的细菌比例低于5%。

斑马鱼胚胎感染

斑马鱼胚胎的细菌显微注射操作按先前描述的方法进行。从过夜培养的菌液中收集细菌，将其光密度值（OD₆₀₀）调节至1，随后以3000倍重力加速度离心2分钟。沉淀的菌体重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。用磷酸盐缓冲液对细菌进行梯度稀释，并加入0.05%的酚红以可视化显微注射过程。胚胎被在注射前2小时手动去除卵膜。胚胎在受精后30小时（hpf）进行分期，在添加了0.04%缓冲MS222（三卡因；间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐；Sigma）的E3培养基中麻醉，使用Femtojet显微注射器（Eppendorf）和拉制显微毛细管移液器的显微操作仪，向静脉内微量注射1纳升接种物，平均对应500个菌落形成单位（CFU）。由于注射针之间的注射体积存在微小差异，通过直接注射到100微升PBS液滴中（n=3）来确定每种菌株的精确接种量，随后将该液滴均匀涂布在1.5%的LB琼脂平板上。每个实验的精确CFU数均在相应图例中注明。注射后，每组胚胎在E3培养基中洗涤、随机化处理，然后将每个胚胎单独转移至48孔板的0.5毫升E3培养基中。将胚胎置于28℃的培养箱中，采用14/10小时光照（冷白光和暖白光LED组合）/黑暗周期。对于每种菌株，使用一块48孔板进行菌落形成单位计数（每个实验每个时间点取5个单独胚胎），另一块用于从注射后1天开始每天监测存活率，持续至注射后4天（每个实验取24个胚胎），通过观察心跳是否存在来判断。感染后存活的斑马鱼胚胎在含有过量麻醉剂盐酸利多卡因（1克/升；Sigma）的E3培养基中实施安乐死，该培养基用2克/升碳酸氢钠缓冲，并加入50毫升/升乙醇，具体操作如文献所述。

菌落形成单位的测定

感染后1、2、3天，通过将单独裂解的胚胎涂布于含氯霉素100的LB琼脂平板上测定细菌载量。简要操作如下：将胚胎置于E3培养基中冲洗，在含0.02% MS222的E3培养基中麻醉，用Eppendorf研杵在含100微升的1.5毫升离心管中分别裂解加入蒸馏水，在室温下孵育10分钟。将总裂解液和系列稀释液涂布于添加了100微克/毫升氯霉素的LB琼脂平板上，于37摄氏度条件下过夜培养。次日对菌落数量进行计数。所有菌株在感染后1天、2天和3天的菌落形成单位（CFU）计数，均来自每个时间点下5个存活的胚胎，死亡胚胎被排除在外，因此该数据可能无法反映群体水平上细菌载量的变异情况。不过，特定菌株的宿主存活率与细菌载量相结合，决定了该菌株的毒力及持续存活的能力。

通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析基因表达

在感染后3小时和24小时，收集胚胎用于RNA提取、cDNA合成和qPCR分析。以肽基脯氨酰异构酶A样（ppial）基因作为内参基因。分析了一组免疫相关基因（表1）在感染后的基因表达变化。对于每个实验条件，将15个胚胎转移至500微升TRIzol试剂中，用艾本德研杵匀浆、涡旋振荡，并按照先前描述的方法在-80℃下保存。使用Rneasy MinElute清洁试剂盒（Bio-Rad公司）进行RNA提取。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad公司），按照制造商说明书对每个样本（总RNA 500纳克）进行逆转录。采用LightCycler® 480 SYBR Green I预混液试剂盒（罗氏公司）和LightCycler® 480实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）进行定量PCR。所用引物汇总于表1。循环参数为：95℃预变性10分钟，随后45个循环，每个循环包括95℃变性15秒、60℃退火40秒。每个循环结束时进行荧光信号采集。通过熔解曲线分析验证无引物二聚体和非特异性扩增产物的存在。内参基因的稳定性每个实验均对ppial进行了检测。结果采用ΔΔCt法进行分析。

表1. 用于qRT-PCR实验的引物

巨噬细胞耗竭

吗啉反义寡核苷酸被设计用于阻断前体mRNA的翻译和/或剪接，可用于敲低Pu.1转录因子的表达，该转录因子是早期髓系祖细胞分化为免疫细胞所必需的[28]。将Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22品系斑马鱼的卵在1至4细胞阶段显微注射1纳升由tMO_pu.1（5’CCTCCATTCTGTACGGATGCAGCAT-3’，0.1毫摩尔）和sMO_E4I5_pu.1（5’GGTCTTTCTCCTTACCATGCTCTCC-3’，0.38毫摩尔）组成的混合物，这两种物质可特异性阻断巨噬细胞发育但不影响中性粒细胞发育。将卵置于E3培养基中28摄氏度培养。随后验证了表达绿色荧光蛋白（GFP）的巨噬细胞是否不存在，在注射细菌之前，按照上述方法进行操作。未注射的鱼卵作为对照组。

显微镜分析

为了对感染后不同时间点的中性粒细胞进行定量分析，将 Tg(mpx:eGFP)i114 胚胎转移至铺有玻璃底培养皿（MatTek 公司）的含 0.02% MS222 的 E3 培养基中。将胚胎以侧躺姿势放置在 1% 琼脂糖/E3 培养基上，确保躯干与尾部区域处于同一焦平面。使用配备明场和荧光成像系统、并连接 Coolsnap HQ2 相机（Roper Scientific 公司）的尼康 AZ100 多变焦显微镜，通过 MetaVue 软件记录完整胚胎的图像。使用 Imaris 软件（牛津仪器公司，10.1.1 版本）对图像进行分析。利用“斑点”功能对每张图像中的中性粒细胞数量进行定量统计。

研究人员使用尼康 AZ100 和徕卡 DM IRB 倒置显微镜（均连接 CoolSnap fx 相机（罗珀科学公司）），对注射了表达 DSRed 细菌的 Tg(mpeg1:eGFP-caax)gl22 胚胎的感染进程进行成像。为了对巨噬细胞中的细菌载量进行成像，除非另有说明，接种量会降至 200 集落形成单位（CFU）。研究人员还使用 Fv10i 共聚焦激光扫描显微镜和 Fluoview 软件（奥林巴斯生命科学）分析细菌与宿主免疫细胞的相互作用。部分共聚焦图像还通过 Imaris 软件的表面结构选项进行了进一步处理。

统计分析

使用 GraphPad Prism 10 进行统计分析。生存分析的结果展示于 Kaplan-Meier 图中，并通过对数秩检验进行分析（Mantel-Cox）检验。每对比较的P值已在结果部分标注，且显著性未考虑多重比较。在测定菌落形成单位（CFU）数量的实验中，由于根据D’Agostino & Pearson正态性检验，并非所有数据均符合正态分布，因此采用非参数Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验来确定多个选定组之间差异的显著性。菌落形成单位（CFU）数量经(log10)转换后，以点图形式呈现，图中展示了每个时间点的平均值，每个点代表单个胚胎。为能在图表中纳入log10 0，将菌落形成单位（CFU）计数为0的数据转换为1。中性粒细胞数量差异的显著性采用单因素方差分析（ANOVA）结合Sidak多重比较检验进行测定。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）数据经log2转换后，针对每个基因，通过将各时间点的处理组与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组及彼此之间进行比较，采用单因素方差分析（ANOVA）结合Sidak多重比较检验分析其显著性。