题目：Systems-level investigation of the anxiolytic gut–brain interactions induced by paraprobiotic Lactobacillus brevis SBC8803 in zebrafish

原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2026.1804536/full

期刊：Frontiers in Microbiology

摘要

引言：焦虑症是全球范围内最普遍的心理健康疾病之一，而人们对精神益生菌——即能有益调节微生物群的活性或灭活微生物——-肠-脑轴的研究兴趣正不断增加。灭活的短乳杆菌SBC8803可增强哺乳动物的血清素（5-羟色胺；5-HT）信号传导，并改善压力相关表型，但其介导这些效应的肠-脑通路尚未得到完全阐明。本研究旨在探究口服SBC8803对成年斑马鱼的抗焦虑作用及其潜在分子机制。

方法：给成年雄性AB品系斑马鱼喂食含热灭活SBC8803的饲料4周，通过新型水槽测试评估其焦虑样行为。为探究潜在机制，我们对斑马鱼脑部进行了RNA测序，并对肠道内容物进行了16S rRNA V3-V4区扩增子测序，随后开展了整合多组学分析，包括基因集变异分析（GSVA）结合基于DIABLO的数据整合以及残差相关分析。

结果：经SBC8803处理的斑马鱼进入水箱上半部分的潜伏期更短，进入该区域的次数也更频繁，这与焦虑样行为的减少相符。脑转录组分析鉴定出差异表达基因，并富集了血清素受体、CREB和催产素信号通路，提示单胺能和可塑性相关信号得到增强。微生物组功能预测显示，与SBC8803相关的脂质和维生素代谢发生变化，包括与核黄素（维生素B2）和色氨酸相关的通路。GSVA结合基于DIABLO的数据整合揭示了微生物代谢与大脑信号通路之间的协同变化，这与将肠道代谢与神经调节联系起来的维生素B-血清素-抗炎轴一致。此外，残留相关性分析显示，先天的肠脑协调不依赖于SBC8803的作用，例如大脑花生四烯酸与肠道组氨酸代谢之间的关联。

讨论：这些发现为多组学分析中观察到的SBC8803给药相关相互作用的生物学有效性提供了支持。研究结果表明，副益生菌SBC8803可能在斑马鱼中发挥类抗焦虑作用，并在行为、微生物和转录组水平上重塑肠-脑网络状态，为将灭活的SBC8803视为焦虑相关疾病的潜在精神益生菌候选物提供了潜在的机制框架。

关键词：斑马鱼、宿主-微生物相互作用、PICRUSt2、RNA测序、硬骨鱼模型

引言

2019年，估计有3.01亿人患有焦虑症，约占全球人口的4%，使其成为全球最普遍的精神健康障碍（世界卫生组织，2025年）。焦虑症的患病率预计将进一步上升。患病个体通常会出现持续或过度的焦虑、担忧和恐惧，常伴随对感知到的威胁的回避行为以及惊恐发作，这会严重损害日常功能和生活质量。一线治疗方法包括心理治疗（库伊珀斯等人，2024年；孙等人，2025年）和药物治疗（班德洛等人，2017年；孔和韩，2024年），如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs）、三环类抗抑郁药和苯二氮䓬类药物均具有疗效（吕滕等人，2011年；莫哈特等人，2014年；奥斯特高，2018年）。然而，起效延迟、不良反应以及成瘾风险等局限性凸显了对辅助治疗策略的需求。

肠-脑轴是连接中枢神经系统、肠神经系统与免疫系统及肠道菌群的双向网络，在情绪和认知调节中发挥着关键作用（Aburto 和 Cryan, 2024；He 等人, 2024）。菌群失调与焦虑相关表型存在关联，这可能通过血清素能、γ-氨基丁酸能和免疫调节途径实现（Foster 等人, 2017；Jiang 等人, 2024）。无菌或经抗生素处理的动物会表现出过度的应激反应和类焦虑行为，而定植特定共生微生物可缓解这些症状（Diaz Heijtz 等人, 2011；Clarke 等人, 2013）。临床前和临床研究进一步表明，调节肠道菌群能够减轻焦虑症状。益生菌相关随机试验显示其可带来一定程度的症状改善，尤其是长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌（Mosquera 等人, 2024）；多项动物和人体研究也证实，摄入益生菌后机体的应激和焦虑相关指标会有所降低（Gholian 等人, 2024）。综合来看，这些研究结果支持精神益生菌这一概念——即通过肠-脑轴为心理健康带来益处的活性或灭活微生物——其有望成为有前景的辅助干预手段。

在候选精神益生菌中，最初从啤酒酿造过程中使用的大麦麦芽中分离得到的短乳杆菌SBC8803（Segawa等人，2008；Ogawa等人，2016），因其能够增强哺乳动物肠道内血清素（5-羟色胺；5-HT）信号传导而备受关注。该菌株可诱导小鼠肠道组织和大鼠来源的肠嗜铬细胞释放5-HT。即使是热灭活形式的细胞也能发挥作用（Nakaita 等人，2013），这表明其热稳定的结构成分可刺激肠上皮细胞。目前普遍推测，肠道来源的血清素这种局部增加可通过肠神经系统和迷走神经传入纤维影响中枢神经系统活动，为其神经调节作用提供了潜在的机制基础。一项非随机、双盲、安慰剂对照交叉试点研究表明，摄入热灭活的短乳杆菌 SBC8803 后，睡眠质量得到改善（Nakakita 等人，2016）。另有研究发现，该菌株可减少应激诱导的焦虑样行为，并改善海马依赖性记忆（Higo-Yamamoto 等人，2019；Ishikawa 等人，2019）。

本研究旨在以斑马鱼为转化模型，阐明热灭活短乳杆菌SBC8803抗焦虑作用背后的肠道-大脑分子通路。成年斑马鱼口服SBC8803后，通过新型 tank 潜水实验对其进行评估。为探究潜在机制，本研究将大脑RNA测序与肠道微生物群的16S rRNA基因谱分析相结合，并开展整合多组学分析，以识别与抗焦虑样行为相关的宿主转录组变化和微生物功能改变。

结果

短乳杆菌SBC8803对斑马鱼NTT具有抗焦虑作用

服用SBC8803 4周后，未观察到小鼠死亡或体重出现显著变化（补充图1）。在明暗箱实验（NTT）中，SBC8803显著缩短了小鼠进入鱼缸上半区的潜伏期（LTTH；(p<0.05) 图1A），并显著增加了小鼠进入鱼缸上半区的次数频率（FE；(p<0.01)；图1B）。相比之下，小鼠在鱼缸上半区停留的时间（TSTH）未检测到显著差异（图1C）。在正常实验条件下，斑马鱼暴露于新环境时，通常会因应激反应而停留在鱼缸下半区。服用SBC8803的斑马鱼表现出焦虑样反应减弱，这一点从其更短的进入上半区潜伏期（LTTH）可得到印证。以及探索行为频率的增加。尽管各组间的总游动距离和探索率均无显著差异，但经 SBC8803 处理的斑马鱼这两项指标均呈上升趋势（图 1D、E）。这些客观的行为变化——具体表现为更长时间的静止潜伏期缩短和探索行为频率增加——表明 SBC8803 给药可诱导出抗焦虑样反应，且该效应不依赖于基础运动能力的改变。

图1 SBC8803给药可降低斑马鱼新水箱实验中的焦虑样行为。（A）进入水箱上半部分的潜伏期（LTTH）。与对照组鱼相比，SBC8803处理组鱼的潜伏期显著更短。（B）进入水箱上半部分的次数（FE）。SBC8803处理显著增加了向上半部分移动的次数。（C）在水箱上半部分停留的时间（TSTH）。各组之间未观察到显著差异。（D）测试期间的总移动距离。对照组与SBC8803处理组鱼之间未检测到显著差异。（E）新水箱实验中的探索率。尽管SBC8803处理组鱼表现出探索率升高的趋势，但该差异无统计学意义。(n=8) 为每组数据。数据以均值±标准差表示。(p 0.05)、(^{* *} p<0.01) 表示无显著差异。

经SBC8803处理的斑马鱼的大脑转录组

为探究与抗焦虑表型相关的转录组变化，在给予SBC8803后收集全脑并进行RNA测序。每个样本均获得约4600万至1.17亿条双端读段，样本间质量评分良好（Q20：99.1%–99.7%，Q30：97.4%–98.6%），平均错误率为0.02%，为转录组分析提供了充足的测序深度和准确性。对log2转换的TPM值进行主成分分析（PCA），以可视化各组间的整体差异（补充图2）。利用DESeq2进行差异表达分析，共鉴定出128个差异表达基因（DEGs），其中97个基因上调、31个基因下调。火山图展示了这些结果（补充图3），差异表达基因的完整列表见补充表2，DESeq2的完整分析结果见补充数据1。

为解读这些转录组学变化的生物学相关性，我们利用 DESeq2 分析结果进行了 GSEA 分析。为从通路层面获得补充性见解，我们基于 (log _{2}) 倍变化值生成排序基因列表，并开展了基于 GO 的 GSEA 分析。总共富集了 102 个基因集，根据标准化富集分数（NES），其中 95 个被激活，7 个被抑制（图 2A 及补充表 3）。

接下来，我们运用IPA（ Ingenuity Pathway Analysis， Ingenuity通路分析）技术，识别出SBC8803给药调控的信号通路（补充图4）。以(-log (p -value )>1.3)和(z-score >2)为阈值，“神经递质及其他神经系统信号”类别下的六条通路被鉴定为激活状态。这些通路包括血清素受体信号通路、神经元中CREB信号通路、亨廷顿病信号通路、突触长时程抑制、胆囊收缩素/胃泌素介导的信号通路以及大脑中的催产素信号通路（图2B）。基于SBC8803处理后IPA的分析结果，以(-log (p -value )>1.3)为阈值，提取出与精神障碍潜在相关的排名靠前的通路（表1）。尽管IPA将“血清素受体信号通路”鉴定为激活程度最高的通路[([-log (p -value )=6.70)、(z-score =2.828)、图2C]，但促成这一富集的关键差异表达基因（DEGs）——如GNA15、GNB3、ADRB3和PRKCH——主要编码广泛作用的G蛋白偶联受体（GPCR）组分及下游第二信使。与GPCR信号增强的结果一致，IPA还显示CREB信号通路被激活（图2D）。包括CaMKII、PKA和ERK1/2在内的上游调控因子均呈上调表达或被预测为激活状态，最终共同作用于CREB的磷酸化及转录激活。 

图2 SBC8803给药诱导的大脑转录组改变。(A) 通过基因集富集分析（GSEA）鉴定的大脑转录组特征。利用来自DESeq2分析的排序log₂（倍数变化）值进行基因本体（GO）富集分析。点图展示了按激活（NES>0）和抑制通路分类的前显著富集GO项。x轴代表基因比率，定义为参与核心富集子集的基因占总基因集大小的比例。每个点的大小对应富集基因的数量，颜色表示统计学显著性（校正p值：经Benjamini-Hochberg校正的错误发现率）。(B)  Ingenuity通路分析（IPA）鉴定出神经递质相关信号通路的富集，包括血清素受体信号通路、神经元中的CREB信号通路以及大脑中的催产素信号通路，这些通路可能是SBC8803治疗后观察到的抗焦虑样效应的基础。所有富集的通路详见补充图4。(C) SBC8803给药后斑马鱼大脑中血清素受体信号通路的预测激活。(D) SBC8803给药后斑马鱼大脑中经典CREB信号通路的预测激活。在图(C、D)中，表达上调的基因以红色显示，表达下调的基因以绿色显示。对信号中间体和下游通路的预测激活和抑制效应分别由橙色和蓝色线条表示，颜色越深表示预测的激活或抑制作用越强。

斑马鱼经SBC8803处理后微生物群的变化

为探究SBC8803对肠道菌群的影响，本研究通过对16S rRNA基因V3-V4区进行扩增子测序，分析了对照组和SBC8803处理组斑马鱼的肠道微生物组。每个样本获得60,000–150,000条双端读长，Q20和Q30质量值分别为98.0%–98.5%和93.4%–94.9%。经QIIME2质量过滤和处理后，共鉴定出450个操作分类单元。尽管持续给予SBC8803且其抗焦虑效果显著，但两组的α多样性无显著差异，香农多样性指数、Chao1丰富度指数及Pielou均匀度指数均未出现显著变化（图3A）。在门水平上，两组斑马鱼肠道菌群均以梭杆菌门和变形菌门为主，这与以往关于成年斑马鱼的研究结果一致。科水平分析显示，与对照组相比，SBC8803处理组的梭杆菌科丰度适度增加，肠杆菌科丰度显著降低（图3B）。属水平上，SBC8803处理后未发现分类群存在统计学显著差异（所有(p>0.05)），但乳酸杆菌属、几丁质分解菌属和黄杆菌属呈上升趋势，邻单胞菌属呈下降趋势（图3C）。通过PICRUSt2进行功能预测发现，SBC8803处理显著上调了MetaCyc通路PWY-5971（棕榈酸生物合成II），同时显著下调了PWY-6629（L-色氨酸生物合成超通路）（图3D）。各分类学水平（门、纲、目、科、属、种）的前10个分类群汇总于补充数据2。

图3 SBC8803给药对斑马鱼肠道微生物群的影响。(A) 采用香农多样性指数、Chao1丰富度和Pielou均匀度评估对照组和SBC8803处理组斑马鱼肠道微生物群的α多样性。两组间未观察到显著差异。(B) 对照组和SBC8803处理组斑马鱼肠道微生物群中优势细菌科的相对丰度。SBC8803给药使梭杆菌科丰度适度增加，肠杆菌科丰度显著下降。(C) 对照组和SBC8803处理组斑马鱼肠道微生物群中细菌属的相对丰度。两组间各属丰度均无统计学显著差异（尽管SBC8803给药后莱夫拉菌属、几丁质分解菌属和黄杆菌属丰度呈上升趋势，而邻单胞菌属丰度呈下降趋势）。(D) 借助PICRUSt2推断并通过MetaCyc数据库注释的微生物代谢通路功能预测。SBC8803给药显著上调PWY-5971（棕榈酸生物合成II）通路，显著下调PWY-6629（L-色氨酸生物合成超通路）。

多组学整合揭示协调的肠-脑代谢特征

对大脑转录组和肠道微生物组通路得分的监督整合通过DIABLO分析揭示了与实验组强烈相关的潜在成分结构（图4A、B）。在调参过程中，采用M折交叉验证（5折，10次重复）评估了DIABLO模型的性能和稳健性。该分析确定了一个最优特征集，其中包含来自转录组模块的20条通路和来自microbiome_KO模块的25条通路（分别对应(keepX =20)和25），实现了2.5%的最低平均分类错误率（补充图5）。

图4 利用DIABLO进行多组学判别和分子谱分析。(A) 组分1的样本得分图。从DIABLO（N块稀疏偏最小二乘判别分析）框架中得出的潜在组分得分，总结了肠道微生物组与大脑转录组数据集之间的最大协方差。模型选择的特征，揭示了实验组的整合分类和层次聚类。(B) 代表跨组学分子谱的热图。该热图展示了排名靠前的判别性特征的标准化基因集变异分析得分

为了可视化多组学整合分析，将两个数据块中所选特征之间的相关性以环形图形式展示（图5A）。在脑部通路中，mTOR信号通路（dre04150；载荷值：−0.486）对对照组的贡献最大，而细胞因子-细胞因子受体相互作用（dre04060；载荷值：+0.335）与SBC8803处理组的关联最为显著（图5B）。在肠道微生物组方面，SBC8803组的特征为半胱氨酸和蛋氨酸代谢（map00270；载荷值：+0.420）以及核黄素代谢（map00740；载荷值：+0.306）的贡献增加（图5C）。

图5 区分性通路特征与模块间多组学相关性。鉴定有助于组别分离的关键微生物和大脑转录组特征及其功能关联。(A) 展示最具区分性的大脑与肠道通路之间相关性的圈图。连线代表强斯皮尔曼相关关系([|rho|>0.7])，凸显了DIABLO模型识别出的宿主神经通路与微生物功能潜力之间的协同变化。(B、C) 大脑转录组(B)和肠道微生物组(C)的载荷图。在两个组学模块中，KEGG通路标识符均根据其在组分1上的载荷权重排序，组分1代表对照组与SBC8803组之间的主要分离轴。颜色表示通路活性最高的组别。

不依赖治疗效应的固有肠-脑协调观察

为了确认DIABLO分析观察到的肠-脑相互作用与基础生理耦合之间的关联，我们利用去除对照组/SBC8803组效应后得到的残差进行了斯皮尔曼相关性分析作为补充验证（图6A）。该方法能够分离出独立于饮食干预的个体间差异，使我们得以检测在……范围内呈共变关系的稳定通路对。无论治疗状态如何，均对人群进行分析。一张汇总所有关联的全局热图（补充图6）被生成，共识别出385对显著的肠-脑通路对（(FDR<0.05) 补充数据3）。

为聚焦最可靠的关联，我们按效应大小对排名前十的正相关和负相关进行了分析（图6B）。在正相关关系中，大脑花生四烯酸代谢（dre00590）和肠道组氨酸代谢（map00340）表现出强相关性（(rho=+0.94) 补充图7，(FDR =0.0040)），且在伪计数设置下具有高稳定性（相关性 (range ≈0.08) 图6C）。在负相关关系中，最稳定的配对关联了大脑多梳抑制复合体相关活性（dre03083）与肠道视黄酸诱导基因-I样受体信号通路（map04622）呈现强烈的负相关（(rho=-0.93)、(FDR =0.0053)），敏感性分析中该相关性的变异极小（相关系数 (range ≈0.04)）。其他通路对包括脑内苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成（dre00970）与肠道次生代谢产物生物合成（map01250）之间的关联，显示出更高的相关系数（(rho=+0.96)、(FDR =0.00084)），但在伪计数条件下稳定性更低（相关系数 (range ≈0.62)），因此对这些结果的解读需更加谨慎。

图6 基于残差的相关性分析显示的不依赖组效应的肠-脑协调。(A) 残差相关性分析流程的概念概述。为分离不依赖饮食干预的肠-脑关联，通过线性模型对通路得分进行校正以剔除组效应，所得残差用于相关性分析。(B) 肠-脑通路间显著残差相关性的热图。斯皮尔曼相关系数通过剔除组效应后得到的残差计算得出，正值（红色）和负值（蓝色）分别代表不依赖组驱动变异的正向关联和负向关联。(C) 相关性稳定性的敏感性分析。图示展示了在中心对数比变换（CLR）过程中应用不同伪计数阈值时，校正后斯皮尔曼相关系数的稳健性。

讨论

本研究综合阐述了灭活短乳杆菌SBC8803如何通过微生物群-肠道-脑轴内的多层相互作用发挥精神益生菌作用。多组学整合分析揭示了肠道微生物功能和大脑转录调控的协同改变，表明存在一个将微生物维生素代谢与宿主神经传递及免疫平衡关联起来的系统级网络。后续的残差相关性分析进一步指出，存在不依赖于SBC8803干预的潜在肠道-脑区关联，为多组学分析结果的解读提供了支持。综上，这些研究结果提出了一种代谢介导的肠-脑串扰模型，在该模型中，与维生素B代谢相关的微生物活动与血清素能信号传导协同作用，共同塑造神经和免疫稳态。

基于未观察状态2重建的群落系统发育分析进行功能预测，阐明了肠道内的初始代谢变化。补充SBC8803的组中，棕榈酸生物合成（map00062：棕榈酸生物合成II）被上调，而L-色氨酸生物合成超家族则被抑制。微生物棕榈酸生物合成的增强表明，肠道菌群向脂肪酸合成代谢和膜脂质重塑方向转变，这可能通过改变微生物代谢物谱来影响宿主的免疫状态。由于脂肪酸合成需要大量的NADPH和黄素辅因子（Byrnes等人，2018；Tolomeo等人，2020），这一模式与观察到的核黄素（维生素B2）代谢激活及氧化还原调控结果一致。相反，微生物色氨酸生物合成的预测抑制意味着肠道微生物群从头合成色氨酸的能力下降。我们推测，这一转变可能反映了宿主对色氨酸用于血清素和犬尿氨酸途径的利用增加所做出的代偿性反应。微生物脂质代谢与宿主神经递质合成之间的这种互补关系，表明代谢资源可能沿着微生物群-肠道-大脑轴发生潜在的协同重新分配，这与我们提出的“维生素B-血清素-抗炎”模型相符。然而，由于这些微生物功能是通过PICRUSt2推断得出的与通过代谢组学直接测得的结果相比，这些与宿主代谢过程的关联必须被解读为有待未来实验验证的推测机制。

DIABLO 多变量分析显示，肠道来源的核黄素代谢与大脑雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导之间存在强烈的负相关。同时， Ingenuity 通路分析（IPA）发现补充组中血清素受体和环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）信号通路被激活，这表明与突触可塑性相关的信号传导得到了增强。结合GSEA鉴定的突触间信号传导抑制作用，这些变化表明在补充剂作用下，机体向神经适应方向转变。这一模式与以下观点一致：微生物维生素B代谢增强，尤其是核黄素，可间接调节大脑mTOR活性，同时通过血清素能和CREB通路支持神经传递（Udhayabanu等人，2017；Ilchibaeva等人，2022；Olfat等人，2022）。这也与先前关于维生素B2的研究结果相符维生素B6可维持氧化还原平衡和线粒体稳态，从而减轻应激诱导的mTOR过度激活（Johnson等人，2013；Ciapaite等人，2023）。值得注意的是，尽管IPA分析显示血清素受体信号通路上调，但这一富集结果主要由广泛发挥作用的G蛋白偶联受体（GPCR）相关组分所支撑。因此，这些转录组学变化可能反映了对普通GPCR信号网络的广泛调控，这类网络潜在包含但并非严格局限于血清素能相关元件（Wong等人，2023）。此外，转钴胺素βb（tcnbb）表达水平升高，这与维生素B依赖性色氨酸羟化酶在血清素合成中的作用相符（Kennedy，2016；Young等人，2019；Tang等人，2025）。这些研究结果揭示了肠道来源的维生素与宿主神经信号通路之间的代谢协同相互作用，阐明了微生物代谢调控斑马鱼脑稳态的潜在机制。

除代谢相关性外，核因子κB抑制因子NFKBIE的显著上调表明大脑中可能向抗炎调节状态发生转变。尽管推断的核因子κB相关网络抑制意味着副益生菌治疗可能启动类似耐受的机制，但我们必须强调，这些转录组学观察结果仅具有关联性。需注意的是，需要通过靶向蛋白质组学或细胞实验（如小胶质细胞形态分析或细胞因子直接定量），才能明确证实这些转录变化是否会转化为神经炎症的功能性降低。这一假设与基因集富集分析（GSEA）的结果一致；我们推测，广泛的“炎症反应”和“免疫反应”基因集的富集，可能反映了抗炎介质的调节参与，而非单纯的促炎症级联反应。同时，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的抑制而 MAPK 信号通路进一步强化了这一解释，因为这两条通路均介导炎症放大和神经元兴奋性毒性（Switon 等人，2017；Canovas 和 Nebreda，2021）。综合来看，这些数据支持这样一种模型：微生物的维生素 B 代谢间接增强了血清素能神经活性，同时抑制炎症，稳定了神经回路。

先前的研究为该框架提供了机制背景。“维生素B-血清素-抗炎轴”正日益被认为是微生物群-肠-脑通讯的关键通路。维生素B6和B9（叶酸）是肠道上皮细胞中色氨酸酶促转化为血清素的辅因子（Wan等人，2022；Lu等人，2024）。约90%的血清素总含量在胃肠道中合成，肠道内的微生物和宿主代谢共同调控色氨酸羟化酶的表达（González Delgado等人，2022；Miri等人，2023）。肠道来源的血清素不仅调节肠道蠕动，还通过迷走神经传入信号传递至大脑，影响情感和认知过程（Horn等人，2022）。在免疫细胞上，5-HT2B和5-HT4受体的激活可促进抗炎表型（Wan等人，2020；Zheng和Xu，2025）；在大脑中，5-HT1A和5-HT2A受体的激活可抑制小胶质细胞活化和氧化应激（Krabbe等人，2012；Glebov等人，2015；Xing等人，2024）。因此，在我们的斑马鱼模型中观察到的血清素能信号上调以及抗炎反应的同步激活（以nfkbie上调为证据），可能是通过抑制神经炎症水平实现行为稳定的基础（Whiteside等人，1997；Demin等人，2021）。这些数据共同表明，维生素B-血清素-抗炎轴不仅能促进分子稳态，还能助力肠-脑相互作用介导的行为韧性形成。

残差相关性分析旨在排除SBC8803的影响以观察肠-脑关联，该分析揭示了两种显著模式。第一种是大脑多梳抑制复合体通路（dre03083）与肠道视黄酸诱导基因-I样受体信号通路（map04622）之间存在稳定的负相关。此处的肠道视黄酸诱导基因-I信号代表一种预测的微生物功能特征（双链RNA识别和RNA解旋酶基因的同源序列），而非宿主通路的激活。结合基因集富集分析显示的核小体基因集抑制现象（这表明染色质向更松散的结构转变），多梳蛋白活性降低是合理的。若情况如此，这种负相关意味着补充组中细菌类抗病毒功能潜能增强，同时大脑中多梳抑制复合体的活性降低。鉴于斑马鱼中多梳抑制复合体1/多梳抑制复合体2在神经发育和胶质细胞维持中的作用（Raby等人，2021；Feng和Sun，2022；Hanot等人，2025），这种协同模式可能反映出一种补偿机制，即微生物类免疫功能状态与中枢表观遗传调控相互作用。（Liu 等人，2023）。第二个值得注意的发现是大脑花生四烯酸代谢（dre00590）与肠道组氨酸代谢（map00340）之间存在显著的正相关关系。由于花生四烯酸衍生的脂质和组氨酸衍生的代谢物均能调节神经免疫信号传导（Broos 等人，2024；Dürholz 等人，2025），这种共变现象揭示了肠道-大脑功能变异协调的另一维度，该维度超越了群体水平的差异。综合来看，这两项发现与基于 DIABLO 的多组学整合未捕捉到的生物学特征相符，也支持了副益生菌 SBC8803 可能在经典的肠道-大脑耦合之外发挥额外作用的观点。

我们的研究结果还表明，类益生菌能够产生与活性益生菌相当的全身性效应，这与近期的研究证据相符。多项研究表明，热灭活的乳酸菌菌株（如黏膜乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌）可增加结肠白细胞介素-10水平、调节血清素受体表达、促进5-羟色胺生物合成并抑制促炎细胞因子（Magry´s和Pawlik，2023；Mudaliar等人，2024；Sun等人，2024年）。这些数据支持这样一种观点，即无活性的微生物成分可以结合宿主模式识别受体和代谢通路，通过免疫代谢调节产生有益的精神益生菌效应。

需注意本研究存在几项局限性。首先，本研究报告的关联仅为相关性，无法确立因果关系；需通过靶向代谢物补充或微生物基因操作来验证因果关系。其次，微生物功能是基于16S rRNA基因数据预测得出的，未必能完全反映实际活性；需对肠道内容物和血清进行代谢组学检测，以确认维生素B衍生物和5-羟色胺前体的生成与循环。第三，热灭活副益生菌SBC8803在斑马鱼肠道内的具体代谢过程尚未完全明确。尽管我们推测SBC8803通过短链脂肪酸生成等途径调控肠-脑轴，而短链脂肪酸可直接刺激肠道5-羟色胺分泌（Reigstad等人，2015；Yano等人，2015），但益生菌在斑马鱼体内的确切代谢去向仍需进一步解析。不过，鉴于2型糖尿病斑马鱼模型的菌群功能特征与人类高度相似，尽管分类学上存在差异（Okazaki等人，2019），斑马鱼中益生菌的代谢途径大概率与哺乳动物途径基本一致。第四，受菌株资源限制，本研究未设置阳性对照（例如已知可增强5-羟色胺生成的经典精神益生菌菌株）。未来纳入此类参考菌株的对比研究，对于标准化SBC8803的相对功效具有重要价值。最后，尽管斑马鱼模型为转化研究提供了宝贵思路，但将结果外推至人类时需谨慎；需开展啮齿动物或人源化模型研究，以验证所提出的维生素B轴及其行为学效应的普适性。

总之，我们的数据支持这样一种机制框架：肠道来源的维生素、血清素能信号传导与抗炎通路协同维持神经和行为的稳定性。这一整合性观点强化了副益生菌作为有效心理益生菌调节剂的概念，并为未来针对微生物群-肠-脑轴的治疗策略奠定了基础。

结论

本研究表明，副益生菌补充剂可通过协同激活微生物的维生素B代谢和血清素能通路来重塑肠-脑网络，从而抑制神经炎症信号传导。整合多组学方法揭示了一个将肠道代谢功能与神经基因调控联系起来的系统性“维生素B-血清素-抗炎轴”，为益生菌的精神生物潜力提供了新的机制基础。

材料与方法

斑马鱼

所有实验均使用成年野生型斑马鱼（斑马鱼AB品系，6月龄；购自美国俄勒冈州尤金市的斑马鱼国际资源中心）。这些斑马鱼的平均标准体长和体重分别为2.5±0.23厘米和0.28±0.07克。斑马鱼饲养在标准实验室条件下，包括14:10小时的光暗周期、28.5摄氏度的水温，以及配备过滤自来水的循环水系统。除非另有说明，斑马鱼以((n=10 per tank))的群体形式饲养在2升的水箱中，每日投喂两次商品饲料（Gemma Micro 300，挪威斯塔万格市Skretting公司）。

向斑马鱼施用 SBC8803

为了消除性别二态性的潜在影响，喂食实验中仅使用成年雄性斑马鱼。每组五条鱼每个2升培养瓶中均放置相应菌株。短乳杆菌SBC8803（FERM BP10632）购自日本国立技术与评估研究所生物资源中心（木更津市）。将细菌细胞在含2%麦芽糖、1.4%酵母提取物、0.5%乙酸钠和0.005%五水硫酸锰的肉汤中于30℃培养24小时。培养结束后，通过离心收集细胞，用去离子水洗涤三次，随后按照先前描述的方法（Nakaita等人，2013年）在105℃下热灭活10分钟并冻干。将SBC8803以每克饲料00ca497b-3f19-44b1-9886-82dbf37bafd个细胞的浓度掺入Gemma Micro 300饲料粉末中。将混合物冻干后，按照先前描述的方法处理，使粒径达到(≤700 mu m)（Zang等人，2011年）。每条鱼每次投喂5毫克饲料（相当于每天投喂两次，持续4周，共(1.25 ×10^{8} cells ))个细胞）。由于鱼几乎完全摄食了提供的饲料，日投喂率约为其体重的3.6%，每条鱼每日摄入(2.5 ×10^{8})个热灭活细胞，约合每克体重(8.9 ×10^{8})个细胞。

新型水箱潜水测试（NTT）

经过4周的喂食期后，采用改良版的新异 tank 测试（NTT）评估类焦虑行为。为确保对类焦虑反应的可靠评估，我们采用了包含三个阶段的改良方案：适应期、测试前应激加载期和测试期（Shinkai 等人, 2025）。适应期内，将鱼放入600毫升的养殖箱[日本爱知县MeitoSuien公司；内部尺寸：135毫米（宽）×95毫米（深）×90毫米（高）]中适应5分钟。随后，将鱼转移至暂养箱中再停留5分钟，以施加测试前应激加载。之后，将鱼放入测试箱进行行为评估。测试箱的内部尺寸为140毫米（宽）×45毫米（深）×120毫米（高）。使用一台水平放置的高清数码摄像机（日本大阪松下HC-V495M型）以每秒30帧（fps）的频率录制5分钟的行为影像。采用iDTracker软件（2.1版本）分析游泳行为（Romero-Ferrero 等人, 2019）。基于我们近期研究中确立的精细化计算方法（Shinkai 等人, 2025）——该方法对标准行为学指标进行了修正（Stewart 等人, 2012）——量化了三个与类焦虑行为相关的参数：进入上半区域的潜伏期（LTTH）、进入上半区域的次数（FE）以及在上半区域停留的时间（TSTH）。此外，还测量了总游动距离和平均游泳速度。

脑部RNA测序

行为学测试完成后，将斑马鱼浸入冰水实施安乐死，迅速剥离全脑并保存在RNAlater保存液（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）中。采用TRIzol试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）结合RNeasy迷你试剂盒（德国北莱茵-威斯特法伦州希尔登市凯杰公司）提取总RNA并进行RNA纯化。使用生物分析仪2100系统（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司）评估RNA完整性，仅选取RNA完整性数值（RIN）大于8.0的样本进行后续分析。按照制造商的方案制备RNA文库，并使用MGI DNBSEQ-T7平台进行测序。

RNA测序数据分析

FASTQ 文件通过 fastp（0.23.4 版本）进行了修剪（Chen 等人，2018）。使用 STAR（2.7.11b 版本）将清洗后的 mRNA 读数与斑马鱼参考基因组进行比对（Dobin 等人，2013）。比对过程使用了 GRCz11 版本（Ensembl 113 版）的主要基因组组装 FASTA 文件以及对应的基因组注释 GTF 文件。利用 Salmon（1.10.3 版本）对转录本丰度进行定量分析（Patro 等人，2017）。为进行转录本定量，使用 gread（0.12.7 版本）从 FASTA 和 GTF 文件中生成参考 cDNA 组装（Pertea 和 Pertea，2020）。使用 MultiQC（1.24.dev0 版本）汇总了测序和比对统计的综合结果（Ewels 等人，2016），整合了用于质量控制和修剪的 fastp 输出、用于基因组比对的 STAR 输出以及用于转录本定量的 Salmon 输出。这份包含每个样本总读数计数和比对指标的整合数据集已在补充表 1 中提供。将 Salmon 输出文件导入 R 软件，并通过 tximport（1.34.0 版本）转换为原始基因计数和标准化的每百万转录本（TPM）值（Love 等人，2018）。TPM 值在加上 1 个伪计数后进行 log2 转换，用于主成分分析（PCA）。使用 DESeq2（1.46.0 版本）进行差异表达基因（DEG）分析（Love 等人，2014）。差异表达基因的识别采用以下阈值：错误发现率 ((FDR)<0.1) 和绝对倍数变化 (change ≥1.2)。使用 R 包 biomaRt（2.62.1 版本）对差异表达基因进行注释（Smedley 等人，2009）。利用 clusterProfiler（4.14.6 版本）进行基因集富集分析（GSEA）（Wu 等人，2021），输入数据为从 DESeq2 获得的倍数变化值。将 (FDR <0.1) 的基因集视为显著基因集，并根据其标准化富集分数（NES）的符号进行分类。绘制点图以展示激活的 ((NES>0)) 和抑制的 ((NES<0)) 基因集中统计显著性排名前 10 的通路。

核心通路分析（IPA）

为进行通路水平分析，借助(p<0.05)和绝对倍数变化(change ≥1.5)从DESeq2分析结果中制备了IPA的输入基因集。特意采用了不同的统计阈值来反映每个分析步骤的特定目标。对于单个基因水平的报告，使用严格的基于错误发现率（FDR）的标准，以确保对假阳性的严格控制。相反，对于IPA分析，应用了名义p值阈值((p<0.05))，为算法提供足够全面的转录组网络，从而实现更灵敏、探索性更强的通路水平解读。利用BioMart数据库将斑马鱼Ensembl基因ID转换为对应的人类直系同源基因，以确保与Ingenuity通路分析（IPA）知识库兼容。将得到的差异表达基因（DEG）列表上传至IPA（美国加利福尼亚州雷德伍德市的QIAGEN公司），并进行核心分析，以识别显著富集的经典通路。通路显著性使用 (-log (p -value )>1.3) 阈值确定，激活状态通过 z 分数预测。

肠道16S rRNA测序

行为测试结束后，从斑马鱼体内收集肠道内容物，使用快速DNA粪便/土壤微生物微量制备试剂盒（Zymo Research，美国加利福尼亚州欧文市）提取肠道细菌DNA。通过PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4区，利用Illumina MiSeq平台（2×300 bp）进行文库制备和测序。使用QIIME2（2022.2版本）处理序列数据（Hall & Beiko, 2018），并借助SILVA 138数据库完成分类学分类。通过未观察状态重建的群落系统发育分析2（PICRUSt2，2.3.0版本）推断微生物组的功能特征（Douglas et al., 2020）。

基因集变异分析（GSVA）

首先利用GSVA R包（版本2.0.7）中实现的GSVA算法，将大脑转录组学数据和微生物PICRUSt2输出数据转化为可比较的通路水平评分（Hänzelmann等人，2013年）。通过KEGGREST R包（版本1.46.0）获取斑马鱼的KEGG通路基因集（通过Entrez基因ID映射）和微生物功能（通过KEGG直系同源物标识符映射）。使用gsva函数，以高斯核((k cdf= "Gaussian"))、最小基因集大小为5、最大大小为500，为每个样本计算GSVA评分。得到的GSVA评分矩阵被用作后续整合分析的输入。

基于DIABLO的整合多变量分析

研究借助 mixOmics R 包（版本 6.30.0）中集成的 DIABLO（基于组学研究潜变量方法的生物标志物发现数据整合分析）框架开展有监督多变量分析。以大脑（转录组模块）和肠道（微生物组_KO 模块）的 GSVA 评分矩阵作为预测变量（X），将实验组（对照组与 SBC8803 组）设为结果变量（Y）。研究采用模块间权重为 0.1 的设计矩阵，并将成分数量（ncomp）设为 1。通过 tune.block.splsda 函数确定每个模块需保留的最优通路数量（keepX），该函数基于马氏距离执行了重复 10 次的 5 折交叉验证。keepX 的搜索范围为：转录组模块 10 至 50，微生物组_KO 模块 5 至 25。最终采用优化后的 keepX 值（转录组模块 20、微生物组_KO 模块 25）构建 block.splsda 模型，随后提取了成分 1 上的通路载荷，该载荷反映了各选定通路对组间区分的贡献度。

脑与肠道通路间残差相关性分析

首先利用线性模型[lm(pathway_score ∼ group_factor)]，从转录组和microbiome_KO模块的转置GSVA评分矩阵（样本×通路）中，为每个通路计算实验组的校正残差。这些残差代表了在扣除与实验组相关的平均效应后，通路评分中的变异，从而分离出独立于主要饮食干预效应的个体间变异。随后，使用Hmisc R包（版本5.23）中的rcorr函数，计算所有脑通路与肠道通路残差之间的斯皮尔曼等级相关系数及对应的p值。采用本雅明尼-霍奇伯格法（p.adjust函数，(method =^{circ} fdr)）对得到的p值矩阵进行多重检验校正，以(FDR <0.05)为统计学显著性阈值。为评估这些研究结果的稳健性，开展了敏感性分析：在KO丰度数据的初始中心化对数比（CLR）转换过程中，应用五个不同的伪计数参数值((1 ×10^{-7})、(1 ×10^{-6})、(1 ×10^{-5})、(1 ×10^{-4})和(1 ×10^{-3})，重复执行包括GSVA分析和残差计算在内的整个分析流程（Gloor等人, 2017；Wang和Luan, 2024）。

统计分析

使用 GraphPad Prism（10.5 版）对行为学和微生物多样性数据进行了统计分析。对于转录组测序（RNA-seq）和多组学整合等组学数据，所有计算分析均采用 R 语言（4.4.3 版）完成。对于涉及两组以上的比较，采用单因素方差分析（ANOVA）后再进行合适的事后检验。数据以平均值±标准差（SD）表示。以 p 值 (<0.05) 作为统计学显著性的判定标准。转录组测序、基因集变异分析（GSVA）以及整合多组学分析的详细统计方法、特定算法和阈值（如错误发现率 FDR）详见各对应小节。