题目：One-step generation of semi-cloned zebrafish carrying a defined genetic modification

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41422-026-01266-0

期刊：Cell Research

主要内容

包括青鳉鱼1、小鼠2,3、大鼠4、牛、羊5以及人类6在内的多种物种的单倍体胚胎干细胞（haESCs）能够“受精”卵母细胞，产生半克隆胚胎/动物，因此在构建具有复杂修饰的动物模型方面具有潜在应用价值。在小鼠中，同时携带H19差异甲基化区（H19-DMR）和IG差异甲基化区（IG-DMR）缺失的雄性遗传单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs），通过向卵母细胞内显微注射AG-haESCs（ICAHCI），可高效支持半克隆仔鼠的生成，成功率最高可达移植胚胎的30.0%。因此，小鼠双敲除雄性遗传单倍体胚胎干细胞（DKO-AG-haESCs）已被用作可遗传操作的受精工具，用于在个体水平进行复杂的遗传分析7。然而，这一方法在斑马鱼——研究脊椎动物发育和疾病的关键模式生物——中仍未实现。

为获得孤雌生殖（AG）或孤雌生殖（PG）单倍体胚胎，分别通过紫外线（UV）照射使卵子或精子失活，再与未处理的精子或卵子进行体外受精（补充信息图S1a）。AG和PG单倍体胚胎在28.5℃的卵水中均成功发育至囊胚期。随后，我们分离AG或PG囊胚细胞以进行胚胎干细胞（ESC）的分离培养。我们此前的尝试从PG胚胎中获得了稳定的单倍体细胞系，但这些细胞并非胚胎干细胞，而是与心脏相关的细胞系。此外，将这些细胞注射到卵母细胞中构建的胚胎未能发育至幼虫阶段（数据未显示）。

鉴于胚胎干细胞（ESCs）源自囊胚的内细胞团，我们接下来探究了来自囊胚的单倍体细胞是否能以类似精子的方式支持斑马鱼的个体发育。为此，我们采用了斑马鱼和青鳉鱼中用于核移植（NT）的常规方法（补充信息，视频S1）。通过胞质内单倍体囊胚细胞注射（ICHBCI），我们发现AG和PG单倍体囊胚细胞均能成功支持重构胚胎发育至囊胚期。然而，大多数重构胚胎从囊胚期开始就出现发育停滞和形态异常（补充信息，表S1）。此外，约63.0%的重构胚胎为孤雌生殖，因为它们在重构后1天（dpr）未表现出供体细胞的荧光。半克隆胚胎在重构后3天（dpr）表达供体来源的绿色荧光蛋白（GFP）和受体来源的红色荧光蛋白（mCherry）（图1a）。在该初步实验中，我们从931个利用AG或PG单倍体囊胚细胞构建的重构胚胎中获得了3条成年斑马鱼（图1b；补充信息，表S1）。倍性分析显示，其中两条斑马鱼（占重构胚胎的约0.2%）为二倍体（图1c）。这两条半克隆斑马鱼均为雌性，能够产生携带奠基者遗传特征的正常后代（图1d；补充信息，图S2）。综上，这些研究结果表明单倍体囊胚细胞，当注入卵母细胞，可以产生肥沃的半克隆斑马鱼。

为了提高半克隆斑马鱼生成的成功率，我们进行了几项优化实验。由于PG单倍体胚胎的制备比AG单倍体胚胎更容易和更高效（补充信息，图S1b-e），我们在随后的实验中选择了PG单倍体胚胎作为供体细胞源。接下来，我们使用压电冲击移液管驱动单元，这是小鼠克隆和半克隆研究的标准系统，以取代斑马鱼胚胎操作中使用的常规气动操作系统，以大大减少创伤（补充信息，视频S2）。令人惊讶的是，23.4%的重建胚胎发展到1 dpr，其中约60.0%携带供体基因组（补充信息，表S1）。重要的是，获得了7条成年斑马鱼，包括5条二倍体半克隆个体（约3.0%的重建胚胎）和两条三倍体斑马鱼（补充信息，图S3）。所有测试的半克隆鱼都有生育能力。

然而，在这一系列实验中，我们仍然观察到约40.0%的重建胚胎是单性生殖发育的。鉴于M期单倍体供体细胞对小鼠重建半克隆胚胎的发育至关重要，3我们用诺考达唑处理囊胚细胞，使它们在M期同步（补充信息，图S4）。引人注目的是，超过90.0%的重建胚胎（27 of 29,1 dpr）携带来自注入细胞的基因组（补充信息，图S5a）；然而，在5 dpr时10个重建胚胎中有9个是三倍体（补充信息，图S5b，c）。我们推测M期单倍体细胞没有足够的时间窗口排除假极体，从而在重建胚胎中形成二倍体假原核和三倍体核型。为了解决这个问题，我们尝试使用在有丝分裂的最后阶段包含一组染色体的末期单倍体供体细胞进行注射（补充信息，图S6a和视频S3）。通常，在细胞分裂后期保持附着的两个子细胞处于末期。因此，我们从两个附着细胞中挑选一个进行注射。引人注目的是，约80.0%的重建胚胎（26个中的21个，1 dpr）是二倍体（补充信息，图S6b-d）。

然而，半克隆胚胎的整体发育潜力仍然很低，可能是由于斑马鱼胚胎中快速增殖导致的假原核和雌原核之间的不同步。我们因此在低温下处理半克隆胚胎，这可以减缓斑马鱼胚胎的生长速度，而不会损害它们的发育潜力。10我们测试了不同的温度条件，发现在正常条件下长期培养之前暴露于20℃1小时显著增强了重建胚胎的发育潜力。值得注意的是，35.2%的从新鲜分离的末期囊胚细胞获得的重构胚胎在受精后5天正常发育；其中，86.8%（38个中的33个）进一步发育为具有二倍体核型的成体（图1e；补充信息表S2）。总体而言，这些优化措施提高了获得成体半...克隆斑马鱼的整体效率提升至30.6%，是初始方法的150倍。

有趣的是，PG单倍体囊胚细胞培育出了雄性和雌性半克隆斑马鱼（补充信息，表S3）。这一现象与此前观察到的情况有所不同其他物种的半克隆动物，包括青鳉鱼、小鼠和大鼠，均为雌性1,3,4，这可能是由斑马鱼独特的性别决定机制以及其不存在基因组印记所致11。此外，雌性和雄性半克隆斑马鱼均具有生育能力。雌雄比例约为2.12:1（补充信息表S4），这可能是由于本研究中饲养密度较低，这一发现与此前“食物供应量翻倍会增加雌性比例”的观察结果一致11。综上，这些结果表明，我们已建立了一种高效获得雌性和雄性半克隆斑马鱼的实验方案。

图1. 借助种间细胞核胞质移植构建携带遗传修饰的半克隆斑马鱼。a 211117SC 斑马鱼（受精后3天）的双荧光成像，显示供体来源 Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼的绿色荧光蛋白表达以及受体 Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼的红色荧光蛋白表达（比例尺，250 微米）。b 211117SC 斑马鱼在受精后55天剪尾并取样进行倍性分析和基因分型后的成体形态（比例尺，5 毫米）。c 流式细胞术倍性分析显示，野生型斑马鱼与211117SC斑马鱼的DNA含量分布具有可比性，二者均呈现二倍体（2N）和四倍体（4N）峰。d 根据遗传模式将F1子代基于荧光分为四种表型组。双荧光胚胎携带两种转基因，无荧光个体则缺乏两种报告基因。F1后代中四种类型的表型比例为65:63:80:69（比例尺，200 微米）。e 四种热程序下使用末期供体细胞对半克隆斑马鱼的胚胎（受精后5天）和成体存活率进行评估。f 基因分型结果显示，半克隆斑马鱼#250115-4 在capn3a基因中存在4 bp插入缺失、在capn8基因中存在6 bp缺失、在capn12基因中存在4 bp缺失；半克隆斑马鱼#250113 在capn3a基因中存在7 bp缺失、在capn8基因中存在3 bp缺失、在capn12基因中存在10 bp缺失。g 240425SC-1 斑马鱼在受精后2天的形态。绿色荧光（Sox17:GFP）证实供体来源细胞，红色荧光（Huc:mCherry）表明成功敲入（比例尺，250 微米）。h 240425SC-1 斑马鱼在受精后110天的成体形态（比例尺，5.0 毫米）。i 核移植-半克隆（NT-SC）流程示意图：(1) 将核糖核蛋白复合物（RNPs）显微注射到1细胞期单倍体PG胚胎中（注射50枚RNPs胚胎）。每个囊胚的一半用于PCR检测，对侧半囊胚作为核供体。(2) 将供体细胞显微注射到紫外线灭活的去核卵母细胞中，构建重构核移植（NT）胚胎（每枚单倍体供体细胞对应1枚胚胎，共20枚NT胚胎）。(3) 选取经基因分型的囊胚构建半克隆胚胎（共100枚重构胚胎）。(4) F0代成体互交获得携带突变纯合子的F1代后代。j 核移植胚胎发育的明场成像（比例尺，1.0 毫米）。hpr：重构后小时数。k 核移植囊胚的PCR基因分型，证实等位基因传递。l 核移植-半克隆胚胎形态的明场成像（受精后5天；比例尺，1.0 毫米）。m 突变等位基因测序：半克隆胚胎间一致的缺失图谱证实克隆遗传保真度。n 核移植-半克隆斑马鱼成体形态（2月龄；比例尺，1.0 厘米）。o F1后代形态（比例尺，1.0 毫米）。p 测序证实F1后代存在相同的缺失。

在小鼠中，半克隆技术结合CRISPR/Cas9已被用于一步法高效制备携带均匀基因修饰的小鼠模型，并避免了首建个体出现嵌合现象¹²。我们想探究能否通过本研究建立的半克隆系统获得单一基因型的突变斑马鱼。为验证这一点，我们首先将靶向tbxta基因的Cas9蛋白和sgRNA注射到单细胞阶段的单倍体PG胚胎中（补充资料图S7a，策略A）。随后，当注射后的胚胎发育至囊胚期时，我们分离出单个单倍体细胞并随机挑选进行注射。从230枚重构胚胎中，我们获得了4尾成年半克隆斑马鱼，所有个体均携带tbxta基因的杂合突变（补充资料图S7b）。这些斑马鱼可育，并成功将突变的tbxta基因传递给下一代（补充资料图S7c）。正如预期的那样，所有检测的后代均与首建个体拥有相同的基因型。

随后，我们探究了是否可通过同时破坏tbxta、smo和tfap2a基因，向单倍体囊胚细胞中引入多种遗传改变，进而培育出携带多种突变的半克隆斑马鱼。以囊胚期细胞为供体，我们从311个重构胚胎中获得了6只成年半克隆斑马鱼：其中5只为三基因突变型，1只为双基因突变型（补充资料图S7d）。所有这些首建个体在三个靶向基因中均携带不同突变，且这些突变更传给了与首建个体基因型相同的F1代后代（补充资料图S7e）。我们还尝试对同一基因家族的3个基因——capn3a、capn8和capn12引入突变（补充资料图S8a）。从71个重构胚胎中，我们培育出了7只具有不同突变谱的成年F0代鱼，其中2只为三基因突变型（图1f）。有趣的是，携带capn3a和capn12相同突变的雌雄半克隆首建个体（补充信息，图S8b）可在F1代产生capn3a/capn12纯合突变斑马鱼（补充信息，图S8c）。同样，将三条基因中均携带不同突变的两条斑马鱼杂交，可获得三基因双等位突变体（补充信息，图S8d）。综上，这些结果证明单倍体囊胚细胞介导的半克隆方法能够高效制备多重突变斑马鱼，从而极大加快多重突变斑马鱼的构建进程。

我们接下来探究了通过将DNA构建体插入内源基因实现精准基因编辑在单倍体囊胚中是否可行，以及这一技术能否进一步培育出敲入半克隆斑马鱼。为此，我们首先将Cas9蛋白、sgRNA和huc-mCherry敲入质粒（补充信息图S9a）共注射到PG单倍体胚胎中。受精后1天（dpf），仅有不到2.0%的注射胚胎表现出红色荧光，这表明通过合子注射培育敲入斑马鱼的效率较低。为了筛选出基因敲入概率高的嵌合囊胚作为供体，我们建立了预筛选方案（补充信息图S9b，策略B），将每个单倍体囊胚一分为二，其中一半进行PCR分析，对应的另一半则在4℃下保存，以备后续注射使用。在300个注射的PG单倍体胚胎中，约90.0%发育至囊胚阶段，PCR分析证实有4个胚胎为mCherry阳性；因此，我们将对应的另一半单倍体囊胚细胞用作卵母细胞注射的供体（补充信息图S9c）。在83个重构胚胎中，11个半克隆胚胎中有4个在2天（dpr）时表现出红色荧光（图1g）；其中2个发育至成体阶段（图1h；补充信息图S9d），且这2只杂合敲入半克隆斑马鱼成功将遗传性状传递给了F1代后代（补充信息图S9e、f）。由此可见，将半克隆技术与预先筛选具有特定遗传性状的囊胚相结合，能够高效培育出杂合敲入斑马鱼。

尽管半克隆技术能够高效获得基因编辑斑马鱼，但由于将CRISPR-Cas9直接注射到1细胞单倍体胚胎中，供体囊胚细胞存在基因型嵌合现象，这些首建个体携带不同的基因型。为了获得具有明确基因缺失的半克隆斑马鱼，我们设计了一种核移植-半克隆（NT-SC）策略（图1i，策略C），其中基因编辑的单倍体囊胚细胞通过核移植实现克隆扩增。为验证这一方法，我们研究人员尝试培育出capn12基因3号外显子缺失的斑马鱼。将Cas9蛋白与两条靶向capn12基因3号外显子的单向导RNA（sgRNA）（补充信息图S10a）共同注射到Tg(sox17:GFP)品系1细胞期的PG单倍体胚胎中。在囊胚期，对每个胚胎的一半进行PCR筛选，以鉴定编辑效率高的胚胎。在检测的16个单倍体胚胎中，有4个表现出高编辑效率（补充信息图S10b）。随后，将仅出现截短条带的3号胚胎作为供体，利用紫外线灭活的Tg(kdrl:mCherry)品系鱼卵作为受体进行克隆。从15个重构胚胎中，共获得7个克隆囊胚（核移植囊胚，NT-blastulas）（图1j）。将每个核移植囊胚一分为二进行平行处理：一半进行PCR和测序分析，另一半保存在L-15培养基中并置于4℃环境下过夜。测序分析证实，2号核移植囊胚携带预期的3号外显子缺失（+39 bp，–339 bp），将其剩余部分作为供体注射到AB品系鱼的卵母细胞中（图1k；补充信息图S10c）。值得注意的是，保存的细胞仍保留有分裂能力，研究人员选取末期分裂细胞作为供体。在40个核移植-半克隆（NT-SC）重构胚胎中，12个发育至受精后1天（1 dpr）（补充信息图S10d），其中10个呈现绿色荧光但无红色荧光，表明NT-SC重构成功。有6个胚胎发育至受精后5天（5 dpr），且形态正常（图1l）。研究人员进行基因分型分析，证实所有这些NT-SC胚胎均携带与2号核移植胚胎完全一致的突变等位基因（图1m）。重要的是，有4条斑马鱼存活至成体阶段，包括2条雄性和2条雌性（图1n），且均为二倍体（补充信息图S10f）。对这些成体进行互交繁殖，获得了capn12基因3号外显子缺失的纯合子F1代后代（图1o、p）。综上，这些结果表明，NT-SC策略可高效培育出具有特定基因型的斑马鱼；通过雄性和雌性半克隆个体间的后续繁育，可在F1代获得携带纯合性状的斑马鱼，与传统策略相比，至少节省了一代繁育时间。

将CRISPR/Cas9细胞质注射到受精卵中已被广泛应用于制备基因编辑斑马鱼。然而，由于斑马鱼早期胚胎快速的卵裂动态，所获得的斑马鱼通常为体细胞和生殖系嵌合体¹⁴。本研究中，我们利用囊胚细胞介导体细胞半克隆技术，解决了所有这些技术瓶颈。本半克隆系统结合了供体囊胚细胞的冷冻保存、基于PCR的供体预筛选以及核移植介导的囊胚细胞扩增，为斑马鱼的遗传分析提供了一个稳定可靠的平台。我们设计了三种不同的实验策略以适配多样的实验需求（补充资料表S7）。策略A（补充资料图S7a）技术操作简便，以高嵌合率的囊胚作为供体，适用于能高效制备高嵌合胚胎的实验方案，如常规基因敲除。策略B（补充资料图S9b）在供体胚胎筛选环节增加了基于PCR的预筛选步骤，通过筛选基因编辑细胞比例最高的囊胚作为适宜供体，该策略适用于基因敲入实验。策略C（图1i）可制备具有预定基因型的半克隆斑马鱼，但需要更复杂的实验操作，该流程适用于精准基因编辑应用，包括特定位点的点突变。下一阶段的挑战是建立稳定的斑马鱼单倍体胚胎干细胞（haESCs），将其作为精子替代物以支持半克隆斑马鱼的培育。由于这些体外培养的细胞可进行基因修饰，它们有望进一步提高基因编辑动物的制备效率。