标题：Neu1 deficiency is associated with reduced nicotine responsiveness and dopamine D3 receptor downregulation in zebrafish

期刊：Fish Physiol Biochem (2026)

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118985

摘要

尼古丁通过多巴胺能信号传导引发显著的神经和行为激活。然而，调控尼古丁敏感性的潜在分子机制仍知之甚少。本研究以斑马鱼这一脊椎动物模型为对象，探究了溶酶体唾液酸酶 Neu1 和神经聚糖聚唾液酸（PSA）在尼古丁诱导反应中的作用。蛋白质免疫印迹分析显示，急性尼古丁暴露后，斑马鱼大脑中 PSA 水平降低，且 neu1 表达显著上调。行为学实验结果表明，与野生型斑马鱼相比，Neu1 基因敲除（neu1-KO）斑马鱼对尼古丁致死效应的耐受性增强，且尼古丁诱发的游泳兴奋反应减弱。基于 c-Fos 表达评估的尼古丁诱导神经元激活，在 neu1-KO 斑马鱼中显著降低。基因表达分析显示多巴胺能相关基因表达发生改变信号传导，包括neu1基因敲除斑马鱼中drd3表达的降低。药理学实验表明，阻断多巴胺D2/D3受体可抑制尼古丁诱导的野生型斑马鱼的游动兴奋，而选择性多巴胺D3受体激动剂处理则能部分挽救neu1基因敲除斑马鱼中观察到的尼古丁反应性减弱现象。尼古丁诱导的c-Fos激活主要发生在下丘脑的多唾液酸阳性神经元中，下丘脑是一个与多巴胺能信号传导相关的脑区。这些研究结果表明，Neu1介导的多唾液酸降解可能调控多巴胺D3受体依赖性的尼古丁敏感性。我们提出一个概念模型，即尼古丁诱导的Neu1激活可能导致多唾液酸水平降低以及多巴胺D3受体相关信号传导的改变，进而影响尼古丁诱导的神经和行为激活的阈值。

关键词： 神经氨酸酶1 · 尼古丁敏感性 · 斑马鱼 · 多巴胺D3受体 · 多唾液酸

引言

鱼类行为是生理状态和环境响应性的综合指标。它与生长、摄食、避害及社交等生存策略密切相关。因此，行为分析作为一种无创且有效的手段，已被广泛应用于鱼类生理学研究中这是一种评估机体内部生理状态变化的方法。由于行为是由代谢、免疫和感觉反应等多个生理系统整合产生的，因此该方法在评估整个机体对遗传和环境扰动的反应方面尤为有效。鱼类对水环境中化学物质的行为反应被视为其化学敏感性和整体健康状况的重要生理指标。这类反应已被广泛应用于毒理学、生态学以及水产养殖相关研究中，作为反映鱼类状况的敏感指标。

唾液酸聚糖是位于非还原端的唾液酸糖结合物。唾液酸聚糖是存在于多种鱼类组织中的基本分子成分，在维持细胞表面环境和调节对外界刺激的反应性方面发挥着关键作用（Jin 等人，2015；Yamakawa 等人，2018）。凭借其结构多样性，唾液酸聚糖参与细胞间相互作用、分子识别，并调节细胞表面受体的可及性。在神经聚糖中，聚唾液酸（PSA）——一种由α2,8-连接的唾液酸残基组成的线性聚合物，主要与神经细胞粘附分子（NCAM）结合——已知在调节神经系统的神经元可塑性、细胞间相互作用和神经递质反应性方面发挥关键作用（Acheson 等人，1991；Hayakawa 等人，2023）。聚唾液酸水平的变化会影响突触功能和神经兴奋性，凸显了其在神经生理学中的重要性（Muller 等人，1996；Bonfanti 和 Theodosis，2009）。

唾液酸酶是一种降解聚糖的酶，可从唾液酸聚糖的非还原末端切割唾液酸残基。脊椎动物中已鉴定出四种唾液酸酶（Neu1、Neu2、Neu3 和 Neu4），它们的亚细胞定位和底物特异性各不相同（Shiozaki 等人，2019）。Neu1 主要定位于溶酶体，参与糖蛋白和寡糖的降解（Shiozaki 等人，2019）。它可通过溶酶体胞吐作用易位至细胞表面，在细胞外参与包括多唾液酸（PSA）在内的糖结合物的去唾液酸化作用（Uemura 等人，2009；Annunziata 等人，2013；Tsuji 等人，2025）。通过这些细胞内和细胞外的活性，Neu1 被认为会影响组织层面的生理功能，而非仅作为溶酶体酶发挥作用。降解酶。在鱼类中，Neu1 已在多个物种中得到鉴定和表征，表明其具有高度的进化保守性（Manzoni 等人，2007；Ryuzono 等人，2016；Honda 等人，2020）。这种保守性表明 Neu1 承担着在脊椎动物进化过程中得以保留的基本生理功能。

在早期的一项研究中，我们利用基因组编辑技术构建了 Neu1 基因敲除斑马鱼模型，并证实 Neu1 的缺失会在个体层面导致生理和行为特征发生显著改变（冈田等人，2020）。此外，在 Neu1 基因敲除（Neu1-KO）斑马鱼中，Neu1 缺乏不仅会改变多种组织中复合糖结合物的组成，还会对鱼类生理的多个方面产生影响。这些变化为探究糖代谢紊乱如何影响机体层面的表型提供了极具价值的体内模型。值得注意的是，Neu1-KO 斑马鱼对致病菌感染的易感性降低，这表明宿主与病原体的相互作用以及免疫相关的生理反应发生了改变（笹下等人，2022；石井等人，2025）。同时，Neu1-KO 斑马鱼对异种鱼类表现出更强的探索兴趣，这一现象与多巴胺 D1 受体介导的多巴胺能激活增强有关（池田等人，2021；辻等人，2025）。这些研究结果表明，Neu1 缺乏会广泛影响多巴胺能信号传导以及动机或刺激驱动的行为输出。此外，在 Neu1-KO 斑马鱼的大脑中观察到的胶质细胞激活现象，也反映出其神经和生理微环境发生了变化（池田等人，2022）。综合来看，这些研究结果表明 Neu1 在维持鱼类的生理稳态和行为调节方面发挥着广泛的作用。

尽管取得了这些进展，但 Neu1 缺乏症引发的唾液酸糖代谢改变如何影响机体对外源化学物质的行为反应，目前仍不明确。在水生生态系统中，鱼类持续接触种类繁多的天然和人为源化学物质，它们对这些物质做出恰当反应的能力，对于维持正常生理功能至关重要。水生环境中存在的低分子量化合物可通过鳃和体表被吸收，进而导致运动活性和行为模式发生改变（Erickson 等人，2006；Dutra Costa 等人）2020年）。因此，行为变化反映了生理状况、刺激敏感性和整体健康状态。基于行为反应的化学暴露检测被广泛视为鱼类生理学和环境生物学中的重要评估体系。因此，评估转基因鱼的化学敏感性有助于揭示聚糖代谢的分子水平改变如何转化为机体水平的生理结果。

尼古丁（Nco）是一种植物来源的低分子生物碱，鱼类可能在水生环境中接触到该物质。除了天然存在外，尼古丁及其相关化合物还可通过农业径流和人类活动进入水生系统（埃斯平多拉等人，2024）。以往研究表明，尼古丁暴露会导致鱼类的游泳活动和探索行为发生剂量依赖性变化，因此尼古丁被广泛用作评估化学敏感性和行为反应性的标准测试物质（辛格等人，2016；弗罗尼科夫斯卡等人，2020）。值得注意的是，尼古丁在较宽的浓度范围内能引发可重复且可量化的行为反应，使其适用于不同遗传背景的比较分析。尤其是斑马鱼，非常适合此类研究，因为尼古丁可通过水体暴露的方式轻松施加，且其行为变化可进行定量评估，这使得斑马鱼成为鱼类行为生理学研究中广泛应用的模式生物。

在本研究中，我们探究了Neu1缺陷型斑马鱼对水中化学刺激的行为反应性。行为分析被用作反映整体生理状态的指标，同时以Nco作为代表性化学刺激，对比Neu1缺陷型与野生型（WT）斑马鱼的化学敏感性及行为反应。该研究聚焦于行为表现，无需依赖侵入性测量即可评估完整生物体的生理反应。本研究旨在阐明Neu1缺陷及其引发的PSA动态变化，如何影响神经信号传导以及对环境化学刺激的行为反应。

结果

Nco暴露后斑马鱼大脑中唾液酸糖蛋白的变化

为探究Nco暴露对斑马鱼大脑唾液酸化糖蛋白组成的影响，将斑马鱼暴露于2.5毫克/升的Nco环境中15分钟，随后取其大脑进行凝集素印迹分析。通过MAM凝集素检测的α2,3-连接唾液酸糖蛋白，以及通过SSA凝集素检测的α2,6-连接唾液酸糖蛋白，其组成均未因Nco暴露而发生改变（图1A、B）。接着，使用抗PSA抗体通过蛋白质印迹法评估含PSA蛋白的变化。Nco暴露显著降低了斑马鱼大脑中的PSA水平（(p<0.05)；图1C）。

在斑马鱼大脑中，PSA 被 Neu1 唾液酸酶切割（Tsuji 等人，2025）。因此，我们检查了Nco暴露后neu1基因的表达。Nco暴露显著增加了neu1 mRNA表达（(p<0.05)；图1D）。相比之下，Nco处理后PSA合成酶St8sia2的mRNA水平不变，而另一种PSA合成酶St8sia4的表达显著降低（(p<0.05)；图1E）。此外，编码核心多唾液酸化蛋白NCAM的基因的表达，包括ncam1a和ncam1b，保持不变（图1E）。总之，这些结果表明Nco暴露诱导斑马鱼大脑中PSA水平的降低，这可能是由PSA降解增加驱动的通过Neu1上调和通过St8sia4下调减少PSA合成。

图1.（C）中PSA和β-Actin条带强度后多唾液酸水平的变化被量化，尼古丁暴露在斑马鱼大脑中。A-C代表性凝集素和结果显示为相对于斑马鱼大脑提取物印迹和免疫印迹分析的PSA/β-Actin水平，在未处理的斑马鱼中的值。每组(n=5)。减少Nco暴露。Aα2,3连接的唾液酸糖蛋白D，E使用山竹凝集素（MAM）检测到的（D）neu1和（E）的相对mRNA表达水平，B PSAbiosynthesis-related基因（st8sia2，st8sia4，ncam1a和α2,6连接的唾液酸糖蛋白，使用ncam1b的凝集素检测到的Nco暴露后斑马鱼大脑中。用sion水平检测到的表示sieboldiana（SSA）和（C）的PSA水平被归一化为ef1α的水平，并表达了重新抗PSA抗体。β-Aca车辆处理过的对照(n=6)不显著

Nco暴露对neu1-KO斑马鱼游泳行为的影响

由于Nco暴露改变了neu1表达和PSA水平，进一步检查了neu1-KO斑马鱼的Nco反应性（图2A）。WT和neu1-KO斑马鱼在0、2.5、7.5和10 mg/L的浓度下暴露于Nco，10分钟行为记录期间的存活率如图2B所示。WT斑马鱼在Nco浓度较高时存活率明显下降，在7.5和10毫克/升浓度下观察到完全死亡。相比之下，neu1-KO斑马鱼对Nco表现出更高的耐受性，在7.5毫克/升时存活率保持100%，在10毫克/升时存活率约为57%。这些结果表明，Neu1缺陷降低了对Nco诱导的致死效应的易感性。

图2 .尼古丁暴露对野生型（WT）和神经1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼行为学影响的实验，其中野生型和neu1-KO斑马鱼暴露于不同浓度的烟碱（Nco）。A 用于侧视游泳行为分析的水箱示意图。水柱垂直分为上下两层，用于游泳行为的空间分析。B 暴露于递增浓度烟碱（0、2.5、7.5和10 mg/L）的野生型和neu1-KO斑马鱼在10分钟内的存活率记录。C 游泳轨迹的代表性热图，颜色强度表示游泳行为的密度。D 行为记录期间的总游泳距离。E 水箱上层的游泳距离。F 在上层游泳的时间。G 兴奋型游泳行为的持续时间。不同字母表示组间存在统计学显著差异。(n=6)

随后通过侧视录像分析了游泳行为。神经丝蛋白（Nco）的反应性主要通过两种典型的行为反应来评估，即上层游泳行为增加和兴奋型游泳行为。该代表性游泳轨迹的热图如图2C所示。在对照条件（0毫克/升异氰尿酸）下，野生型和neu1基因敲除斑马鱼均主要占据鱼缸的下部区域。暴露于2.5毫克/升异氰尿酸后，野生型斑马鱼在鱼缸上部区域的游泳活动增加，而neu1基因敲除斑马鱼仍主要局限于下部区域。在更高浓度的异氰尿酸（7.5和10毫克/升）处理下，由于异氰尿酸诱导的死亡，野生型斑马鱼无法检测到可测量的游泳轨迹。相比之下，neu1基因敲除斑马鱼仍保持存活并表现出在上层游泳活动随浓度增加而上升的趋势。总游泳距离的定量分析结果如图2D所示。在野生型斑马鱼中，在较高的 Nco 浓度下，总游泳距离略有下降。与（对照组相比），neu1-KO 斑马鱼在 10 毫克/升 Nco 浓度下的总游泳距离显著降低与未用Nco处理的斑马鱼相比（((p<0.05)) ( (F=4.139) (p=0.02)，单因素方差分析）。上层游动距离如图2E所示。暴露于2.5 mg/L Nco浓度的野生型斑马鱼，其上层游动距离与未用Nco处理的斑马鱼相比显著增加（((p<0.01)) ( (F=9.843)，(p=0.0005)，单因素方差分析）。这种上层游动距离的增加可能反映了Nco诱导的兴奋行为和/或焦虑样行为的减少。相反，neu1-KO斑马鱼在该浓度下未出现类似的增加，表明其对Nco的反应性减弱。在10 mg/L Nco浓度下，neu1-KO斑马鱼的上层游动距离有所增加。与这些发现一致，与未用Nco处理的斑马鱼相比，2.5 mg/L Nco浓度下野生型斑马鱼在水层上层的游动时间显著增加（((p<0.01)) ( (F=18.038)，(p<0.0001)，单因素方差分析），而neu1-KO斑马鱼在较低浓度下反应迟钝（图2F）。在10 mg/L Nco浓度下，neu1-KO斑马鱼在水层上层的游动时间延长（(p<0.01)；图2F）。兴奋型游动行为的持续时间如图2G所示。2.5 mg/L Nco浓度下，野生型斑马鱼的兴奋型游动行为显著增加（((p<0.01)) ( (F=21.489)，(p<0.0001)，单因素方差分析），而neu1-KO斑马鱼在该浓度下的兴奋型游动行为极少。10 mg/L Nco浓度下，neu1-KO斑马鱼的兴奋型游动持续时间显著增加（(p<0.01)；图2G），这表明引发Nco诱导的行为激活所需的浓度阈值发生了变化。斑马鱼的游动姿势、浮力控制或游动状态未出现明显异常在尼古丁暴露后，对存活的 neu1 基因敲除斑马鱼的膀胱功能进行了观察，并且在整个观察期间行为追踪均能正常进行。

图3. 斑马鱼大脑中尼古丁诱导的神经元激活。A 斑马鱼大脑矢状切面示意图。B-E 尼古丁暴露后野生型和neu1基因敲除斑马鱼大脑中c-Fos的免疫反应性，显示了多个脑区的神经元激活模式。图(n=6) 展示了各组间的统计学显著差异。F-H 尼古丁暴露后全脑c-fos mRNA的表达情况。展示了c-Fos荧光强度的定量分析结果以及c-fos mRNA的表达水平，均以未暴露于尼古丁的野生型斑马鱼为参照。比例尺为100微米。不同字母表示存在统计学显著差异。

基于c-Fos表达的Nco诱导神经元激活评估

为确认神经元对Nco暴露的激活反应，研究人员检测了野生型（WT）和neu1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼大脑中c-Fos的表达情况（图3A）。c-Fos是一种即刻早期基因，被广泛用作神经元活动的标志物（Hoffman等人，1993年）。WT和neu1-KO斑马鱼在收集大脑前，分别暴露于0或2.5 mg/L的Nco环境中15分钟。在无Nco刺激的基础条件下，WT和neu1-KO斑马鱼的c-Fos信号强度与分布具有可比性，在端脑、嗅球、间脑、下丘脑、视顶盖、小脑和延髓等主要脑区均检测到低水平表达（图3B、C）。两种基因型之间未检测到信号强度或空间分布的明显差异。暴露于2.5 mg/L的Nco后，WT斑马鱼的整个大脑中c-Fos表达被显著诱导（图3D）。相比之下，与经Nco处理的WT斑马鱼相比，neu1-KO斑马鱼的c-Fos表达明显减弱，信号强度降低且空间分布更局限（图3E）。荧光信号强度定量分析显示，Nco处理显著提高了WT斑马鱼下丘脑（(F=87.371)、(p<0.0001)）、端脑（(F=14.096)、(p=0.0015)）和间脑（(F=370.099)、(p<0.0001)）中的c-Fos免疫反应性（单因素方差分析），而neu1-KO斑马鱼中未观察到显著增加（图3F-H）。与这些发现一致，实时PCR分析表明，Nco暴露后WT斑马鱼的c-fos mRNA表达显著升高，而neu1-KO斑马鱼中则无此变化（单因素方差分析；图3I）。这些结果表明，WT和neu1-KO斑马鱼的基础神经元活动相当，但Nco诱导的神经元激活在neu1-KO斑马鱼中显著低于WT斑马鱼，这与它们对Nco行为敏感性降低的结果相符。

Nco诱导的PSA阳性神经元中c-Fos的激活

为进一步探究Nco暴露与PSA水平之间的关系，我们检测了野生型（WT）和neu1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼大脑中PSA的分布情况。与之前的研究结果一致（Tsuji等人，2025），neu1-KO斑马鱼下丘脑的PSA免疫反应性显著高于野生型斑马鱼（(p<0.05)；图4A）。结合图1C中Nco暴露可降低PSA水平的结果，我们对暴露于Nco的斑马鱼（2.5毫克/升，15分钟）的大脑进行了PSA免疫染色。共定位分析显示，下丘脑内c-Fos信号与PSA阳性神经元的信号重叠（图4B）。这些研究结果表明，Nco诱导的c-Fos激活主要发生在下丘脑的PSA阳性神经元群体中，同时也提示PSA动态的改变可能是neu1-KO斑马鱼中Nco敏感性降低的原因之一。

Nco 暴露后烟碱型乙酰胆碱受体与多巴胺受体基因的表达

为了确定 neu1KO 斑马鱼中 Nco 敏感性的改变是否与受体的变化相关基因表达方面，研究人员检测了烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）和多巴胺受体的mRNA水平。野生型（WT）和neu1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼之间，烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因（chrna4b、chrna6和chrna7a）的基础表达水平无显著差异（图5A），这表明Neu1缺乏并未影响烟碱型乙酰胆碱受体的基础表达。

接下来，我们重点研究了多巴胺能系统，因为已知其参与Nco诱导的兴奋过程，且PSA在调节多巴胺能信号传导中也发挥已知作用。对多巴胺受体基因表达的分析显示出基因型依赖性差异（图5B）。与野生型（WT）相比，neu1-KO斑马鱼中drd1a、drd1b、drd2b、drd4a、drd4b和drd5的表达未发生变化，但drd2a的表达出现轻微但显著的降低，drd3的表达则显著降低（(p<0.01)；图5B）。

为了鉴定对Nco刺激有响应的drd2a和drd3多巴胺受体基因，本研究在野生型斑马鱼中检测了Nco暴露对多巴胺受体表达的影响（图5C）。Nco处理（2.5 mg/L，15分钟）显著提高了drd2a和drd3的mRNA水平((p<0.05))，表明drd2a和drd3是斑马鱼中对Nco有响应的基因。酪氨酸羟化酶（TH）的免疫反应性标记了下丘脑的多巴胺能神经元（Tsuji 等人，2025）。对N刺激的野生型斑马鱼下丘脑进行免疫染色后，观察到c-Fos阳性细胞与TH信号存在部分重叠（图5D）。此外，在c-Fos阳性细胞附近常能检测到TH阳性信号。这些发现表明，drd2a表达改变，尤其是drd3表达改变，可能与neu1基因敲除斑马鱼中观察到的Nco反应性变化有关。

图4 .尼古丁诱导的多唾液酸阳性神经元在暴露于低浓度尼古丁后的下丘脑神经元激活，合并图像显示下丘脑区域的空间分布。A 野生型（WT）和神经激肽1敲除（neu1-KO）斑马鱼下丘脑的免疫组化图像，神经元激活与多唾液酸（PSA）阳性之间的代表性关联。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。PTN为后结节核；HC为下丘脑室周复合体。荧光强度以野生型（WT）值为基准表示。B 野生型斑马鱼暴露于低浓度尼古丁后，c-Fos（红色）和多唾液酸（PSA）（绿色）的双重免疫荧光染色，合并图像显示神经元激活与PSA阳性神经元的空间关联。比例尺，100微米

图5 .野生型与neu1基因敲除斑马鱼多巴胺受体基因表达的对比分析。A、B 野生型（WT）和neu1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼大脑中（A）烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因及（B）多巴胺受体的相对mRNA表达水平。(n=6)。C Nco暴露对斑马鱼大脑多巴胺受体基因表达的影响。将WT和neu1-KO斑马鱼暴露于2.5 mg/L的Nco中15分钟后收集脑组织。mRNA表达水平以actb为参照进行标准化，并以WT溶剂对照组的表达水平为基准呈现。n.s.表示无显著差异。(n=6)。D Nco暴露（2.5 mg/L）15分钟后收集脑组织，对WT斑马鱼大脑中c-Fos（红色）和酪氨酸羟化酶（TH；绿色）进行双重免疫荧光染色。细胞核用DAPI复染。箭头指示Nco处理后WT斑马鱼中c-Fos与TH信号重叠（共定位）的区域。HC为室周下丘脑复合体。比例尺为100微米

图6.对各组处理的野生型斑马鱼游泳行为进行代表性分析。n.s.，无显著差异。(n=6) 单独使用 Nco 或 Nco 联合氟哌啶醇处理。B 斑马鱼总游泳量。野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼在行为测试前通过水体暴露法用利培酮（300 微克/升）或氟哌啶醇（2.5 微摩尔）预处理 30 分钟，随后转移至含 Nco（2.5 毫克/升）的实验鱼缸中。游泳行为记录 10 分钟。A 野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼的代表性游泳轨迹距离。C 上层游泳距离。D 野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼的行为诱导反应时间。图 6 多巴胺受体拮抗剂对尼古丁暴露斑马鱼的影响单独使用 Nco 或 Nco 联合氟哌啶醇处理。B–E 定量分析单独使用 Nco 或 Nco 联合氟哌啶醇处理的野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼的游泳行为。B 上层游泳距离。C 上层游泳距离。D 兴奋型游泳行为持续时间。E 兴奋型游泳行为持续时间。F 单独使用 Nco 或 Nco 联合利培酮处理的野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼的代表性游泳轨迹。G–J 定量分析单独使用 Nco 或 Nco 联合利培酮处理的野生型和 neu1 基因敲除斑马鱼的游泳行为。G 总游泳距离。H 上层游泳距离。I 上层游泳时间。J 兴奋型游泳行为持续时间。不同字母表示存在统计学显著差异

D2/D3受体拮抗作用对野生型斑马鱼中Nco诱导行为的影响

为进一步评估多巴胺受体亚型在Nco诱导的行为反应中的作用，对野生型斑马鱼分别用氟哌啶醇和利培酮（对D2受体具有更高亲和力的多巴胺D2/D3受体拮抗剂，Tateno等人，2018年）进行处理，并分析了它们在Nco暴露（2.5毫克/升）下的反应。在野生型和neu1基因敲除斑马鱼中，与单独使用Nco的组相比，氟哌啶醇预处理并未显著影响Nco处理组的总游泳距离、上层游泳距离或上层停留时间（图6A-D）。相反，在野生型斑马鱼中，与单独使用Nco处理的组相比，氟哌啶醇联合处理显著降低了兴奋性游泳行为的持续时间((p<0.01))（(F=32.649)、(p<0.0001)，单因素方差分析；图6E），但在neu1基因敲除斑马鱼中未出现该现象。利培酮处理仅在野生型斑马鱼中对兴奋性游泳行为产生了类似的抑制作用((p<0.01))（(F=728.126)、(p<0.0001)，单因素方差分析；图6J），而上层游泳距离和上层停留时间未发生变化（图6F-I）。这些结果表明，D2/D3受体拮抗作用可降低斑马鱼对Nco的行为敏感性，表现为Nco诱导的兴奋性游泳行为减弱，且未显著影响整体运动活性或垂直定位。

多巴胺D3受体激活对neu1KO斑马鱼尼古丁反应性的影响

基于这些研究结果，我们探究了多巴胺D3受体在neu1-KO斑马鱼对Nco敏感性降低中的作用。为了确定D3受体信号传导减弱是否会导致Nco反应性降低，我们检测了选择性D3受体激动剂PD128907对经Nco处理（2.5毫克/升）的野生型（WT）和neu1-KO斑马鱼的影响（图7A）。PD128907处理并未显著改变总游动距离（图7B）。相比之下，与仅用Nco处理的斑马鱼相比，经Nco联合PD128907处理的neu1-KO斑马鱼，其上层游动距离（((p<0.01))（(F=47.742)、(p<0.0001)，单因素方差分析；图7C）和停留时间（((p<0.01))（(F=84.054)、(p<0.0001)，单因素方差分析；图7D）均有所增加。PD128907处理未对野生型斑马鱼的行为反应产生显著影响。我们还分析了兴奋型游动行为，但在本实验条件下，PD128907处理并未显著延长野生型和neu1-KO斑马鱼的兴奋型游动行为持续时间（图7E）。这些研究结果表明，多巴胺D3受体的激活可部分恢复neu1-KO斑马鱼中观察到的Nco诱导的行为反应减弱，这支持了多巴胺D3受体相关信号传导在Nco行为反应改变中的作用。

图7. D3受体激动剂对暴露于尼古丁的野生型和neu1-KO斑马鱼运动轨迹的影响 野生型和neu1-KO斑马鱼单独或联合PD128907处理后进行行为学检测。B 行为记录期间的总游动距离。C 水箱上层的游动距离。D 在上层的游动时间。E 兴奋性游动的持续时间。 斑马鱼在行为测试前通过水体暴露用选择性多巴胺D3受体激动剂PD128907（10 µM）预处理30分钟，随后转移至含有尼古丁（2.5 mg/L）的实验水箱，记录10分钟的行为。A 代表性游动轨迹。不同字母表示各组间存在统计学显著差异。n.s.，无显著性差异。(n=6)

讨论

在这项研究中，我们调查了PSA和溶酶体唾液酸酶Neu1在调节斑马鱼Nco敏感性中的作用，以及潜在的分子和行为机制。我们证明，Nco暴露选择性地降低了伴随neu1表达上调的PSA水平。使用neu1-KO斑马鱼，我们进一步表明，Neu1缺乏减弱了Nco诱导的致死性、行为兴奋和神经元激活，正如c-Fos表达所评估的那样。重要的是，我们确定多巴胺D3受体相关信号作为参与Nco反应的潜在下游通路，并发现D3受体的药理学激活部分拯救了neu1-KO中的特定Nco反应行为斑马鱼。综上，这些研究结果支持这样一种模型：Neu1 介导的唾液酸（PSA）动态变化可能通过多巴胺 D3 受体相关信号通路，影响 Nco 诱导的神经和行为激活阈值。

虽然此前尚未有关于多唾液酸（PSA）与神经细胞黏附分子（Nco）暴露之间关系的报道，但已知 PSA 会与神经细胞黏附分子（NCAM）结合，其强烈的负电荷可调节细胞间相互作用、突触可塑性以及神经元回路动态（Acheson 等人，1991；Bonfanti 与 Theodosis，2009）。PSA 还在功能上与多种神经调节系统相互作用，包括多巴胺能系统以及BDNF信号通路，进而影响受体激活和下游信号转导（Yamada等人，2020年）。从这一角度来看，本研究中观察到的Nco诱导的PSA水平降低，可能代表了Nco通过调节细胞外聚糖环境来重塑神经元兴奋性和行为输出的一种机制。

Neu1 通常被认为是一种溶酶体唾液酸酶。然而，在哺乳动物和鱼类中不断积累的证据表明，Neu1 可通过溶酶体胞吐作用易位至细胞表面（上村（Uemura）et al. 2009），该酶可切割包括多聚唾液酸（PSA）在内的细胞外唾液酸化糖结合物。尽管已有研究表明鱼类神经氨酸酶1（Neu1）能切割多种唾液酸连接方式，包括α2,3-连接的唾液酸糖蛋白（Ryuzono et al. 2016; Okada et al. 2020），但我们的凝集素印迹分析显示，在Nco暴露后，斑马鱼大脑中α2,3-或α2,6-连接的唾液酸化模式未出现可检测到的变化。这种选择性效应有力表明，在本实验条件下，多聚唾液酸（PSA）是Neu1参与Nco诱导神经反应的主要候选底物。多聚唾液酸（PSA）在学习和记忆等高级脑功能中发挥关键作用，而PSA稳态的失调与精神分裂症等人类神经精神疾病相关（Sato and Kitajima 2013）。另有研究发现，情绪障碍和孤独症谱系障碍患者体内神经氨酸酶1（NEU1）的表达存在异常。与这些研究结果一致，我们此前的研究表明，neu1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼表现出焦虑样行为和社交行为的改变（Ikeda et al. 2021），这说明Neu1介导的神经聚糖调控对脊椎动物的脑功能至关重要。本研究通过证实Nco敏感性是受Neu1–PSA信号通路影响的另一行为领域，进一步拓展了这一观点。

我们此前的研究表明，在neu1基因敲除斑马鱼中，多唾液酸（PSA）可调节多巴胺的可利用性，并调控依赖于多巴胺D1受体的社交行为（Tsuji等人，2025年）。相比之下，本研究提示，在尼古丁（Nco）诱导的兴奋过程中，多唾液酸（PSA）动态变化的改变可能会影响多巴胺D3受体介导的信号传导。多巴胺D3受体对多巴胺具有高亲和力，被认为可感知紧张性多巴胺水平（Kiss等人，2021年），因此作为多巴胺能信号传导的阈值调节因子发挥作用。本研究观察到的尼古丁反应性变化——即neu1基因敲除斑马鱼需要更高浓度的尼古丁才能表现出行为激活——表明，依赖于多唾液酸（PSA）的D3受体信号传导调控对尼古丁反应性行为阈值的建立具有重要作用。与这一可能性相符的是，PD128907对D3受体的激活可部分增强neu1基因敲除斑马鱼中尼古丁诱导的行为反应。然而，这种挽救效果并不完全，尼古丁反应性未恢复至野生型（WT）水平，且兴奋性游泳行为也未受到显著影响。因此，D3受体信号传导的减弱可能是尼古丁敏感性降低的原因之一。在neu1基因敲除斑马鱼中也观察到了这一现象，不过其中可能还涉及其他分子和神经机制。据我们所知，这些研究结果首次提供了初步证据，表明PSA可能以情境依赖的方式对多巴胺受体亚型相关的信号传导产生差异性影响。

我们的数据进一步表明，下丘脑可能是Neu1–PSA–多巴胺相互作用的关键解剖位点。在此区域显著观察到Nco诱导的c-Fos激活，且c-Fos信号与PSA阳性神经元共定位。鉴于多巴胺D3受体在脊椎动物下丘脑中表达（Pagano等人，2016），这些发现支持了一种模型，即下丘脑回路中依赖于PSA的D3受体信号传导调节参与了Nco诱导的行为激活。

neu1基因敲除斑马鱼中drd3表达降低的潜在机制尚不清楚。然而，我们之前的研究已证实，与野生型斑马鱼相比，neu1基因敲除斑马鱼的大脑多巴胺水平显著升高（Tsuji等人，2025）。在物质使用障碍中，慢性多巴胺升高会诱导D2样受体（包括D3受体）发生代偿性下调或脱敏（Volkow等人，2019），进而导致多巴胺敏感性降低。因此，在neu1基因敲除斑马鱼中观察到的drd3表达降低，可能是对持续升高的多巴胺水平产生的代偿性适应。从这个角度来看，neu1基因敲除斑马鱼可能代表一种遗传固定的多巴胺低敏感性或类耐受状态，类似于成瘾过程中观察到的神经适应性改变。尽管本研究中drd2a表达略有降低，而我们之前的报告中drd5也呈下降趋势（Tsuji等人，2025），但各研究中一致的多巴胺能改变均为drd3表达的显著降低。

多巴胺敏感性降低是Nco成瘾以及药物滥用、赌博障碍等其他成瘾行为的特征。尽管此前没有研究将Neu1或PSA直接与成瘾相关表型联系起来，但我们的研究结果表明，Neu1表达改变或PSA动态变化可能会影响成瘾行为的易感性或发展进程。不过，这一假设需要利用鱼类和哺乳动物模型开展进一步研究加以验证。

本研究存在若干局限性。首先，尽管本研究证实了前列腺特异性抗原（PSA）水平降低与神经胆碱能（Nco）敏感性改变之间存在强相关性，但直接的因果证据仍有待确立。虽然本研究聚焦于神经氨酸酶1（Neu1）依赖性的PSA相关神经元信号通路改变，但PSA的合成与更新很可能受多种机制调控。未来研究需明确尼古丁暴露如何影响野生型（WT）和神经氨酸酶1基因敲除（neu1-KO）斑马鱼体内的PSA动态变化。其次，尽管神经胆碱能敏感性的多巴胺能调控机制可能在脊椎动物中保守存在，但不同物种的大脑结构和神经环路组织存在显著差异，因此需在其他动物模型中验证本研究结果。第三，神经氨酸酶1参与更广泛的溶酶体聚糖分解代谢过程。尽管本研究未观察到溶酶体功能障碍的证据，但溶酶体相关通路对神经胆碱能敏感性的潜在作用仍需在未来研究中进一步探究。第四，本研究仅聚焦于急性尼古丁暴露。未来需采用慢性低剂量尼古丁暴露的实验方案，以明确神经氨酸酶1是否也参与尼古丁的长期反应调控。

总之，我们提出了一个概念模型，即Nco暴露会诱导Neu1上调并改变PSA动态，进而影响多巴胺D3受体相关的信号传导，改变Nco诱导的神经和行为激活阈值。本研究表明，神经聚糖可能调节多巴胺受体特异性信号传导，并强调Neu1–PSA轴是调控Nco敏感性的潜在系统。我们的研究结果为多巴胺能阈值调节的分子机制提供了新见解，对理解脊椎动物的成瘾相关行为具有更广泛的意义。

材料与方法

鱼类

本研究团队在前期研究中通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术对RIKEN WT（RW）品系斑马鱼进行基因编辑，成功构建了Neu1缺陷型（neu1-KO）斑马鱼，该品系的neu1基因中引入了5个核苷酸的缺失（Okada等人，2020）。实验全程以RW品系作为野生型（WT）对照进行饲养与实验。为最大程度减少野生型与基因敲除（KO）斑马鱼在遗传背景上的差异，研究人员通过与RIKEN WT品系反复回交的方式对neu1-KO斑马鱼品系进行保种。 实验鱼饲养于2升的养殖缸中，养殖环境为实验室可控条件，采用14小时光照/10小时黑暗的光周期，每日投喂两次商品饲料（Otohime B2；日本东京丸仁日清饲料有限公司）。实验选用5月龄的青年成年斑马鱼，涵盖雌雄个体。所有涉及动物的实验流程均经鹿儿岛大学动物实验委员会审核批准，并严格遵循机构指导原则及相关法规开展。

Nco暴露后游泳行为变化分析

研究人员使用定制设计的透明亚克力水箱进行侧面行为记录，评估了NCO暴露下的斑马鱼游泳行为。行为检测在横截面为不对称梯形的水箱中进行，该水箱一侧壁为倾斜状，相对的另一侧壁保持垂直。水箱长28.5厘米、高14.5厘米、深7.5厘米（从前到后）。受梯形结构影响，水箱上边缘水平宽度为28.5厘米，下边缘水平宽度为24厘米，上下边缘宽度存在差异。为分析游泳行为的空间分布，研究人员将水柱均分为三个垂直区域，最上方的区域被定义为“上层”。将单条斑马鱼轻轻转移至注满水的实验水箱中，使其在暴露处理前短暂适应环境。随后直接向实验水箱中加入NCO。获得 0、2.5、7.5 或 10 mg/L 的最终浓度。这些浓度是根据斑马鱼反应的先前研究报告和实验观察确定的（Ponzoni 等人，2021年）。在行为记录期间（10分钟），鱼持续暴露于Nco中。每条鱼仅测试一次，且不在后续实验中重复使用。

使用一台垂直于实验鱼缸长轴摆放的数码摄像机（HDR-CX430，索尼，日本东京）从鱼缸侧面记录斑马鱼的游泳行为。斑马鱼被转移至鱼缸后立即开始视频录制。从录制的视频中量化分析各项行为参数，包括总游泳距离、上层游泳距离、上层停留时间以及兴奋游泳行为的持续时长。本研究中，尼古丁诱导的行为反应性主要通过两种典型行为反应进行评估：上层游泳行为增加与兴奋游泳行为。上层游泳行为通过游泳距离和上层停留时间进行评价。在斑马鱼新鱼缸行为实验中，尼古丁暴露后通常会观察到斑马鱼在鱼缸上层的游泳活动增加，这一现象通常与焦虑样行为减少以及行为唤醒水平升高相关。兴奋游泳行为被操作性定义为在水面观察到的一种刻板游泳模式，即斑马鱼头部向上游动，同时反复张合嘴巴。利用从单个游泳轨迹生成的热图可视化其游泳活动的空间分布。

使用行为追踪软件 ANY-maze（ANY-maze，美国伊利诺伊州）分析了游泳轨迹和行为参数。监测了Nco暴露后的存活情况，并计算了每种Nco浓度和基因型对应的存活率。

为评估药物对斑马鱼行为的影响，本研究使用了氟哌啶醇（一种D2/D3受体拮抗剂）、利培酮（一种D2/D3受体拮抗剂）和PD128907（一种D3受体激动剂）。将这些试剂溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后向水中加入氟哌啶醇（2.5微摩尔）、利培酮（300微克/升）或PD128907（10微摩尔）。暴露条件参考既往研究确定（Geng等人，2023；Tsuji等人，2025）。在水暴露实验中，二甲基亚砜的最终浓度为0.001%。每个实验均设置了含有相同浓度二甲基亚砜的相应溶剂对照组。药物暴露在一个10厘米×10厘米的独立水箱中进行，水深为5厘米。在上述条件下，将鱼暴露于每种药理试剂30分钟。暴露30分钟后，将鱼转移至行为测试水箱，并按上述方法记录其行为。

实时聚合酶链式反应分析

实时荧光定量PCR分析按照先前描述的方法进行（Tsuji等人，2025）。使用Sepasol-RNA I Super G试剂（日本京都Nacalai Tesque公司），按照制造商说明书从斑马鱼脑组织中分离总RNA。为消除基因组DNA污染，随后使用带有gDNA去除剂的ReverTra Ace qPCR RT预混试剂盒（日本东京TOYOBO公司）将提取的RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。采用StepOne实时荧光定量PCR系统（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）进行实时荧光定量PCR分析。扩增反应使用KOD SYBR Green PCR预混试剂盒（TOYOBO公司）完成。基因特异性引物列于补充表1中。将靶基因的表达水平以延伸因子1α（ef1α）或肌动蛋白β（actb）mRNA的表达水平进行标准化，这两种基因作为内参用于校正不同样本间RNA量和逆转录效率的差异。每次反应结束时通过熔解曲线分析验证PCR特异性。设置不加cDNA模板的反应作为阴性对照，以确认无非特异性扩增或污染情况。

免疫组织化学分析

按照之前描述的方法进行免疫组织学分析（Tsuji 等人，2025）。组织学检测时，收集斑马鱼脑组织并置于4.0%多聚甲醛中，4℃条件下固定过夜。固定完成后，将组织依次置于0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液（PBS）配制的10%、20%和30%蔗糖溶液中孵育，完成冷冻保护处理。含有0.02%叠氮化钠。随后将大脑包埋于5.0%琼脂糖（Agarose XP；日本东京NIPPON GENE公司产品）中，置于干冰/正己烷浴（-60℃）中快速冷冻，再使用CryoStar NX50冷冻切片机（日本东京PHC公司产品）切成20微米厚的切片。将冷冻切片固定在载玻片上，于0.01摩尔/柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中经微波处理1分钟进行热诱导抗原修复。随后使用照明系统（日本千叶TiYO公司产品）降低自发荧光。经山羊血清封闭后，将切片与一抗在4℃下孵育过夜，一抗包括抗Fos单克隆抗体（1:50，E-8；美国德克萨斯州Santa Cruz Biotechnology公司产品）、抗酪氨酸羟化酶（TH）多克隆抗体（1:100稀释，GTX113016，GeneTex公司产品）以及抗前列腺特异性抗原（PSA）单克隆抗体（1:200；2-2B克隆，德国达姆施塔特Merck公司产品）。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1.0微克/毫升）对细胞核进行复染。一抗孵育完成后，用相应的荧光标记二抗处理切片。使用荧光显微镜（德国Oberkochen市卡尔蔡司公司Apotome产品及日本大阪KEYENCE公司BZ-X1000产品）对免疫染色切片进行成像。使用ImageJ软件（美国马里兰州NIH产品）对荧光信号强度进行定量分析。

凝集素与蛋白质印迹分析

凝集素印迹和蛋白质印迹实验按先前描述的方法进行（池田等人，2021年）。将斑马鱼浸入冰水中麻醉，随后迅速取出其大脑。将脑组织在300微升含1.0% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，该缓冲液还添加了亮抑肽酶（10微克/毫升）、乙二胺四乙酸（1.0毫摩尔）和苯甲基磺酰氟（1.0毫摩尔）。匀浆使用生物粉碎机（Nippi，日本东京）进行操作。匀浆液经13200倍重力离心15分钟得到澄清，收集所得上清液作为蛋白质裂解液。蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上。在进行探针检测前，用1.0%牛血清白蛋白封闭膜片。对于凝集素印迹分析，将膜片与来自朝鲜槐（MAM，1微克/毫升）的生物素化凝集素共同孵育，日本东京的J-CHEMICAL公司产品，可识别α2,3-连接的唾液酸；以及来自接骨木花（SSA，1微克/毫升，J-CHEMICAL公司产品）的生物素化凝集素，可识别α2,6-连接的唾液酸。凝集素的结合情况通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素进行可视化检测。

进行免疫印迹实验时，将膜与针对前列腺特异性抗原（1:500，单克隆抗体，克隆735；中国台湾台北的 Abnova 公司）以及β-肌动蛋白（1:500，单克隆抗体，货号66,009–1g；美国伊利诺伊州罗斯蒙特的 Proteintech 公司）的一抗共同孵育。与一抗孵育完成后，用合适的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗处理膜。使用 ChemiDoc Touch Plus 成像系统（美国加利福尼亚州赫尔克里士的 Bio-Rad 公司）结合 EzWestLumi Plus 化学发光试剂（日本东京的 ATTO 公司）检测化学发光信号。

统计分析

结果以平均值±标准差表示。两组间的统计学显著性采用非配对Student t检验进行分析。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。