题目：Synchronized Imaging of Hydrogen Peroxide and Hydroxyl Radical in Pyroptosis and Epilepsy

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.76679

期刊：Advanced Science

摘要

在癫痫研究中，对活体内氧化应激进行实时可视化成像面临着巨大挑战，这主要是因为目前缺乏能够以高特异性选择性区分结构相似的活性氧（ROS）的工具。本文报道了一种双功能荧光探针HH，它可通过不同的识别机制分别检测过氧化氢H₂O₂和羟基自由基（·OH），并产生具有高灵敏度、高选择性和良好生物相容性的光谱分辨信号。HH能够对焦亡蛋白介导的细胞焦亡和戊四氮（PTZ）诱导的癫痫细胞模型中的氧化还原动态进行高分辨率、无干扰成像。此外，HH成功应用于PTZ诱导的斑马鱼和海藻酸（KA）诱导的小鼠癫痫模型中，揭示了癫痫样发作条件下活性氧水平的升高。值得注意的是，靶向活性氧的治疗干预显著调节了氧化状态，这证明了HH在治疗评估方面的潜力。本研究不仅填补了活性氧生物学和癫痫研究中关键的方法学空白，还为研究神经系统疾病和炎症疾病中的氧化还原调控提供了一个通用平台，同时也为相关机制研究和治疗研究提供了有力支撑。

引言

癫痫是最常见且难治的神经系统疾病之一，全球有超过7000万人患病，其特征为反复发作的自发性癫痫发作，这些发作会严重损害患者的生活质量，并增加神经退行性变、精神共患病及猝死的风险。尽管开展了大量研究，但由于癫痫病因具有异质性且受多种因素影响，其分子发病机制仍不明确。近年来，越来越多的证据表明，焦孔素介导的细胞焦亡（一种促炎性程序性细胞死亡形式）参与了癫痫的发生和进展过程。癫痫以及缺血性中风、创伤性脑损伤等其他中枢神经系统（CNS）病变。这一病理轴的关键驱动因素是氧化应激，其中活性氧（ROS），尤其是过氧化氢H₂O₂和羟自由基（∙OH），在触发神经炎症、线粒体功能障碍和神经元丢失方面发挥关键作用。H₂O₂是一种相对稳定且可扩散的ROS，在生理条件下作为氧化还原信号和细胞稳态的第二信使发挥作用。然而，在病理应激下，其过度积累会破坏氧化还原平衡，促进脂质过氧化，并使神经元更容易受到损伤。关键的是，H₂O₂参与芬顿反应，产生羟基自由基（·OH）——这是反应性和细胞毒性最强的活性氧（ROS）之一——它会无差别地氧化核酸、脂质和蛋白质等生物分子。越来越多的证据表明，羟基自由基会诱导不可逆的氧化损伤，加剧癫痫发作，还可能诱发癫痫发生。尽管H₂O₂和羟基自由基具有重要的生物学意义，但在活体系统中对它们进行实时、空间分辨的检测在技术上仍具挑战性。特别是，H₂O₂与羟基自由基在焦亡和癫痫病理过程中的时空相互作用仍知之甚少，这主要是由于缺乏能够在复杂生物环境中同时、选择性且实时监测二者的合适化学工具。

荧光探针已成为生物医学研究中不可或缺的工具，为监测活体内的分子动态提供了非侵入性、高灵敏度和实时性的能力。已有多种活性氧（ROS）响应型荧光探针被报道用于癫痫研究和氧化还原生物学研究（表S1），包括用于超氧化物(O₂{cdot-}))检测的双模式探针、用于过氧亚硝酸盐(ONOO^{-})检测的近红外（NIR）粘度敏感探针，以及用于焦亡通路中H₂O₂检测的比率型探针。然而，这些方法通常依赖于单一分析物检测或多探针组合，存在细胞共定位性差、药代动力学不一致以及信号输出重叠等问题——这些因素会降低数据的保真度，最终限制其在动态氧化还原生物学研究中的应用价值。近年来开发的多通道荧光探针在统一的分子框架内整合了多个特异性识别位点，可通过光谱独立的荧光通道同时监测多种生物分子。此类探针不仅有效规避了多探针组合的缺陷，还为疾病的早期诊断、疾病进程动态追踪和靶向治疗评估提供了高保真、多维的实时分子信息平台。尽管已有部分可同时检测两种活性氧的多通道或多功能荧光探针被报道（表S2），但大多数双通道探针主要针对其他活性氧对，如次氯酸/过氧亚硝酸盐（HOCl/ONOO⁻）或(H₂O₂ / HOCl)。截至目前，尚未见可同时成像H₂O₂和羟基自由基（·OH）的单一双通道荧光探针报道。为克服这些局限，我们合理设计了一种双功能荧光探针（命名为HH，图1），其整合了两种正交识别基序：用于选择性检测H₂O₂的芳基硼酸酯，以及对·OH具有响应性的羟基化芳香单元。反应后，HH生成两种结构不同的香豆素衍生物，各自表现出独立且无重叠的荧光发射，能够以高时空分辨率在活细胞和活体中同时、无干扰地检测H₂O₂和·OH。

本研究通过一系列体外和体内模型验证了探针HH的生物学效用。我们首先监测了焦孔素介导的细胞焦亡过程中的活性氧（ROS）动态，揭示了与细胞死亡相关的独特氧化特征。随后，我们将该探针应用于两种广泛使用的癫痫模型——戊四氮（PTZ）诱导的斑马鱼模型和红藻氨酸（KA）诱导的小鼠模型，以可视化癫痫发作过程中H₂O₂和羟基自由基（·OH）的实时氧化激增。值得注意的是，我们证实了氧化还原稳态的治疗性调控改变了探针读数，凸显了其作为评估治疗效果和探索作用机制的分子工具的潜力。总体而言，本研究不仅突破了癫痫与氧化还原生物学领域的关键技术壁垒，也为其在神经炎症、神经退行性疾病及氧化应激相关疾病研究中的更广泛应用奠定了基础。

结果与讨论

双响应荧光探针的设计与合成

为了实现对H₂O₂和羟基自由基（∙OH）的同时检测，我们理性设计了一种单分子双响应荧光探针，如图1所示。香豆素衍生物因其优异的光稳定性、高量子产率和良好的生物相容性，被选作荧光团骨架。为进一步提升光学性能，我们在香豆素母核中引入了四氢喹喔啉基团和五元吡咯烷环，从而增大了斯托克斯位移并提高了整体荧光亮度。此外，还引入了甲酯基团以改善水溶性和亲脂性（测得正辛醇-水分配系数log P为1.69），这有助于提升细胞通透性和成像性能。在合成中间体化合物1-A的过程中（方案S1），我们观察到其稳定性极差且易发生氧化降解。值得注意的是，C-3位（在化合物1-A中以高亮标注）易发生亲电加成反应，这与 Xian 等人此前报道的研究结果一致。借鉴Ma等人报道的基于亲电加成化学的羟基自由基选择性探针（方案S1中的化合物1-C），我们推测化合物1-B可通过芳香族羟基化反应与羟基自由基（∙OH）反应，随后与相邻的氰基发生分子内环化，生成具有荧光特性的香豆素衍生物。

传统上，香豆素类探针（方案S1中的化合物1-D）依赖于酚羟基保护的识别单元，在与分析物相互作用后，会发生氰化物介导的环化反应，产生强烈的荧光信号。在本研究的设计中，四氢喹喔啉和吡咯烷单元的结合使得所得香豆素衍生物具备可调的分子内电荷转移（ICT）特性。这种结构差异产生了两个不同的发射最大值，实现了光谱可分辨的双通道荧光。如图1a所示，最终探针命名为HH，整合了两种正交的识别机制：（i）羟基（·OH）触发的芳香族羟基化反应及后续环化生成HH-1，该产物呈现明亮的绿色荧光；（ii）诱导的硼酸酯氧化脱保护，随后环化形成HH-2，该产物发出强烈的红色荧光。值得注意的是，HH-1和HH-2的荧光发射之间存在106纳米的显著波长间隔，有效减少了光谱串扰，能够同时且光谱分辨地检测H₂O₂和羟基（·OH）。HH及其衍生物的完整合成路线见方案S2和S3。所有中间体和最终产物均通过(^{1} H)核磁共振、(^{13} C)核磁共振、红外光谱和高分辨质谱（HRMS）进行了全面表征（见图S27-S43）。

图1 a)  HH 同时检测 H₂O₂ 和 ∙OH 的工作机制。b) 监测红藻氨酸（KA）诱导癫痫模型中 H₂O₂和 ∙OH 水平的示意图。

我们获得双响应探针HH后，在生理相关条件下系统评估了其对H₂O₂和羟基自由基（∙OH）的光学行为。光谱测量在室温下于乙醇/磷酸盐缓冲盐水（EtOH/PBS）(v / v=2: 8)缓冲液中进行。加入H₂O₂后，HH的最大吸收峰从496纳米轻微蓝移至470纳米，同时在472纳米激发下，598纳米处出现显著的荧光增强（21倍，Phi=0.05)图S1）。相比之下，羟基自由基（∙OH）处理使吸收最大值从498纳米发生明显的紫移至440纳米（图2a）。荧光测量结果显示，492纳米处出现强烈的荧光开启信号（lambda_{ex}=440 ~nm)，强度增强超过180倍，(Phi=0.09)图2b）。值得注意的是，H₂O₂和羟基自由基（∙OH）响应产物的发射最大值相差超过100纳米，这使得在双荧光通道中能够以最小的光谱重叠实现明确区分。

我们接下来研究了 HH 与H₂O₂ 以及羟基自由基（∙OH）的反应动力学。如图 2c 所示，与羟基自由基的反应在 15 分钟内达到荧光饱和，而 H₂O₂触发的响应在 30 分钟时趋于平稳。此外，在对H₂O₂ 和羟基自由基（∙OH）产生响应后，该探针在连续激发下仍保持优异的光稳定性（图 S6）。为了验证其双功能H₂O₂对羟基自由基的响应性方面，首先将 HH 与H₂O₂（10 当量）预孵育，随后逐步加入 (Fe^{2+}) 以原位生成羟基自由基。这导致绿色和红色荧光信号 (lambda_{ex}=440 ~nm) 同时出现，且绿色荧光强度随 (Fe^{2+}) 浓度的增加而增强（图 S2）。另一方面，将探针与少量预先制备的羟基自由基反应后，再向体系中加入不同浓度的H₂O₂，也能在 492 nm 和 598 nm 处检测到双发射行为。这些发现有力证明，HH 能够通过两个独立的发射通道，在共存条件下分别检测 H₂O₂和羟基自由基，且不存在交叉干扰。如图 S3 所示，探针与 H₂O₂ 或羟基自由基完全反应后，再加入另一种分析物不会引起荧光信号的进一步变化。这表明探针的两个反应位点是相互独立的，不存在连续的交叉反应性。

为评估双响应探针HH的灵敏度，我们对每种活性氧（ROS）进行了剂量响应实验。如图2d所示，羟自由基（·OH）浓度的增加会导致492纳米处的荧光强度成比例上升，在4当量时实现了约180倍的增强。该响应在0–40摩尔浓度范围内表现出极佳的线性关系，计算得出的检测限（LOD）为4.9纳摩尔（图2e）。类似地，H₂O₂在598纳米处诱导了强烈的剂量依赖性荧光增强，线性范围达范围为0–100微米，检测限为18.6纳米（图2g、h）。这些数据证实了HH对和·OH均具有高灵敏度，其检测限适用于追踪生物样品中内源性活性氧的波动。针对一系列生物相关物种开展了选择性研究，包括活性氧、活性氮、活性硫物种（ROS/RNS/RSS）、金属离子、卤化物以及氨基酸（谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、甘氨酸、L-苏氨酸、组氨酸）。仅·OH和触发了显著的荧光响应，而其他所有分析物（过氧化氢叔丁基、一氧化氮、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸）均未引起可观测的变化（图2f、i及图S4、S5）。此外，在生理条件下，该探针对和·OH仍保持良好的响应性能。这些特异性研究验证了HH是一种性能稳定的双发射探针，能够分别、同时、灵敏且选择性地检测和·OH，为其在活细胞和体内模型中实时可视化活性氧动态奠定了坚实的应用基础。

图2在EtOH/PBS缓冲液中加入∙OH（10当量）或H₂O₂（10当量）(v / v=2: 8)30分钟后HH（10µm）的紫外可见吸收（a）和荧光发射（b）光谱。（c）在492和598nm处监测到添加∙OH（30当量）和H₂O₂（30当量）时HH（10µm）的相应时间依赖性荧光强度变化。（d，g）在EtOH/PBS缓冲液中滴定(cdot OH H₂O₂时HH（10µm）的荧光强度光谱(v / v=2: 8)（e，h）HH在492nm（e）和598nm（h）的荧光强度分别作为∙OH和H₂O₂浓度的函数的相应线性校准图。（f，i）HH（10µm）对OH（f）和H₂O₂（i）对其他生物相关物种的选择性，包括1，空白；2，(ClO^{-})； 3，(^{1} O_{2})：4，(O_{2}^{--})；5，NO；6，(ONOO)7，GSH；8，(Fe^{2+})；9(K^{+})10，Cl−；11，∙OH in（f）和H₂O₂)in（i）；均在100µm.（j）提出了HH对∙OH和H₂O₂形成荧光产物HH-1和HH-2的传感机制。

检测羟基自由基和H₂O₂的响应机制

为阐明探针 HH 对 (cdot OH)H₂O₂的响应机制，我们同时采用了实验验证和结构类似物对比策略。起初，∙OH 诱导反应产物的直接分离与结构表征在技术上颇具挑战，这可能是由于 ∙OH 具有高反应活性且性质不稳定。作为替代方案，我们通过相似的反应路径合成了一系列香豆素衍生物（化合物 2-6）（图 S3），并利用 (^{1} H) (^{13} C) 核磁共振波谱对其进行了全面表征（见图 S31-S39）。这些模型化合物与推测的 ∙OH 衍生产物 HH-1 的唯一区别在于 C5 位是否存在取代基——此前有研究表明，该变化对香豆素荧光团的光物理性质影响微乎其微。光谱对比结果显示，在 EtOH/PBS 溶液中经 ∙OH 处理后的 HH，其吸收和发射曲线与化合物 2-6 (v / v=2: 8) (lambda_{abs} ≈438 / 432 ~nm) (lambda_{em} ≈492 / 498 ~nm)（图 S8）几乎一致。这些结果有力支持了图 2j 及图 S4 所示的 ∙OH 触发芳香族羟基化反应，随后发生分子内环化生成 HH-1 的机制。此外，我们还采用高分辨质谱法（HRMS）进一步验证了该响应机制。向 HH 溶液中加入 ∙OH 后，HRMS 检测到质荷比为 585.2862 的离子峰 (m/z)，这与预期产物 HH-1 的质谱结果（计算值为 585.2879，图 S10）相符。

针对H₂O₂这一响应机制，我们成功分离出了用H₂O₂处理HH后生成的氧化产物。紫外-可见吸收光谱和荧光分析结果显示，分离出的产物与化合物HH-2一致，表现为吸收和发射曲线完全重叠（图S9）。此外，高分辨质谱进一步验证了该反应机制，检测到的离子峰与HH-2的理论计算值相符（计算值为363.1608，图S11）。这些对应关系证实了所提出的H₂O₂响应机制，即硼酸酯发生氧化脱保护并随后发生环化反应。以制备一种红色发射的香豆素衍生物。综上，这些研究结果证实探针HH可通过两条正交且明确的化学通路实现对羟基自由基（∙OH）和H₂O₂ 的选择性检测，两种通路各自产生独特的荧光特征，且光谱串扰极小。

双通道细胞成像

受探针HH对H₂O₂和羟基自由基（∙OH）优异的光物理性质与体外选择性的启发，我们接下来评估了其用于活细胞成像的潜力。首先通过MTT分析法在HeLa和SH-SY5Y细胞系中评估了探针HH的细胞毒性。结果显示，在浓度高达50微米的条件下，探针HH几乎未表现出细胞毒性（图S12），证实了其适用于活细胞应用的生物相容性。鉴于其高灵敏度、高选择性和低毒性，我们推测探针HH可实现对细胞内H₂O₂和羟基自由基（∙OH）的双通道成像。本研究选取HeLa和SH-SY5Y细胞作为代表性模型。当仅与5微米的HH共同孵育时，HeLa细胞在绿色通道（480–560纳米）和红色通道（580–650纳米）中均表现出微弱的荧光（图3a A1-A2）。而与H₂O₂或100微米的羟基自由基（∙OH）共同处理后，红色和绿色荧光信号均显著增强（图3a C1-C3和E1-E3），证实了HH对外源性活性氧（ROS）的响应能力。为进一步验证各荧光通道的特异性，我们在活性氧（ROS）刺激前用相应的ROS清除剂对细胞进行预处理。用广谱抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，0.25毫摩尔）预处理可减弱H₂O₂诱导的红色荧光响应（图3a D1-D3），而用羟基自由基清除剂2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO，0.1毫摩尔）预处理则可显著减弱羟基自由基（∙OH）引发的绿色荧光（图3a F1-F3）。这些观察结果与NAC和TEMPO的预期功能完全一致，进一步证实红色和绿色荧光通道可分别特异性地标记f0c0dccf-3ec9-4f9e-8e7b-52ca3f23828a和羟基自由基（∙OH）。此外，用脂多糖（LPS，1微克(mL^{-1}）和佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA，(1 mu g mL^{-1}）刺激后，两个通道的荧光均显著增强（图3a B1-B2），表明氧化应激过程中细胞内f0c0dccf-3ec9-4f9e-8e7b-52ca3f23828a和羟基自由基（∙OH）水平同步升高。在SH-SY5Y神经细胞和斑马鱼中也观察到了一致的结果（图S13和S14），证明HH在不同生物系统中均具备稳定的双通道成像能力。为进一步验证HH的选择性，我们系统评估了其对其他活性氧（ROS）的成像响应（图S15），并利用羟基自由基（∙OH）诱导剂肉桂醛、羟基自由基清除剂甘露醇和二甲基亚砜（DMSO）以及H₂O₂清除剂过氧化氢酶开展了额外的机制对照实验（图S16-S18）。肉桂醛处理可显著增强绿色荧光信号，而红色荧光信号仅轻微升高，表明其可优先产生羟基自由基（∙OH）。相反，用羟基自由基清除剂甘露醇或DMSO预处理可显著减弱绿色荧光，而对红色荧光通道几乎无影响，证实绿色通道的响应主要来源于细胞内的羟基自由基（∙OH）。同样，可选择性清除f0c0dccf-3ec9-4f9e-8e7b-52ca3f23828a的过氧化氢酶可显著降低红色荧光信号，而对绿色通道几乎无影响，验证了红色荧光可特异性标记对应于H₂O₂。总体而言，这些结果表明，两个荧光通道均对各自的活性氧物种具有选择性响应，且相应的清除剂能有效抑制预期通道中的荧光变化，从而证实了 HH 对H₂O₂和 ∙OH 的区分成像具有优异的特异性。

图3 (a,b) 内源性和外源性羟基自由基（∙OH）以及H₂O₂在HeLa细胞中的共聚焦荧光成像。(A1–A3) 细胞与探针HH (5 µm) 孵育30分钟。在其他组中，细胞先用LPS/PMA (1 mu g mL^{-1})(B1–B3)/TEMPO (0.1 mm) (F1–F3) 和NAC (0.25 mm) (D1-D3) 预处理30分钟，再与探针HH (5 µm) 孵育30分钟。细胞先用TEMPO (0.1 mm)/NAC (0.25 mm) 预处理30分钟，随后与探针HH (5 µm) 孵育30分钟，最后与∙OH (100 µm) (E1-E3)/H₂O₂(100 µm) (C1–C3) 孵育30分钟。(c, d) 监测DM-αKG诱导的细胞焦亡中∙OH和(H_{2} O_{2})的生成。(A1–C3) 细胞用15 mm DM-αKG分别预处理0、4或8小时，再与5 µm探针HH孵育30分钟。(D1–F3) 细胞在存在(D1–D3) 50 µm Z-VAD-FMK、(E1–E3) 100 µm CAT或(F1–F3) 100 µm TEMPO的情况下，用15 mm DM-αKG预处理8小时，再与5 µm探针HH孵育30分钟。∙OH的绿色通道：(lambda_{ex}=458~nm)(lambda_{em}=480-560)nm；H₂O₂: lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=580-650 ~nm)的红色通道 比例尺：25 µm。

受其在细胞测定中的表现所鼓舞，我们进一步研究了HH是否能够监测焦亡过程中的活性氧（ROS）动态。我们使用氘代-α-酮戊二酸（DM-αKG）诱导HeLa细胞发生焦亡，此前有报道称该模型可激活焦孔素介导的通路。如图S19和S20所示，DM-αKG诱导出典型的焦亡特征，包括细胞肿胀、膜出泡和破裂，而泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK（50微米）可阻断这些特征，这与此前报道的DM-αKG诱导的焦亡细胞死亡模型一致。我们利用探针HH，同时监测了焦亡过程中细胞内的活性氧和羟基自由基（·OH）水平。与对照组相比，用DM-αKG处理4小时或8小时后，荧光强度呈时间依赖性增加，绿色通道（羟基自由基）分别达到1.7倍和2.6倍，红色通道分别达到1.2倍和2.2倍（图3b、B1-C3及图S21）。为进一步验证这些荧光变化源于焦亡相关的活性氧生成，细胞在进行HH成像前先用Z-VAD-FMK、过氧化氢酶（CAT）或TEMPO进行预处理。Z-VAD-FMK是一种可抑制焦亡的泛半胱天冬酶抑制剂，它能显著降低两个通道的荧光强度，这与抑制焦亡进程时细胞内活性氧生成减少的现象相符。过氧化氢酶可选择性清除H₂O₂，因此主要减弱红色荧光信号；而TEMPO能清除羟基自由基，主要降低绿色荧光信号。这些处理后观察到的荧光变化与各试剂预期的生物学功能高度一致，进一步证实红色通道和绿色通道分别对应H₂O₂和羟基自由基。综上，这些结果表明HH是一种可实时可视化细胞内活性氧动态的有效工具，同时揭示f29e3b6b-e182-4e76-8579-0f0d2b1e093f和羟基自由基的积累均与焦亡进程密切相关。

监测·OH 及 H₂O₂ 动态变化与活细胞癫痫模型中治疗干预的评估

癫痫是一种慢性神经系统疾病，对全球健康构成重大威胁，且其关联性正日益增强与活性氧（ROS）介导的氧化应激相关。尽管已有大量研究，但将活性氧与癫痫发作联系起来的分子机制仍未得到充分阐明，尤其是在癫痫发生过程中H₂O₂与羟基自由基（·OH）之间的相互作用方面。为此，我们采用双功能探针HH，在类癫痫发作条件下对细胞内活性氧的波动进行时空监测，并评估治疗干预措施。

图4  在PTZ诱导的SH-SY5Y细胞癫痫模型中对羟基自由基（∙OH）和H₂O₂的双通道检测。(a) 经不同浓度PTZ处理8小时的细胞，再与5微摩尔浓度的HH共孵育30分钟后，羟基自由基（绿色）和H₂O₂（红色）水平变化的共聚焦荧光图像。比例尺：50微米。(b) 对(a)中处理的细胞进行活性氧（ROS）水平的流式细胞术分析，显示了羟基自由基通道（左侧）和H₂O₂通道（右侧）的对数级荧光强度分布。(c) 细胞经PTZ（0.5毫摩尔，8小时）预处理后，再分别用姜黄素（CUR，30微摩尔）、白藜芦醇（RES，30微摩尔）、苯妥英（PHE，30微摩尔）或γ-氨基丁酸（GAB，1毫摩尔）处理2小时，随后用5微摩尔浓度的HH染色30分钟的代表性共聚焦图像。分别展示并合并了羟基自由基通道（绿色）和H₂O₂通道（红色）的荧光信号。比例尺：50微米。(d) 对(c)图中两个通道的相对荧光强度进行定量分析。数据以对照组为基准进行标准化，以平均值±标准差(n=3)表示。

我们首先通过用戊四氮（PTZ）处理SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞建立了癫痫细胞模型，戊四氮是一种特征明确的GABA受体拮抗剂，已知可诱导神经元过度兴奋。用递增浓度的戊四氮（0、0.1、0.3和0.5毫米）处理细胞8小时，随后用5微摩尔的羟基红花黄色素A（HH）孵育30分钟。如图4a所示，与H₂O₂（红色通道）和羟基自由基（∙OH，绿色通道）相对应的荧光强度随戊四氮浓度的增加而成比例升高。流式细胞术分析证实了这一观察结果（图4b），该分析显示活性氧（ROS）水平呈一致的剂量依赖性升高。这些发现表明，细胞内H₂O₂和羟基自由基的积累与戊四氮诱导的癫痫样损伤密切相关，提示其参与了氧化应激相关的神经元损伤。

为评估氧化应激的治疗性调控，我们接下来探究了代表性神经保护药、抗氧化药和抗癫痫药的作用。先用戊四氮（PTZ，0.5 毫摩尔）预处理 8 小时后，将细胞随后与姜黄素（CUR，30 微摩尔）、白藜芦醇（RES，30 微摩尔）、苯妥英钠（PHE，30 微摩尔）或加巴喷丁（GAB，1 毫摩尔）共同孵育 2 小时，再用 HH（5 微摩尔）进行染色。荧光成像（图4c）及相关半定量分析（图4d）显示，所有药物处理组的H₂O₂与羟基自由基（·OH）水平均显著降低，且不同药物的药效存在程度差异。这些结果表明，受试药物所观察到的抗癫痫作用，部分可归因于活性氧（ROS）的清除或对氧化通路的调控。综上，本实验证明探针 HH 能够实时可视化类癫痫细胞模型中的氧化动态，并提示其可用于识别和评估抗癫痫候选疗法。这些发现进一步证实了氧化应激与类癫痫神经元损伤之间存在密切关联。

图5 (a) 探针HH静脉注射（i.v.）后5、15、30、45、60分钟时，健康小鼠和KA诱导的癫痫小鼠的图像。通过腹腔注射(KA (5 mg kg-1)诱导12小时的癫痫小鼠。以0.25 mg/kg的剂量将探针注射入尾静脉，使用活体成像系统（IVIS）进行光谱成像。(b,c) H₂O₂通道(b)和·OH通道(c)中荧光（FL）强度的相应时间依赖性定量分析。显著差异（通过双尾Student t检验进行，涉及(^{*} p<0.05)、(cdots p<0.01)和(cdots p<0.001）。

动物模型中的实时监测

基于体外细胞成像研究的喜人结果，我们接下来旨在评估探针HH在类癫痫状态下监测H₂O₂和羟基自由基内源性波动的体内适用性。为此，我们建立了两种公认的癫痫模型：由戊四氮（PTZ）诱导的斑马鱼幼虫慢性癫痫模型，以及由红藻氨酸（KA）诱导的小鼠急性癫痫模型。我们选择受精后8天（dpf）的斑马鱼开展成像研究，该发育阶段的斑马鱼神经系统已成熟且光学透明度高。将幼虫与6毫摩尔浓度的PTZ孵育不同时长以诱导慢性癫痫样活动，随后用10微摩尔浓度的探针HH处理30分钟。共聚焦成像结果显示，随着PTZ暴露时间延长，斑马鱼脑部红色通道H₂O₂和绿色通道（羟基自由基）的荧光信号均逐渐增强（图S22），且显著高于未处理的对照组，表明癫痫样状态下活性氧存在动态波动。

为进一步验证探针在哺乳动物系统中的体内性能，我们追踪了KA诱导的癫痫小鼠体内的动态荧光变化。在开展体内荧光实验前，通过尼氏染色验证了小鼠的KA诱导癫痫模型。与对照切片（其中锥体细胞排列紧密、染色深）相比，KA组小鼠的神经元数量显著减少，胞体皱缩、胞质染色浅淡，细胞核固缩（图S23），这与既往报道一致。尼氏染色结果显示KA处理的小鼠出现特征性神经元损伤，证实癫痫模型构建成功。将探针HH静脉注射到健康小鼠和癫痫小鼠体内，并实时在注射后的多个时间点进行了荧光成像。如图5所示，未接受探针的KA模型对照组小鼠的大脑中几乎未检测到荧光信号。探针注射后，正常小鼠大脑中的荧光信号随时间逐渐增强，其中绿色通道（羟基自由基）的信号上升速度更快。相比之下，KA诱导的癫痫小鼠大脑不仅荧光信号出现得更快，荧光强度也显著更高。为更精确地比较癫痫小鼠与正常小鼠大脑中活性氧（ROS）水平的变化趋势，我们进一步通过立体定位仪将探针HH精准注射至小鼠海马体（图S26）。结果显示，KA诱导的癫痫小鼠大脑中两个通道的荧光信号也均显著高于正常小鼠，充分证明癫痫发作期间大脑中的H₂O₂与羟基自由基水平显著升高。完成活体成像后，我们收集小鼠的大脑及主要器官进行离体成像和组织学分析，以确定探针的荧光分布、信号的真实来源以及探针的生物安全性。大脑及主要器官的离体成像结果（图S25）表明，该探针具有一定的血脑屏障穿透性，且离体荧光信号与活体观察结果一致，证实了大脑荧光信号的真实性和可靠性。此外，对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行的苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，健康小鼠和KA诱导的癫痫模型小鼠在注射探针HH后均未出现组织损伤或炎性病变，表明该探针具有良好的生物相容性（图S24）。

这些体内研究结果与我们的细胞观察结果一致，并证实了探针 HH 能够在慢性和急性癫痫模型中灵敏且选择性地检测活性氧的动态变化。此外，独特的时间H₂O₂与羟基自由基的相关特征，可为理解癫痫样发作过程中氧化应激相关的变化提供有价值的信息。总体而言，探针HH展现出优异的体内成像性能，有望作为监测活性氧动态、评估癫痫及其他氧化还原相关神经系统疾病中氧化应激相关治疗反应的工具。

结论

我们开发了一种双响应荧光探针HH，可在复杂生物系统中同时选择性检测H₂O₂和·OH。该分子设计利用独特的芳香族羟基化机制实现对·OH的识别，利用硼酸酯基团实现对H₂O₂的识别，并结合氰基的位点特异性环化反应，产生两种不同的荧光信号。所得探针展现出优异的光学性能、高选择性和灵敏度以及低细胞毒性，可对活细胞和体内模型中的活性氧进行可靠的实时成像。得益于这一结构设计，HH具有良好的光物理性质、优异的选择性和灵敏度以及极低的细胞毒性，能够对活细胞和体内系统中的活性氧进行稳定的实时监测。

探针HH已成功用于监测焦亡介导的细胞焦亡过程中H₂O₂和羟基自由基的动态变化，揭示了活性氧积累与细胞焦亡严重程度之间存在强烈相关性。此外，HH实现了在癫痫样细胞和动物模型（包括戊四氮诱导的斑马鱼模型和红藻氨酸诱导的小鼠模型）中对H₂O₂和羟基自由基的双通道成像。据我们所知，目前鲜有荧光探针被报道可在癫痫相关模型中对H₂O₂和羟基自由基进行双通道成像。这些发现证实了氧化应激参与癫痫相关病理过程，并表明HH是探究氧化还原相关分子过程的有效工具。此外，HH在评估候选抗癫痫药物的抗氧化效果方面展现出应用潜力，说明其适用于治疗筛选相关研究。综上，本研究不仅为探究神经系统疾病中活性氧的动态变化提供了一种通用的成像策略，也为进一步研究H₂O₂和羟基自由基在炎症、神经退行性变及治疗干预中的广泛作用开辟了新方向。

实验部分

基本信息与方法：所用化学试剂均购自阿拉丁（中国上海），未经进一步纯化直接使用。所用溶剂均经标准方法纯化后使用。所有实验均使用超纯水（18.25 MΩ·cm，由Aquapro超纯水纯化系统制备）。所有反应均在磁力搅拌下进行，通过薄层色谱法（TLC）监测。柱层析采用200–300目硅胶柱进行。紫外-可见吸收光谱通过岛津UV-2600i分光光度计（日本岛津公司）测定。荧光光谱在日立F-7100分光光度计（日本日立有限公司）上记录，使用1 cm标准石英比色皿（光电倍增管电压700 V；扫描速度1200 nm/min；延迟时间0 s；响应时间2 s）。溶液的荧光成像通过ZF-20D型紫外分析仪（上海）的365 nm紫外灯激发。中国）。这些视觉图片由智能手机内置摄像头拍摄。(^{1} H) 核磁共振谱和 (^{13} C) 核磁共振谱以四甲基硅烷（TMS）为内标，在布鲁克（BRUKER）AVANCE-500 型光谱仪上测得，化学位移（δ）以百万分比（ppm）表示，耦合常数 ((J)) 以赫兹（Hertz）为单位。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱在岛津（Nippon-Shimadzu）IR Tracer 100 型傅里叶变换红外光谱仪上采集（溴化钾压片法）。高分辨质谱分析采用安捷伦（Agilent）1290/6545 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF/MS）系统完成。流式细胞术分析在赛泰克（Cytek，中国）DxP AthenaTM V2-B4-R2 型流式细胞仪上进行。所有细胞和斑马鱼成像实验均在徕卡（Leica）SP8 型荧光共聚焦显微镜系统（德国）上完成。体内成像实验采用 IVIS 成像系统进行。

探针HH的合成：向化合物4（0.2克，657.15微摩尔）在乙腈（15毫升）中的溶液中加入2-(4-(溴甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷（0.585克，1.97毫摩尔）。随后加入(K_{2} CO_{3})（0.182克，1.31毫摩尔）。将反应混合物在95摄氏度下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物真空干燥，粗产物直接用于下一步骤，无需纯化。将所得残留物溶解于乙醇（15毫升）中，向其中加入丙二腈（0.023克，307微摩尔）。将反应在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物真空干燥，粗产物经硅胶柱色谱纯化，得到探针HH（45毫克，产率12%）(^{1} H) 核磁共振氢谱（500兆赫兹，(CDCl_{3}) δ：8.05（单峰，1H），7.86（双峰，(J=7.9 ~Hz) 2H），7.44（单峰，1H），7.40（双峰，(J=7.8 ~Hz)，2H），5.82（单峰，1H），5.13（单峰，2H），3.70（单峰，4H），3.67–3.61（多重峰，1H），3.60–3.54（多重峰，2H），3.43（三重峰，(J=9.9 ~Hz) 1H），3.28（多重峰，(J=10.2) 7.6赫兹，1H），2.82–2.74（多重峰，2H），2.63（多重峰，(J=16.6) 5.5赫兹，1H），2.16–2.15（多重峰，(J=11.2) 6.1、5.6赫兹，2H），2.05–1.98（多重峰，1H），1.51–1.44（多重峰，1H），1.38（单峰，12H）。(^{13} C) 核磁共振碳谱（126兆赫兹，(CDCl_{3}) δ：172.98、156.17、149.74、144.13、139.16、135.24、127.35、126.58、117.78、116.91、109.58、106.72、93.40、83.95、70.89、66.32、57.78、52.21、51.75、47.31、47.23、31.08、29.89、24.89、23.17。红外光谱（溴化钾压片，(cm^{-1}）：3446.06、2976.05、2203.63、1734.18、1612.03、1563.62、1541.05、1511.26、1488.09、1406.97、1357.57、1388.86、1298.90（方案S2，所有中间体和最终产物均通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、红外光谱和高分辨质谱进行了全面表征，见图S27–S30和S41–S43）。

细胞培养：HeLa细胞和SH-SY5Y细胞购自中国典型培养物保藏中心（中国武汉）。将HeLa细胞和SH-SY5Y细胞置于含10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS，美国纽约州格兰德岛市Gibco BRL公司）、1%链霉素-青霉素(10000 mu g mL^{-1})和(10000 U mL^{-1})的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37℃、5%(CO_{2})、95%空气的湿润培养箱中培养。

活细胞内源性和外源性羟自由基（∙OH）以及H₂O₂的成像：为对内源性和外源性羟自由基（∙OH）以及H₂O₂进行荧光成像，将HeLa细胞和SH-SY5Y细胞置于含0.5%（体积分数）二甲基亚砜（DMSO）的无血清杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。对于活性氧（ROS）内源性成像，将细胞与探针HH（5微摩尔）孵育30分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，然后直接进行共聚焦成像。对于活性氧（ROS）外源性成像，先将细胞用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物（TEMPO，0.1毫摩尔）或N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理0.25 毫米）处理30分钟，随后与5微摩尔的HH共同孵育30分钟。接着，加入外源性羟自由基或H₂O₂（100微摩尔），继续孵育30分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤三次后，对细胞进行荧光成像。为监测内活性氧的生成，用脂多糖(LPS, 1 mu g mL^{-1})和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA，(1 mu g mL^{-1}）刺激细胞30分钟，以诱导细胞内活性氧的产生。在活性氧清除实验中，先用0.1毫摩尔的TEMPO或0.25毫摩尔的N-乙酰半胱氨酸预处理细胞30分钟，再与5微摩尔的HH共同孵育30分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤三次后，获取荧光图像。通过荧光共聚焦显微镜（德国蔡司LSM 880）对细胞进行成像。所有实验均重复三次。（绿色通道对应(lambda_{ex}=458 ~nm)、(lambda_{em}=480-560 nn)；红色通道对应(lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=580-650 ~nm）

焦亡过程中细胞内羟基自由基与H₂O₂的变化监测

用15/20毫摩尔的α-酮戊二酸二甲酯（DM-αKG）处理HeLa细胞适宜时间以诱导细胞焦亡。随后移除培养基，用无血清培养基洗涤细胞，再用5微摩尔探针孵育30分钟。为抑制细胞焦亡，在50微摩尔Z-VAD-FMK、100微摩尔TEMPO或100微摩尔过氧化氢酶存在的情况下，用15毫摩尔α-酮戊二酸二甲酯孵育细胞。使用荧光共聚焦显微镜进行荧光成像。（绿色通道对应(lambda_{ex}=458 ~nm)、(lambda_{em}=480-560 ~nm)；红色通道对应(lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=)，波长范围580–650纳米。）

PTZ 诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤模型中 ∙OH 与 H₂O₂的可视化分析

用0.1、0.3和0.5毫摩尔的戊四氮（PTZ）处理SH-SY5Y细胞8小时，以诱导细胞损伤。细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次后，与5微摩尔的探针孵育30分钟。使用荧光共聚焦显微镜进行荧光成像。（绿色通道：(lambda_{ex}=458 ~nm)、(lambda_{em}=480-560) 纳米；红色通道：(lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=580-650 ~nm）

流式细胞术分析

采用流式细胞术检测 ∙OH 以及 H₂O₂，使用探针 HH 进行实验。将细胞接种于六孔板中，每孔接种 (≈2.0 ×10^{5}) 个细胞，随后按照细胞成像实验的方法处理（图4a）。处理完成后，洗涤细胞，用胰酶-EDTA 溶液消化，重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过流式细胞术进行分析。收集通道：Comp-V5-A：(lambda_{ex}=405 ~nm)、(lambda_{em}=498-518 ~nm)；Comp-B6-A：(lambda_{ex}=488 ~nm)、(lambda_{em}=606-630 ~nm)

斑马鱼中内源性与外源性羟基自由基及H₂O₂的成像

我们感谢湖南师范大学生命科学学院斑马鱼遗传学实验室的邓云教授（长沙），感谢中国提供正常斑马鱼和癫痫模型斑马鱼。所有动物实验均按照相关指南进行，并经动物伦理委员会批准（湖南师范大学，编号2022-161）。为检测活体斑马鱼中的内源性羟基自由基（∙OH）和H₂O₂，制备了8日龄的斑马鱼。将斑马鱼与探针HH（10微米）在含0.5%二甲基亚砜（体积比）的E3培养液中孵育30分钟，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次后进行成像。为检测外源性羟基自由基，斑马鱼分别用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物（TEMPO，羟基自由基清除剂，0.1毫摩尔）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，活性氧清除剂，0.25毫摩尔）预处理30分钟，随后与探针HH（10微米，孵育30分钟）孵育，再与羟基自由基和H₂O₂（100微米，30分钟）孵育，最后用磷酸盐缓冲液洗涤三次。使用荧光共聚焦显微镜（德国蔡司LSM 880）对斑马鱼进行成像。所有实验均重复三次。（绿色通道对应(lambda_{ex}=458 ~nm)、(lambda_{em}=480-560 ~nm)；红色通道对应(lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=580-650 ~nm）。

癫痫模型斑马鱼成像

我们选取受精后8天（dpf）神经系统发育完善的斑马鱼，将其与戊四氮（PTZ，6 mmol/L）共同孵育以诱导癫痫模型。对照组将8日龄斑马鱼与探针（10 µmol/L）共同孵育30分钟，经PBS缓冲液洗涤后进行成像。为监测癫痫状态下斑马鱼体内羟基自由基（·OH）和H₂O₂的波动情况，我们用6 mmol/L的PTZ诱导斑马鱼癫痫3、6、12小时，随后与探针共同孵育30分钟，经PBS缓冲液洗涤后进行成像。使用荧光共聚焦显微镜（德国蔡司LSM 880）对斑马鱼进行成像。所有实验均重复三次。(lambda_{ex}=458 ~nm)、(lambda_{em}=480-560 ~nm) 对应绿色通道；(lambda_{ex}=476 ~nm)、(lambda_{em}=580-650 ~nm) 对应红通道）。

正常小鼠与癫痫模型小鼠中羟自由基及H₂O₂的成像检测

五周龄雌性BALB/c裸鼠（平均体重18±2克，每组(n=6)只）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有动物实验均经湖南师范大学动物伦理委员会批准，并按照相关指南（编号2022-161）进行。通过腹腔注射海人酸（KA，(5 mg kg^{-1}）诱导癫痫模型，对小鼠进行12小时观察。以Racine评分达到(score ≥4)或出现典型癫痫行为（前肢阵挛、全身强直-阵挛性发作）作为癫痫模型成功建立的判定标准。正常对照组注射等体积生理盐水。在尾静脉注射探针(0.25 mg kg^{-1})后5、15、30、45和60分钟，使用IVIS Spectrum成像系统（中南大学湘雅三医院）进行荧光成像。（红色通道：激发滤光片465纳米，发射滤光片600纳米；绿色通道：激发滤光片465纳米，发射滤光片520纳米）。成像结束后，对小鼠实施安乐死，采集脑、心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行离体荧光检测。成像。显著差异（p<0.05、cdots p<0.01、cdots p<0.001）通过双尾Student t检验进行分析。