标题：Changes in microtubule stability in zebrafish (Danio rerio) embryos after glyphosate exposure

期刊：cellpress

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e06027

摘要

草甘膦是全球使用最广泛的农药，它能阻断芳香族氨基酸的生物合成途径，抑制植物生长。尽管草甘膦在动物体内的具体作用机制尚不明确，但已有研究报道其会对胚胎发育产生不良影响，包括外包延迟、形态改变，以及中枢神经系统发育和心脏发生过程的变化。本研究提出，该除草剂可能存在一种与微管稳定性变化相关的毒性机制，而这一变化可能会改变细胞骨架组分的分布与动态。通过利用斑马鱼胚胎评估草甘膦暴露（5、10和50微克/毫升）的体内效应，研究人员发现，暴露于10和50微克/毫升草甘膦的斑马鱼胚胎中，乙酰化α-微管蛋白的水平（50微克/毫升组）以及聚合态微管蛋白的占比均显著降低，而α-微管蛋白的表达模式和肌动蛋白丝的稳定性均未发生变化。这些结果表明，高浓度草甘膦与乙酰化α-微管蛋白水平降低及微管稳定性改变相关，这或许能解释该除草剂所引发的部分神经毒性和心脏毒性效应。

引言

微管是由(alpha, beta) -微管蛋白异二聚体构成的聚合结构，是细胞骨架的重要组成部分。它们在细胞形态维持、细胞内运输、细胞运动和细胞分裂等众多过程中发挥重要作用。微管持续进行组装与解聚，其动态过程受到多种细胞因子的高度调控，这些细胞因子可与微管结构相互作用并影响其稳定性。微管相关蛋白（MAPs），如MAP2、MAP4和Tau，是调节微管稳定性的关键因子。这些蛋白的激活与调控依赖于多种丝氨酸/苏氨酸激酶，例如钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）]，该激酶在钙调蛋白的激活中起关键作用，而钙调蛋白作为一种钙结合蛋白，可通过钙-钙调蛋白诱导的机制参与微管的快速解聚。微管稳定的另一关键因子是Wnt信号通路，该通路与细胞迁移、细胞极化和神经突生长密切相关。Wnt信号通路可通过激活或抑制作用直接调控微管稳定性。Gsk3是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与Tau蛋白及其他微管相关蛋白的磷酸化，这会导致tau蛋白病和微管解聚。

草甘膦（N-膦酰甲基甘氨酸）是一种广谱除草剂，它能特异性抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSP），这是光合生物合成芳香族氨基酸所需的关键酶。尽管后口动物体内不存在草甘膦的作用靶点，且草甘膦的急性毒性较低，但多项研究表明，该化合物及其多种商用制剂会产生毒性效应，包括在发育过程中改变内分泌系统、破坏抗氧化防御系统、诱导形态学缺陷、影响心脏发育以及对中枢神经系统造成结构和功能上的改变。

草甘膦改变细胞内钙动态的能力与细胞结构的变化、细胞骨架成分的分布有关，也与细胞黏附、细胞形态的变化以及微管和微管相关蛋白的组织与分布差异相关。例如，在卵母细胞中，接触草甘膦研究发现，浓度低于100微摩尔的草甘膦会改变无色纺锤体的结构，而浓度超过100微摩尔时，会导致有丝分裂纺锤体中的微管显著减少，这表明细胞骨架和微管组织中心的组成部分受到了影响]。同样，研究表明草甘膦暴露还会影响神经元细胞骨架稳定性的调控机制，这与CaMKIIA、CaMKIIB、Wnt3a、Wnt5a以及III类微管蛋白（TUBB3）的表达模式变化相关。此外，研究发现草甘膦类除草剂（GBH）暴露会改变与微管稳定性相关的蛋白质水平，例如MAP蛋白S100B，该蛋白参与了(Ca^{2+})依赖性的微管解聚调控。尽管已有证据表明细胞骨架会发生变化，但草甘膦相互作用影响细胞骨架组分分布与动态的机制仍不明确。

结果

草甘膦暴露降低斑马鱼胚胎中α-微管蛋白的乙酰化水平

对斑马鱼全胚胎提取物的分析表明，草甘膦暴露会导致乙酰化α-微管蛋白水平降低，且50微克/毫升处理组与对照组之间存在显著差异（图1 (p<0.05) 0.05）。高达50微克/毫升的草甘膦暴露并未引起总α-微管蛋白水平模式的变化（图1B）。

图1. 草甘膦暴露降低斑马鱼胚胎中α-微管蛋白的乙酰化水平。(A) 用乙酰化α-微管蛋白抗体检测斑马鱼胚胎全蛋白提取物的免疫印迹图。对α-Tub AC/总α-Tub比值的定量分析显示，暴露于草甘膦（50 μg/ml）的胚胎中乙酰化α-微管蛋白水平显著低于对照组。(B) 用α-微管蛋白抗体检测胚胎全蛋白提取物的免疫印迹图。相对于对照组的定量分析表明，草甘膦暴露后，各处理组全胚胎提取物中α-微管蛋白的表达水平均无显著变化。蛋白质免疫印迹的原始图片作为补充材料提供：(A) 图_S1A_alphaTubAC.jpg 和图_S1A_alphaTub.jpg；(B) 图_S1B_alphaTub.jpg 和图_S1B_GAPDH.jpg。

草甘膦暴露诱导微管不稳定性

为确定草甘膦暴露对微管稳定性的影响，我们开展了体内微管沉淀实验，并通过蛋白质印迹法分析了α-微管蛋白的分布。对暴露于草甘膦的斑马鱼胚胎中聚合态与可溶性微管蛋白比例的分析（图2A）显示，聚合组分（P）中的α-微管蛋白水平有所降低，且对照组与10和50微克/毫升处理组的α-微管蛋白水平存在显著差异（0.05）。聚合态微管蛋白比例的这一变化伴随着非聚合级分（SN）中α-微管蛋白水平的升高，且对照组与10和50微克/毫升处理组之间的α-微管蛋白水平存在显著差异（((p<0.05)) 0.05）。同样，在所有草甘膦暴露组的沉淀部分（P）中，均观察到乙酰化α-微管蛋白水平的降低（图2B）。然而，该降低仅在50微克/毫升草甘膦处理组中具有显著性（((p<0.05))）。有趣的是，乙酰化α-微管蛋白出现显著升高在暴露于相同草甘膦浓度的胚胎的SN组分中观察到了水平变化（((p<0.05))

图2. 草甘膦对微管富集组分（P）与非聚合组分（SN）之间微管稳定性的影响。（A）抗α-微管蛋白抗体的蛋白质印迹分析。对聚合型和非聚合型微管蛋白占总微管蛋白（聚合型+可溶性二聚体）百分比的定量分析表明，在10或50 μg/ml草甘膦处理的胚胎中，聚合型微管蛋白的百分比均显著低于对照组（((p<) 0.05）。（B）抗乙酰化α-微管蛋白抗体的蛋白质印迹分析。定量分析显示，50 μg/ml草甘膦处理的胚胎中，聚合组分（P）内乙酰化α-微管蛋白的百分比显著低于对照组（((p<0.05)) 0.05）。蛋白质印迹的原始图像作为补充材料提供：（A）Fig_S2A_alphaTub.jpg；（B）Fig_S2B_alphaTubAC.jpg。

草甘膦暴露似乎不影响肌动蛋白丝的稳定性

所有处理组的胚胎中肌动蛋白水平均未观察到变化（图3A）。此外，肌动蛋白丝稳定性分析也未在任何处理条件下，P 组分与 SN 组分之间的肌动蛋白分布均未显示出任何变化（图 3B）（参见图 4）。

图3 草甘膦暴露不影响斑马鱼胚胎中P组分与可溶性组分（SN）之间肌动蛋白的分配分析，结果显示，与对照组相比，所有草甘膦暴露组中肌动蛋白在P组分和SN组分中的占比均未发生显著变化。(A) 蛋白免疫印迹分析肌动蛋白丝的稳定性。 (B) 针对肌动蛋白抗体的蛋白免疫印迹分析。相对于对照组的定量分析表明，草甘膦暴露后，所有实验组全胚胎提取物中的肌动蛋白水平均未发生显著变化。蛋白免疫印迹的原始图片已作为补充材料提供：(A) Fig_S3A_Act.jpg；(B) Fig_S3B_Act.jpg 及 Fig_S3B_GAPDH.jpg。

图4. 通过改变微管稳定性来影响细胞骨架，表明草甘膦能够改变肌动蛋白丝稳定性的功能，同时不会产生明显的乙酰化α-微管蛋白，还会导致斑马鱼胚胎发育过程中草甘膦暴露使微管相关蛋白（MAPs）水平降低，微管稳定性丧失。微管相关蛋白的变化涉及翻译后修饰（α-微管蛋白乙酰化），而微管动态平衡由多种机制维持，这些机制对发育过程至关重要，且这些动态与微管稳定性相关。

讨论

所有暴露的胚胎均正常发育，未出现身体畸形、脊柱弯曲、心包水肿或卵黄囊水肿等形态学异常。此前已有研究发现这些形态学异常的发生率会升高，尤其是在暴露于100毫克/升草甘膦的胚胎中。多项研究表明，在多种模型中暴露于草甘膦可诱导细胞结构和细胞骨架成分分布发生变化。在斑马鱼胚胎中，研究显示草甘膦暴露除了会影响胚胎的运动能力、心脏发育以及神经系统成分的形成和功能外，还会导致胚胎早期发育过程中的外包延迟，这表明细胞骨架的修饰可能与草甘膦的毒性机制有关。

在本研究中，所有浓度草甘膦暴露下斑马鱼胚胎中乙酰化α-微管蛋白水平的变化表明，该除草剂的暴露会诱导微管稳定性发生改变。对乙酰化微管的体内评估显示，与非乙酰化微管相比，乙酰化微管对温和低温、诺考达唑或秋水仙碱处理的耐受性更强，这表明微管稳定性与α-微管蛋白的乙酰化相关。同样，多项研究表明，α-微管蛋白中K40乙酰化水平降低会导致与亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和帕金森病相关的轴突运输缺陷。已知微管稳定性由多种细胞内机制介导，其中Wnt5a信号通路通过散乱蛋白2（Dvl2）在细胞分裂过程中对微管稳定起到关键作用，该通路与神经元中的轴突微管相关，并在细胞迁移、细胞极性和轴突重塑等过程中调控微管稳定性。值得注意的是，有研究观察到，4 mg/ml浓度的草甘膦暴露海马神经元后，Wnt5a的表达和CaMKII的活性均降低，同时新生轴突中的微管发生重新分布，Tau蛋白的定位也发生改变。这表明Wnt信号通路相关组分的表达变化可能参与了草甘膦诱导的本研究体内微管沉淀实验中观察到的微管不稳定性。

负责调节微管蛋白去乙酰化的酶是组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6），它是组蛋白去乙酰化酶家族的一员。该酶不仅参与组蛋白的乙酰化与去乙酰化过程，还以α-微管蛋白、热休克蛋白90（HSP90）等多种非组蛋白为作用底物，同时参与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭及有丝分裂等多个生理过程。研究发现，HDAC6的表达可能受雌激素信号通路调控——乳腺癌MCF-7细胞中雌激素受体的激活会诱导HDAC6过表达，这表明HDAC6是雌激素调控的基因。这一发现颇具研究价值，因为有研究表明，在雌激素依赖性癌细胞中暴露于草甘膦，可通过雌激素受体ERα和ERβ诱导雌激素反应元件（ERE）的激活。草甘膦的雌激素活性与雌激素受体调控HDAC6表达之间的这种关联，或许能解释为何暴露于草甘膦的斑马鱼胚胎中，乙酰化α-微管蛋白的水平会下降。

更多证据表明，草甘膦对神经系统发育的部分影响可能与微管稳定性的变化有关。例如，将神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 暴露于草甘膦（5 毫摩尔）和草甘膦的主要降解产物之一氨甲基膦酸（AMPA；10 毫摩尔）下，会上调 CaMKIIA、CaMKIIB 以及 Wnt 蛋白 Wnt3a、Wnt5a 和 Wnt7a 的表达。CaMKII 是一种受钙-钙调蛋白复合物调控的丝氨酸/苏氨酸激酶，它在激活 MAP2 和 Tau 蛋白（分别是轴突和树突中微管动态的关键调节因子）的过程中发挥关键作用。研究发现，暴露于 1% 浓度的草甘膦制剂（对应 0.36% 的草甘膦）会直接改变 S100B 的水平]，S100B 是一种 (Ca^{2+}) 结合蛋白，在神经系统发育过程中参与微管稳定性的调节。值得注意的是，这些蛋白的调节在神经系统发育阶段尤为重要，而神经系统发育需要对微管稳定性进行精准调控。

也有研究表明，斑马鱼胚胎暴露于草甘膦（浓度为50和100微克/毫升）可诱导L型钙通道基因（Cacana1C）和雷诺碱受体基因（ryr2a）的选择性下调。此外，还发现浓度为0.036克/升的草甘膦及其商用制剂农达均能激活支持细胞中的多种应激反应通路，通过开放L型电压依赖性钙通道以及内质网IP3受体和雷诺碱受体，提高细胞内钙浓度，导致细胞内钙超载。同样，在大鼠海马体中，研究发现急性暴露于草甘膦制剂（对应0.38%草甘膦）会增强N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和电压依赖性钙通道的活性，进而导致钙内流并激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和细胞外信号调节激酶（ERK）。这表明本研究中观察到的微管稳定性变化可能与细胞内钙水平的变化以及CaMKII的活性相关。从这个角度来看，已有研究表明，在高浓度钙存在的情况下，微管可通过钙-钙调蛋白活性诱导的微管解聚机制，快速解聚为其亚基。

有趣的是，在任何草甘膦处理组中，均未观察到完整胚胎提取物中肌动蛋白水平的变化，也未发现聚合级分中肌动蛋白占比出现变化，这与赫德伯格等人的研究结果形成对比。后者发现，在暴露于草甘膦（0.5–5毫摩尔）的非洲爪蟾黑素细胞中，草甘膦和农达均会抑制黑素小体运输，并改变细胞骨架形态以及肌动蛋白丝的分布，而这一现象被认为与草甘膦诱导的pH值变化相关。进一步的证据表明，肌动蛋白的动态变化可能通过调节细胞内肌动蛋白聚合过程以及肌动蛋白相关蛋白的功能，对pH值变化敏感。然而，在本实验中，EM缓冲液抵消了草甘膦对pH值的影响。在排除pH值的影响后，本研究结果表明，在多种动物模型的细胞骨架中观察到的相关效应]，可能是以非pH依赖的方式与微管稳定性的变化相关联。这与亚福菲等人的研究结果一致，他们在pH值受控的培养基中观察到卵母细胞退化，通过免疫荧光技术发现微管组织中心发生改变，且纺锤体纤维的微管出现缩短。

草甘膦暴露的胚胎聚合级分中微管乙酰化水平显著降低，这既可能与HDAC6的变化有关，也可能与经典Wnt信号通路功能的改变有关。有研究表明，经典Wnt通路直接受HDAC6表达的调控，因为已有研究观察到组蛋白去乙酰化酶6可直接调控Wnt/β-连环蛋白信号通路中的β-连环蛋白水平。值得注意的是，对孕期和哺乳期暴露于草甘膦的小鼠前额叶皮层进行的分析显示，与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的蛋白表达模式存在异常，而该信号通路通过细胞周期蛋白依赖性激酶11（CDK11）参与微管稳定性的调节。同样，微管乙酰化的另一关键组分——α-微管蛋白N-乙酰转移酶1（αTAT1），是脊椎动物中主要的α-微管蛋白乙酰转移酶，它可通过调控β-连环蛋白向质膜和细胞核的定位，介导Wnt/β-连环蛋白信号通路，这表明微管乙酰化与Wnt/β-连环蛋白通路的功能之间存在关联，而这种关联涉及微管的稳定性。

综上所述，我们已确定斑马鱼胚胎发育过程中暴露于草甘膦会导致乙酰化α-微管蛋白水平发生变化，进而引起微管不稳定，同时不会使α-微管蛋白的相对表达量出现明显变化，这可能是由于其对Wnt信号通路的影响以及钙动态的改变所致。

材料与方法

鱼的饲养与胚胎制备

野生型成年斑马鱼（斑马鱼）购自一家商业宠物店，并按照《斑马鱼手册》的指导方针饲养[24]。通过大规模交配产生斑马鱼胚胎，将发育至16细胞期的胚胎置于含有斑马鱼胚胎培养基（EM缓冲液；15 mM氯化钠、0.5 mM氯化钾、1 mM氯化钙、1 mM氯化镁、0.15 mM硫酸钾、0.05 mM碳酸氢钠和0.7 mM HEPES，pH值7.0±0.2）的培养皿中，用于后续实验。所有实验程序均经批准，并符合CIAD（食品与发展研究中心，A.C.）机构动物护理与使用委员会的伦理标准。

草甘膦暴露

将斑马鱼胚胎装入6孔板（每孔10个胚胎），并暴露于草甘膦（CAS编号1071-83-6；美国圣路易斯市SigmaAldrich公司）中，草甘膦重悬于EM缓冲液中，设置5、10或50μg/ml三种浓度。每个处理组中，向每孔加入5毫升该溶液，随后将培养板置于28.5℃条件下培养。对照组采用不含草甘膦的EM缓冲液处理。暴露期从原肠胚50%外包期开始，至受精后96小时（hpf）结束。在受精后96小时内，每24小时评估一次存活率和孵化率。每个处理组均进行四次重复实验。

微管富集组分（P）的分离

按照Bershadsky等人[25]和Gomez de Leon等人[26]的方法，提取微管富集组分（P）。简要来说，将96小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎用MS-222（三卡因，Sigma-Aldrich公司产品）麻醉，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。随后，使用PHEM缓冲液（100 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 6.9；10 mM 乙二醇双四乙酸，pH 7.0；1 mM）中的 Triton X-100（Sigma-Aldrich公司产品）对胚胎进行裂解。氯化镁，以及添加了蛋白酶抑制剂混合物的0.5% Triton X-100），并在4摄氏度下以30,000倍重力离心45分钟。沉淀部分（对应不溶性微管富集组分，记为P）用不含Triton X-100的PHEM溶液洗涤，随后以15,000倍重力离心10分钟。非聚合组分中的可溶性蛋白（上清液，记为SN）在-20摄氏度下用异丙醇沉淀过夜，再以15,000倍重力离心15分钟。将两种组分均重悬于裂解缓冲液（含2%β-巯基乙醇、1%十二烷基硫酸钠、20毫摩尔乙二醇双四乙酸、2毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH值7.5，并添加蛋白酶抑制剂混合物）中，冷冻保存至使用。制备全胚胎提取物时，将胚胎在裂解缓冲液存在下匀浆。裂解液在4摄氏度下以6,000倍重力离心10分钟，收集上清液。采用考马斯亮蓝试剂（美国加利福尼亚州伯乐实验室公司）测定总蛋白浓度。

蛋白质印迹法

蛋白样品（每个泳道50微克）在还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE；10%凝胶）进行分离，并转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜用6%牛奶进行封闭，与相应的一抗孵育后，再与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育。使用ChemiDoc XRS系统（美国加利福尼亚州伯乐实验室公司）结合Image Lab软件（伯乐公司）通过化学发光法进行检测。数据分析采用R语言3.6.3版本进行。采用单因素方差分析（ANOVA）和事后图基多重比较检验，评估草甘膦处理组与对照组之间蛋白水平的显著差异。(P-values ≤0.05) 0.05被认为具有统计学显著性。结果以均值和标准差绘制呈现。

抗体

肌动蛋白一抗（SC-8432）购自美国圣克鲁斯生物技术公司。抗α微管蛋白抗体（T6199）购自西格玛-奥尔德里奇公司，抗GAPDH抗体（MA5-15738）和抗乙酰化α微管蛋白（Lys40）抗体（32-2700）购自美国赛默飞世尔科技公司（美国圣何塞）。辣根过氧化物酶标记的二抗和山羊抗兔免疫球蛋白G（NB7160）购自美国诺沃斯生物科技公司（美国利特尔顿），山羊抗小鼠免疫球蛋白G（A-10677）购自赛默飞世尔科技公司。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。